Stretching cellules Micropatterned sur une membrane PDMS

L'objectif général de cette procédure est d'étirer des cellules disposées selon un motif sur une membrane élastique en polydiméthylsiloxane ou PDMS. Cela est réalisé en tendant une feuille de PDMS, puis en appliquant un motif microscopique sur le PDMS. La feuille de PDMS munie du motif microscopique est ensuite fixée sur le dispositif d'étirement et une cuve de rétention de milieu est placée par-dessus.

Ensuite, les cellules sont ensemencées à la surface de la feuille de PDMS microstructurée et laissées s'attacher au motif avant un lavage destiné à éliminer les cellules non attachées. L'étape finale consiste à appliquer une élongation sur le PDMS contenant les cellules afin de les étirer. En fin de compte, la microscopie vidéo est utilisée pour montrer que l'application de forces sur les fibres de rétraction des cellules mitotiques de mammifères lors de l'étirement cellulaire entraîne une déformation de la cellule.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biomécanique, telles que quels sont les effets des forces externes sur des processus cellulaires comme la division ? Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons voulu appliquer des forces sur une cellule en division afin de commencer à découper un morceau de PDMS d'environ 35 par 20 millimètres à partir d'une feuille préfabriquée. Ici, une feuille mince de PDMS disponible dans le commerce est utilisée car elle est plus reproductible et moins susceptible de se rompre par rapport au PDMS fabriqué sur mesure.

Retirez les couches protectrices en plastique supérieure et inférieure et utilisez des pinces pour placer le PDMS dans une boîte de Pétri en plastique. Lavez ensuite le PDMS avec de l'éthanol à 70 % pendant cinq minutes sur un agitateur rotatif à 30 oscillations par minute. Après le lavage, séchez la surface en faisant passer de l'air dessus.

Ensuite, exposez le PDMS à la lumière ultraviolette profonde pendant cinq minutes, à une distance d'environ cinq centimètres des lampes ultraviolettes. Pendant ce temps, préparez une solution E-D-C-N-H-S comme décrit dans le protocole écrit. La solution doit être préparée juste avant utilisation, car sa réactivité diminue en quelques heures.

Transférez les feuilles de PDMS depuis la boîte de Pétri vers le couvercle de la boîte de Pétri, qui n’a pas été exposé à la lumière. Cela garantira que l’environnement du PDMS soit très hydrophobe et facilitera l’étape suivante.

Appliquez la solution E-D-C-N-H-S sur le PDMS à l’aide d’une pipette et incubez pendant 15 minutes à température ambiante. Après l'incubation, rincez l'excès de E-D-C-N-H-S à l’eau.

Ensuite, ajoutez la solution de PEG greffé sur le PLL et incubez de trois heures à toute la nuit à température ambiante. Après l'incubation, rincez l'excès de PEG greffé sur le PLL du PDMS à l'eau. Le PDMS est désormais passivé ou fonctionnalisé avec le PEG greffé sur le PLL et peut être conservé plusieurs jours à quatre degrés Celsius. Pour structurer le PDMS, placez la feuille de P-D-M-S sur un masque photo en quartz synthétique portant les microstructures destinées à la structuration.

Placer le côté PDMS portant le PEG greffé au PLL face au côté chrome du masque photolithographique. Ensuite, illuminer pendant sept minutes à travers le masque photolithographique, à une distance d'environ cinq centimètres des lampes ultraviolettes. Après illumination.

Ajouter de l'eau sur le masque et le PDMS, puis détacher lentement le PDMS du masque. Monter le PDMS précédemment passivé sur le dispositif d'étirement. Fixer un côté du PDMS à la partie fixe de l'étireur. Fixer l'autre côté à la partie mobile de l'étireur sans pincer trop fortement la feuille de PDMS.

Si le PDMS est trop serré, il devient plus court et cela peut entraîner une rupture, car la tension sera plus importante pour la même distance d'étirement. Veillez à bien serrer les vis, sinon la feuille de PDMS glissera dès le début de l'étirement ou ultérieurement au cours de l'expérience. Incubez ensuite le PDMS avec la solution de fibronectine pendant une heure.

À température ambiante, il est possible d'utiliser d'autres protéines de la matrice extracellulaire, mais celles-ci n'ont pas été testées avec ce protocole. Comme étape finale, rincez le PDMS avec une solution saline tamponnée au phosphate. Ensuite, découpez un rectangle de PDMS dans un bloc épais de PDMS.

Ensuite, découpez un autre rectangle à l'intérieur. Afin d'obtenir un réservoir qui retiendra les cellules et le milieu, ajoutez de la graisse de silicone sous ce rectangle découpé en PDMS et placez-le sur la feuille de PDMS pour créer un réservoir de rétention du milieu. La graisse permettra le glissement du réservoir sur la feuille de PDMS pendant l'étirement, afin de structurer les cellules.

Commencez par détacher les cellules d’un flacon de culture à 50 % de confluence. Une fois les cellules en suspension, pipetez-les plusieurs fois à l’aide d’une pointe de 200 microlitres afin de rompre les agrégats, ce qui garantira que les cellules individuelles s’associent au motif. Ensuite, ajoutez un millilitre de la suspension cellulaire dans le réservoir.

Laisser les cellules s'attacher aux motifs pendant 10 à 30 minutes, selon le type cellulaire, dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Une fois que les cellules se sont fixées aux motifs, rincer doucement les cellules non adhérentes avec du milieu équilibré.

Retirez le milieu à l’aide d’une pipette d’aspiration tout en ajoutant simultanément du milieu. Il est essentiel de maintenir un flux suffisant pour éliminer les cellules non attachées tout en gardant les cellules immergées dans le milieu. Ensuite, placez un couvre-objet au-dessus de la goutte pour éviter l’évaporation et les fuites de milieu en cas de rupture du PDMS, puis laissez les cellules s’étaler pendant plusieurs heures sur les motifs.

Ensuite, placez l'appareil sur un microscope inversé et commencez l'imagerie. Évitez d'utiliser des objectifs à immersion huileuse car ils ne fonctionneront pas en raison de problèmes de mise au point. Pour étirer les cellules du motif microscopique, tournez la vis micrométrique tout en corrigeant la position de la platine selon les axes x, y et Z.

La position de la platine doit être corrigée afin de compenser l'élargissement du PDMS et la perte de mise au point. La technique présentée dans ce protocole vidéo a permis d'appliquer des forces sur les fibres de rétraction de cellules mammaliennes en mitose en étirant le substrat au début de la métaphase. Certaines de ces fibres de rétraction ont été tirées loin du corps cellulaire, entraînant une force mécanique appliquée sur le cortex des cellules mitotiques avant l'étirement ; pour ce faire, la cellule est ensemencée sur un motif ovale.

Le façonnage est réalisé en étirant le PDMS lors de l'empreinte de motifs circulaires à l'aide du masque photolithographique. Après l'étirement, le substrat est déformé de manière à ce que le motif devienne circulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment vous pouvez ensemencer des cellules sur des motifs macroscopiques puis appliquer des forces d'étirement au substrat.