Name: Stretching cellules Micropatterned sur une membrane PDMS (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Découvrez une technique d'étirement unidirectionnel de cellules adhérentes sur membrane PDMS micropatternée. Cette méthode permet d'étudier les réponses mécaniques des cellules en mitose par microscopie vidéo.

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Ce travail a été fondée par l&#39;Institut Curie, Paris, France. La civière mécanique a été conçu par Damien Cuvelier (Institut Curie) et est fabriqué par GREM (mecanique-grem.com). La structuration de PDMS a été développé par Ammar Azioune (Université Bordeaux II).

Une. Passivation de l&#39;PDMS <ol><li> Coupez un morceau de PDMS environ 35 mm x 20 mm à partir d&#39;une feuille pré fait (par exemple, GelPak, comme répertoriés dans le tableau des matériaux). </li><li> Retirer le dessus et les couches de protection du bas du plastique (si nécessaire) et utiliser des pinces pour placer les PDMS dans un plastique (pas de culture cellulaire traité) boîte de Pétri. </li><li> Laver les PDMS à l&#39;éthanol 70% pendant 5 min sur un rotateur à 30 oscillations / min. </li><li> Sécher la surface par un courant d&#39;air sur elle. </li><li> Illuminez UV profond (λ = 180 nm) pendant 5 min à une distance des ampoules UV d&#39;environ 5 cm (voir fiche Matériaux pour la référence de la lampe, les paramètres varient pour différentes lampes). </li><li> Préparer 200 pi de solution EDC / NHS pour chaque PDMS pièce (ce doit être préparé juste avant utilisation, car la réactivité de la solution se décompose en quelques heures). Pour 1 ml de 0,05 M MES + tampons NaCl 0,5 M à pH 6,0, ajouter 11,5 mg de sulfo-NHS et 19,2 mg d&#39;EDC. </li><li> Transférer lePDMS feuilles à partir de la boîte de Petri vers le couvercle de la boîte de Pétri, qui n&#39;a pas été allumé. Cela permet de s&#39;assurer que l&#39;environnement des PDMS sont très hydrophobes et de faciliter l&#39;étape suivante. </li><li> Ajouter la solution EDC / NHS et incuber pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Rincer EDC / NHS avec de l&#39;eau. </li><li> Ajouter la solution de PLL-g-PEG (0,5 mg / ml dans de l&#39;HEPES 10 mM pH 8,6) et incubation de 3 heures à une nuit à température ambiante. </li><li> Rincer le PLL-g-PEG avec de l&#39;eau. PDMS passives (fonctionnalisés par PLL-g-PEG) peuvent être stockés pendant plusieurs jours à 4 ° C. </li></ol> 2. Structuration de la PDMS <ol><li> Prenez une feuille de PDMS et le placer sur un photomasque de quartz synthétique portant les microcaractéristiques pour motif (voir la figure 1). Placez le côté PDMS portant le PLL-g-PEG face au côté chrome du photomasque. </li><li> Illuminer pendant 7 min à travers le photomasque à une certaine distance des ampoules UV d&#39;environ 5 cm.</li><li> Ajouter de l&#39;eau sur le masque + PDMS et éplucher les PDMS lentement le masque. </li><li> Incuber avec une solution de fibronectine à 50 mg / ml dans du tampon HEPES à pH 8,6 pendant 1 h à température ambiante. Il est possible d&#39;utiliser d&#39;autres protéines de la MEC, mais ceux-ci n&#39;ont pas été testés avec ce protocole. </li><li> Rincer avec du PBS. </li></ol> 3. Montage du périphérique <ol><li> Montez les PDMS auparavant passives sur le dispositif d&#39;étirement (voir Discussion pour le dépannage). <ol><li> Fixer un côté des PDMS à la partie fixe de la civière. </li><li> Fixer l&#39;autre côté à la partie mobile de la civière sans trop serrer la feuille de PDMS. </li></ol></li><li> Découpez un rectangle de PDMS (22 mm x 19 mm) dans un coup de PDMS d&#39;épaisseur et couper un autre rectangle à l&#39;intérieur afin d&#39;avoir une piscine (ou cadre) qui va retenir les cellules et les médias (voir la figure 2). </li><li> Ajouter de la graisse de silicone sous ce PDMS piscine et placer sur le dessus de la feuille de PDMS pour créer un medium conservant piscine. La graisse permettra le glissement de la piscine sur la feuille PDMS pendant l&#39;étirement. </li></ol> 4. Modeler les cellules <ol><li> Détacher les cellules à partir d&#39;un flacon de culture de confluence de 50% avec Versene. </li><li> Compter les cellules et remettre en suspension à une concentration de 200 000 cellules / ml. </li><li> Ajouter 1 ml de suspension de cellules dans la piscine (voir la discussion pour plus de détails). </li><li> Laisser les cellules se lient aux modes de 10 à 30 min (selon le type cellulaire, les cellules RPE-1 auront 10 minutes et les cellules HeLa 20 min). </li><li> Rincez délicatement les cellules flottantes avec un milieu équilibré (s&#39;équilibrer moyen dans l&#39;incubateur). </li><li> Laissez les cellules réparties pour quelques heures sur les modèles (RPE-1 aura besoin d&#39;au moins 2 heures, les cellules HeLa devront 3 h). </li><li> Ajouter une lamelle sur le dessus de la piscine pour éviter les fuites d&#39;évaporation et moyennes dans le cas où les PDMS pauses. </li><li> Mettre l&#39;appareil sur un microscope inversé et commencer imagerie. Éviter l&#39;utilisation de l&#39;huile à immersion obtifs comme il ne fonctionnera pas en raison de problèmes de focalisation. </li></ol> 5. Étirage <ol><li> Tourner la vis micrométrique tout en corrigeant la position de phase dans les directions x, y et l&#39;axe z (x principalement). La position de phase doit être corrigé pour compenser l&#39;élargissement des PDMS et la perte de concentration. (Voir «Pendant l&#39;étirement&quot; paragraphe de la discussion). </li></ol>

<ol><li>Vogel, V., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+force+and+geometry+sensing+regulate+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Local force and geometry sensing regulate cell functions.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275 (2006).</li>
<li>Terenna, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+mechanisms+redirecting+cell+polarity+and+cell+shape+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical mechanisms redirecting cell polarity and cell shape in fission yeast.</a> Curr. Biol. 18 (22), 1748-1753 (2008).</li>
<li>Guillot, C., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+epithelial+tissue+homeostasis+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanics of epithelial tissue homeostasis and morphogenesis.</a> Science. 340 (6137), 1185-1189 (2013).</li>
<li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+morphogenesis+by+Fat%2FDachsous%2FFour-jointed+planar+cell+polarity+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway.</a> Science. 336 (6082), 724-727 (2012).</li>
<li>Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+cell+mechanics%2C+cell-cell+interactions%2C+and+proliferation+on+epithelial+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Curr. Biol. 17, 2095-2104 (2007).</li>
<li>Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+and+anisotropy+of+cortical+forces+orienting+Drosophila+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis.</a> Nat. Cell Biol. 10, 1401-1410 (2008).</li>
<li>Mitrossilis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-cell+response+to+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Real-time single-cell response to stiffness.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (38), 16518-16523 (2010).</li>
<li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchison, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 12, 1783-1790 (2007).</li>
<li>Fink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+forces+control+mitotic+spindle+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">External forces control mitotic spindle positioning.</a> Nat. Cell. Biol. 13 (7), 771-778 (2011).</li>
<li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).</li>
<li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+micropatterns%3A+A+direct+printing+protocol+using+deep+Uvs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep Uvs.</a> Methods Cell Biol. 97, 133-146 (2010).</li>
<li>Azioune, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+method+for+high-throughput+surface+patterning+of+deformable+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Robust method for high-throughput surface patterning of deformable substrates.</a> Langmuir. 27 (12), 7349-7352 (2011).</li>
<li>Carpi, N., Piel, M., Azioun, A., Cuvelier, D., Fink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+on+silicon+elastomer+%28PDMS%29+with+deep+UVs%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Exch%22%5BJournal%5D)">Micropatterning on silicon elastomer (PDMS) with deep UVs.</a> Protoc. Exch. , (2011).</li>
<li>Sinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+respond+to+mechanical+stress+by+rapid+disassembly+of+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cells respond to mechanical stress by rapid disassembly of caveolae.</a> Cell. 144 (3), 402-413 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Bien que cette technique a été utilisée à de nombreuses reprises et est testé en profondeur, il ya plusieurs étapes critiques qui peuvent conduire à une expérience ratée. A propos des PDMS: Pour ce travail, GelPak, une feuille de PDMS mince disponible dans le commerce, a été utilisé. Sinon feuilles PDMS peuvent être lancés directement à partir de PDMS mélange. Nous vous recommandons d&#39;utiliser GelPak parce qu&#39;il est plus reproductible, et est moins susceptib...

Les cellules composant un tissu chez les organismes supérieurs sont soumis à des tensions mécaniques et les forces d&#39;étirage provenant soit du milieu extérieur ou à partir de cellules environnantes 1,2. Les cellules doivent s&#39;adapter et à résister à ces forces afin de maintenir l&#39;intégrité des tissus. Ces forces sont également importantes pour la morphogenèse des tissus au cours du développement de 3,4. L&#39;application de forces mécaniques sur des cellules en culture est une façon d&#39;imiter ce qui pourrait arriver dans un tissu, mais avec un contrôle quantitatif et indépendante de la forme des cellules et la déformation de la cellule 5,6. Pour cela, plusieurs techniques peuvent être utilisées. On peut appuyer sur les cellules (la cellule entière ou une partie de celui-ci), par exemple en utilisant l&#39;AFM ou dérivés 7,8 ou étirer le substrat, les cellules sont de plus en plus sur. La méthode décrite dans cet article montre comment étirer un substrat plan avec des cellules plaquées. Cette technique a d&#39;abord été mis au point pour évaluer le rôle des forces exercées sur mles cellules de mammifères itotic 9. Les cellules mitotiques rester connecté au substrat par des fibres de rétraction et d&#39;étirement de la membrane une force exercée sur ces fibres, ce qui a provoqué la rotation du fuseau mitotique. L&#39;intérêt de combiner micropatterns adhésives et d&#39;étirement est de parvenir à un contrôle indépendant des forces et de la forme des cellules individuelles. Il est par exemple possible d&#39;étirer une cellule ovoïde dans une forme ronde parfaitement isotrope, tandis que l&#39;allongement uniaxial est appliquée. Si les cellules ne sont pas tressé sur micropatterns, étirage uniaxial résultats de l&#39;allongement cellulaire, avec la plupart des cellules ayant un axe longitudinal aligné avec l&#39;axe d&#39;étirage. Il est alors difficile de séparer l&#39;effet de l&#39;alignement de l&#39;axe long et l&#39;effet de l&#39;étirage appliqué aux cellules. L&#39;appareil est conçu pour toute l&#39;imagerie des cellules vivantes, y compris longtemps microscopie laps de fluorescent, et les médicaments peut être ajouté lors de l&#39;expérience. La méthode profonde UV micromodelage 10qui a été décrit en détail dans Azioune et al. Patterning 11 sur PDMS a été décrit dans Azioune et al. étirage 12 La présente protocole est une version vidéo de Carpi et al. 13

<table><tbody><tr><td>GelPak</td><td>GelPak</td><td>PF-60-X4</td><td>Différentes épaisseurs/adhérences sont disponibles. Une alternative pourrait être de caster votre PDMS&nbsp ; toi-même.</td></tr><tr><td>Graisse silicone</td><td>GE Bayer Silicones</td><td>Baysilone-Paste Celle-ci</td><td>est biocompatible</td></tr><tr><td>Dispositif d’étirement</td><td>GREM m&eacute ; </td><td>Canique Brancard 2011</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>EDC (chlorhydrate de N-(3-diméthylaminopropyl)-N&prime ;-éthylcarbodiimide)</td><td>Sigma</td><td>3450</td><td>Stable 6 mois à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt)</td><td>Sigma</td><td>56485</td><td>Protéger de l’humidité</td></tr><tr><td>Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)</td><td>SurfaceSolutions (Zurich)</td><td></td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Photomasque en quartz synthétique</td><td>Toppan</td><td></td><td>Prenez un photomasque binaire standard en</td></tr><tr><td>fibronectine de quartz à partir du plasma bovin</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td>.</td></tr></tbody></table>

stretching cellules micropatterned sur une membrane pdms

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Les forces mécaniques qui s&#39;exercent sur les cellules et / ou tissus jouent un rôle important dans de nombreux processus. Nous avons mis au point un dispositif pour étirer les cellules étalées sur un polydiméthylsiloxane (PDMS) membrane, compatible avec l&#39;imagerie. Cette technique est reproductible et versatile. La membrane PDMS peut être microélectrodes pour confiner des cellules ou des tissus à une géométrie spécifique. La première étape consiste à imprimer micropatterns sur la membrane PDMS avec une technique de rayonnement UV lointain. La membrane PDMS est ensuite montée sur un châssis mécanique. Une chambre est tenue au-dessus de la membrane avec de la graisse biocompatible pour permettre glisse pendant l&#39;étirement. Les cellules sont ensemencées et autorisés à se répandre pendant plusieurs heures sur les micropatterns. L&#39;échantillon peut être étirée et non étirée à plusieurs reprises à l&#39;aide d&#39;une vis micrométrique. Il faut moins d&#39;une minute pour appliquer le tronçon à sa pleine mesure (environ 30%). La technique présentée ici ne comprend pas un dispositif motorisé, qui est nécessaire pour unpplying cycles répétés d&#39;étirement rapidement et / ou traction contrôlée ordinateur, mais cela peut être mis en œuvre. Stretching de cellules ou de tissus peut être d&#39;intérêt pour les questions liées aux forces de cellules, la réponse cellulaire au stress mécanique ou la morphogenèse des tissus. Cette présentation vidéo vous montrera comment éviter les problèmes typiques qui peuvent survenir lorsque vous faites ce type d&#39;expérience apparemment simple.

<html> La technique présentée dans ce protocole vidéo a permis l&#39;application de forces sur les fibres de rétraction de la mitose des cellules de mammifères. En effet, au cours de la division cellulaire, dans la phase mitotique des cellules de mammifères se rétractent pour prendre la forme d&#39;une sphère et laisser derrière les câbles d&#39;actine minces entourées de membrane qui sont fixés au substrat. Ces câbles (fibres de rétraction), sont la mémoire de la géométrie de la cellule avant d&#39;entrer dans la divisi...

Ce manuscrit présente une technique d&#39;appliquer ou libérer des forces sur les cellules ou les tissus adhérents utilisant étirement unidirectionnel.

Stretching cellules Micropatterned sur une membrane PDMS

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

L'objectif général de cette procédure est d'étirer des cellules disposées selon un motif sur une membrane élastique en polydiméthylsiloxane ou PDMS. Cela est réalisé en tendant une feuille de PDMS, puis en appliquant un motif microscopique sur le PDMS. La feuille de PDMS munie du motif microscopique est ensuite fixée sur le dispositif d'étirement et une cuve de rétention de milieu est placée par-dessus.Ensuite, les cellules sont ensemencées à la surface de la feuille de PDMS microstructurée et laissées s'attacher au motif avant un lavage destiné à éliminer les cellules non attachées. L'étape finale consiste à appliquer une élongation sur le PDMS contenant les cellules afin de les étirer. En fin de compte, la microscopie vidéo est utilisée pour montrer que l'application de forces sur les fibres de rétraction des cellules mitotiques de mammifères lors de l'étirement cellulaire entraîne une déformation de la cellule.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biomécanique, telles que quels sont les effets des forces externes sur des processus cellulaires comme la division ? Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons voulu appliquer des forces sur une cellule en division afin de commencer à découper un morceau de PDMS d'environ 35 par 20 millimètres à partir d'une feuille préfabriquée. Ici, une feuille mince de PDMS disponible dans le commerce est utilisée car elle est plus reproductible et moins susceptible de se rompre par rapport au PDMS fabriqué sur mesure.Retirez les couches protectrices en plastique supérieure et inférieure et utilisez des pinces pour placer le PDMS dans une boîte de Pétri en plastique. Lavez ensuite le PDMS avec de l'éthanol à 70 % pendant cinq minutes sur un agitateur rotatif à 30 oscillations par minute. Après le lavage, séchez la surface en faisant passer de l'air dessus.Ensuite, exposez le PDMS à la lumière ultraviolette profonde pendant cinq minutes, à une distance d'environ cinq centimètres des lampes ultraviolettes. Pendant ce temps, préparez une solution E-D-C-N-H-S comme décrit dans le protocole écrit. La solution doit être préparée juste avant utilisation, car sa réactivité diminue en quelques heures.Transférez les feuilles de PDMS depuis la boîte de Pétri vers le couvercle de la boîte de Pétri, qui n’a pas été exposé à la lumière. Cela garantira que l’environnement du PDMS soit très hydrophobe et facilitera l’étape suivante.Appliquez la solution E-D-C-N-H-S sur le PDMS à l’aide d’une pipette et incubez pendant 15 minutes à température ambiante. Après l'incubation, rincez l'excès de E-D-C-N-H-S à l’eau.Ensuite, ajoutez la solution de PEG greffé sur le PLL et incubez de trois heures à toute la nuit à température ambiante. Après l'incubation, rincez l'excès de PEG greffé sur le PLL du PDMS à l'eau. Le PDMS est désormais passivé ou fonctionnalisé avec le PEG greffé sur le PLL et peut être conservé plusieurs jours à quatre degrés Celsius. Pour structurer le PDMS, placez la feuille de P-D-M-S sur un masque photo en quartz synthétique portant les microstructures destinées à la structuration.Placer le côté PDMS portant le PEG greffé au PLL face au côté chrome du masque photolithographique. Ensuite, illuminer pendant sept minutes à travers le masque photolithographique, à une distance d'environ cinq centimètres des lampes ultraviolettes. Après illumination.Ajouter de l'eau sur le masque et le PDMS, puis détacher lentement le PDMS du masque. Monter le PDMS précédemment passivé sur le dispositif d'étirement. Fixer un côté du PDMS à la partie fixe de l'étireur. Fixer l'autre côté à la partie mobile de l'étireur sans pincer trop fortement la feuille de PDMS.Si le PDMS est trop serré, il devient plus court et cela peut entraîner une rupture, car la tension sera plus importante pour la même distance d'étirement. Veillez à bien serrer les vis, sinon la feuille de PDMS glissera dès le début de l'étirement ou ultérieurement au cours de l'expérience. Incubez ensuite le PDMS avec la solution de fibronectine pendant une heure.À température ambiante, il est possible d'utiliser d'autres protéines de la matrice extracellulaire, mais celles-ci n'ont pas été testées avec ce protocole. Comme étape finale, rincez le PDMS avec une solution saline tamponnée au phosphate. Ensuite, découpez un rectangle de PDMS dans un bloc épais de PDMS.Ensuite, découpez un autre rectangle à l'intérieur. Afin d'obtenir un réservoir qui retiendra les cellules et le milieu, ajoutez de la graisse de silicone sous ce rectangle découpé en PDMS et placez-le sur la feuille de PDMS pour créer un réservoir de rétention du milieu. La graisse permettra le glissement du réservoir sur la feuille de PDMS pendant l'étirement, afin de structurer les cellules.Commencez par détacher les cellules d’un flacon de culture à 50 % de confluence. Une fois les cellules en suspension, pipetez-les plusieurs fois à l’aide d’une pointe de 200 microlitres afin de rompre les agrégats, ce qui garantira que les cellules individuelles s’associent au motif. Ensuite, ajoutez un millilitre de la suspension cellulaire dans le réservoir.Laisser les cellules s'attacher aux motifs pendant 10 à 30 minutes, selon le type cellulaire, dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Une fois que les cellules se sont fixées aux motifs, rincer doucement les cellules non adhérentes avec du milieu équilibré.Retirez le milieu à l’aide d’une pipette d’aspiration tout en ajoutant simultanément du milieu. Il est essentiel de maintenir un flux suffisant pour éliminer les cellules non attachées tout en gardant les cellules immergées dans le milieu. Ensuite, placez un couvre-objet au-dessus de la goutte pour éviter l’évaporation et les fuites de milieu en cas de rupture du PDMS, puis laissez les cellules s’étaler pendant plusieurs heures sur les motifs.Ensuite, placez l'appareil sur un microscope inversé et commencez l'imagerie. Évitez d'utiliser des objectifs à immersion huileuse car ils ne fonctionneront pas en raison de problèmes de mise au point. Pour étirer les cellules du motif microscopique, tournez la vis micrométrique tout en corrigeant la position de la platine selon les axes x, y et Z.La position de la platine doit être corrigée afin de compenser l'élargissement du PDMS et la perte de mise au point. La technique présentée dans ce protocole vidéo a permis d'appliquer des forces sur les fibres de rétraction de cellules mammaliennes en mitose en étirant le substrat au début de la métaphase. Certaines de ces fibres de rétraction ont été tirées loin du corps cellulaire, entraînant une force mécanique appliquée sur le cortex des cellules mitotiques avant l'étirement ; pour ce faire, la cellule est ensemencée sur un motif ovale.Le façonnage est réalisé en étirant le PDMS lors de l'empreinte de motifs circulaires à l'aide du masque photolithographique. Après l'étirement, le substrat est déformé de manière à ce que le motif devienne circulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment vous pouvez ensemencer des cellules sur des motifs macroscopiques puis appliquer des forces d'étirement au substrat.

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