Stretching cellules Micropatterned sur une membrane PDMS

L'objectif global de cette procédure est d'étirer les cellules du motif sur une membrane élastique de poly diméthyl suboxane ou PDMS. Cela est réalisé grâce à la création d'une feuille A-P-D-M-S, suivie de l'application d'un micro motif sur le PDMS. La feuille PDMS micro-motif est ensuite montée sur le dispositif d'étirement et un bassin de rétention de milieu est placé sur le dessus.

Ensuite, les cellules sont placées sur la surface de la feuille PDMS micro-motif et on leur permet de s'attacher au motif avant de rincer pour éliminer les cellules non attachées. L'étape finale consiste à appliquer une élongation au PDMS contenant les cellules pour étirer les cellules. En fin de compte, la microscopie vidéo est utilisée pour montrer que l'application de forces sur les fibres de rétraction des cellules mammifères mitotiques lors de l'étirement des cellules entraîne une déformation de la cellule.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biomécanique, telles que quels sont les effets des forces externes sur les processus cellulaires comme la division? Nous avons d'abord eu l'idée de cette méthode lorsque nous voulions appliquer des forces sur une cellule en division pour commencer à couper un morceau de PDMS d'environ 35 sur 20 millimètres d'une feuille préfabriquée. Ici, une feuille PDMS mince disponible dans le commerce est utilisée car elle est plus reproductible et moins susceptible de se briser par rapport au PDMS fait sur mesure.

Retirez les couches protectrices supérieure et inférieure en plastique et utilisez une pincette pour placer le PDMS dans une boîte de Petri en plastique. Ensuite, lavez le PDMS avec 70% d'éthanol pendant cinq minutes sur un rotateur à 30 oscillations par minute. Après le lavage, séchez la surface en faisant circuler de l'air dessus.

Ensuite, illuminez le PDMS avec une lumière ultraviolette profonde pendant cinq minutes à une distance d'environ cinq centimètres des ampoules ultraviolettes. Pendant ce temps, préparez une solution E-D-C-N-H-S comme décrit dans le protocole de texte. La solution doit être préparée juste avant utilisation car la réactivité de la solution diminue en quelques heures.

Transférez les feuilles PDMS de la boîte de Petri vers le couvercle de la boîte de Petri, qui n'a pas été illuminée. Cela garantira que l'environnement du PDMS est très hydrophobe et facilitera l'étape suivante.

Pipetez la solution E-D-C-N-H-S sur le PDMS et incubez pendant 15 minutes à température ambiante. Après l'incubation. Rincez l'excès d'E-D-C-N-H-S à l'eau.

Ensuite, ajoutez la solution de PEG greffé PLL et incubez de trois heures à une nuit à température ambiante. Après l'incubation, rincez l'excès de PEG greffé PLL du PDMS à l'eau. Le PDMS est maintenant passivé ou fonctionnalisé avec du PEG greffé PLL et peut être conservé pendant plusieurs jours à quatre degrés Celsius. Pour motifer le PDMS, placez une feuille A-P-D-M-S sur un photomasque en quartz synthétique portant les micro-caractéristiques pour le motif.

Placez le côté PDMS portant le PEG greffé PLL face au côté chrome du photomasque. Ensuite, illuminez pendant sept minutes à travers le photomasque à une distance d'environ cinq centimètres des ampoules ultraviolettes. Après l'illumination.

Ajoutez de l'eau sur le masque et le PDMS, puis décollez lentement le PDMS du masque, montez le PDMS précédemment passivé sur le dispositif d'étirement. Fixez un côté du PDMS à la partie fixe de l'étirement. Fixez l'autre côté à la partie mobile de l'étirement sans trop serrer la feuille PDMS.

Si le PDMS est trop serré, il devient plus court et cela peut conduire à une rupture car la tension sera plus grande pour la même distance d'étirement. Assurez-vous que les vis sont bien serrées, sinon la feuille PDMS glissera dès que l'étirement commencera, ou plus tard pendant l'expérience. Ensuite, incubez le PDMS avec une solution de fibronectine pendant une heure.

À température ambiante, il est possible d'utiliser d'autres protéines de matrice extracellulaire, mais celles-ci n'ont pas été testées avec ce protocole. En tant qu'étape finale, rincez le PDMS avec du phosphate tamponné en solution saline. Ensuite, coupez un rectangle de PDMS dans une épaisse plaque de PDMS.

Puis coupez un autre rectangle à l'intérieur. Afin d'avoir un bassin qui retiendra les cellules et le milieu, ajoutez de la graisse silicone sous ce PDMS découpé rectangulaire et placez-le sur le dessus de la feuille de PDMS pour créer un bassin de rétention de milieu. La graisse permettra le glissement du bassin sur la feuille de PDMS pendant l'étirement pour motifer les cellules.

Tout d'abord, détachez les cellules d'un flacon de culture à 50% de cofluence. Une fois que les cellules sont en suspension, pipetez-les plusieurs fois avec une pointe de 200 microlitres pour briser les agrégats, ce qui garantira que les cellules individuelles se lient au motif. Ensuite, ajoutez un millilitre de suspension cellulaire dans le bassin.

Laissez les cellules se lier aux motifs pendant 10 à 30 minutes, selon la cellule. Tapez dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Une fois que les cellules se sont attachées aux motifs, rincez doucement les cellules flottantes avec du milieu équilibré pour rincer les cellules.

Retirez le milieu avec une pipette d'aspiration tout en ajoutant simultanément du milieu. Il est essentiel de maintenir un flux suffisant pour laver les cellules non attachées tout en gardant les cellules immergées dans le milieu. Ensuite, ajoutez un porte-objet sur le dessus du bassin pour éviter l'évaporation et la fuite de milieu au cas où le PDMS se briserait et laissez les cellules s'étendre pendant quelques heures sur les motifs.

Ensuite, placez le dispositif sur un microscope inversé et commencez l'imagerie. Évitez l'utilisation d'objectifs à immersion d'huile car ils ne fonctionneront pas à cause de problèmes de mise au point. Pour étirer les cellules du micro-motif, tournez la vis micrométrique tout en corrigeant la position de la platine sur les axes x, y et Z.

La position de la platine doit être corrigée pour contrer l'élargissement du PDMS et la perte de focus. La technique présentée dans ce protocole vidéo a permis l'application de forces sur les fibres de rétraction des cellules mammifères mitotiques en étirant le substrat au début de la métaphase. Certaines de ces fibres de rétraction ont été tirées du corps cellulaire, entraînant une force mécanique appliquée sur le cortex des cellules mitotiques avant l'étirement, la cellule est placée sur un motif ovale pour y parvenir.

Le motif est fait avec le PDMS qui est étiré pendant l'impression de motifs ronds à travers le photomasque. Après l'étirement, le substrat est étiré de sorte que le motif devienne un cercle. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon dont vous pouvez plaquer les cellules sur des motifs macro puis appliquer des forces d'étirement au substrat.