Surveillance de la compétition intraspécifique dans une population de cellules bactériennes par cocultivation de souches marquées par fluorescence

Cette méthode utilise la co-culture de bacillus sutilis marqué par fluorescence pour surveiller l’expansion clonale rapide et l’élimination des mutations bénéfiques et nuisibles dans une population cellulaire bactérienne au fil du temps. Tout d’abord, préparez les pré-cultures de bactéries pour l’expérience de compétition. Mélangez des quantités égales des souches marquées par fluorescence et cultivez les bactéries dans différentes conditions nutritionnelles.

Ensuite, collectez les échantillons à différents moments, diluez de manière appropriée et multipliez les cellules sur des plaques de gélose. Visualisez et comptez maintenant les souches survivantes par microscopie à fluorescence stéréoscopique. En fin de compte, les résultats peuvent déterminer le pourcentage de bactéries survivantes par rapport au nombre total de colonies dénombrées.

Contrairement à la surveillance de la compétition intra-espèce à l’aide de différentes cassettes d’antibiotiques pour le marquage des souches. Dans cette méthode, les souches concurrentes marquées par fluorescence sont presque complètement isotoniques et capables de brasser sur les mêmes plaques AGA. La pré-procédure sera présentée par Lorena, qui est étudiante au doctorat dans mon laboratoire, inoculer les quatre millilitres de milieu LB avec un microlitre de bactéries à partir de moins 80 degrés Celsius, cryo stocks, et faire pousser les pré-cultures pendant la nuit à 28 degrés Celsius et 220 RPM diluer 0,1 millilitres de culture dans 0,9 millilitres de milieu LB dans un vétérinaire de 1,5 millilitre, et déterminer la densité optique.

Ensuite, pour obtenir des populations cellulaires mixtes pour les expériences de compétition, inoculez des flacons agités de 100 millilitres contenant 20 millilitres de CGLC et de CGLC. Milieu minimal dans un rapport de un à un, transférez 10 millilitres des cultures dans des tubes en plastique de 15 millilitres. Récoltez les cellules par centrifugation pendant 10 minutes à 4 000 fois la gravité et jetez le surnageant.

Ensuite, remettez les cellules en suspension dans 0,5 millilitre de milieu LB frais, et transférez les cellules dans une tasse de réaction stérile de 1,5 millilitre et ajoutez 0,5 millilitre de glycérol stérile à 50 %. Mélangez la suspension par vortex rigoureux et stockez les échantillons dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, les bactéries restantes dans les flacons agités.

Gardez les flacons agités dans l’obscurité pour éviter le photoblanchiment de la flore : forcez l’échantillon de 0,1 millilitre des cultures après sept heures et 24 heures de croissance, mesurez et notez la densité optique d’une à 10 dilutions des échantillons, faites des stocks cryogéniques des échantillons à stocker à moins 80 degrés Celsius. Après avoir collecté tous les échantillons, décongelez les stocks cryogéniques et diluez les cellules dans une solution saline à 0,9 % pour chaque plaque de souches. 0,1 millilitre de dilution de 10 à moins cinquième sur une plaque de gélose moyenne SP, et répartir les cellules à l’aide d’une pipette en verre stérile.

Incuber les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans l’obscurité jusqu’à ce que des colonies uniques apparaissent avec un stylo noir. Divisez le fond de la plaque de gélose en quatre parties pour une meilleure orientation tout en comptant les survivants sous le microscope à stéréofluorescence. Maintenant, placez la plaque à l’envers sous le microscope et faites la mise au point sur les colonies à l’aide de la source de lumière froide.

Une fois que les colonies sont au point, passez au jeu de filtres approprié pour CFP Flora quatre. Pour visualiser les cellules survivantes de la souche marquée CFP, comptez les survivants de cette souche en marquant les colonies avec un stylo. Et notez le numéro.

Retirez les étiquettes contenant de l’éthanol. Passez ensuite au jeu de filtres YFP. Visualiser les cellules survivantes de la souche marquée YFP.

Comptez à nouveau les survivants en étiquetant les colonies avec un stylo. Et notez le numéro. Ouvrez les photos prises à partir d’un seul endroit avec le jeu de filtres CFP et le jeu de filtres YFP.

Optimisez le contraste et la luminosité pour réduire la fluorescence de fond du support. Allez sur l’une des images et sélectionnez tout. Copiez l’image et collez-la sur l’autre image.

Fusionnez les images en sélectionnant dans le menu des calques l’option couleur plus claire. Dans cette expérience, une population cellulaire composée de deux souches de BCI a été marquée avec le Fluor CFP et le YFP pour évaluer l’effet de différentes sources d’azote sur la croissance en plaquant une dilution appropriée sur des plaques de gélose. La composition clonale d’une population cellulaire au fil du temps peut être déterminée avec précision en comptant simplement les colonies fluorescentes jaunes et bleues.

L’activité de l’enzyme glutamate déshydrogénase affecte fortement la valeur adaptative des otus en fonction de la disponibilité du glutamate exogène. En l’absence de glutamate exogène, une activité GDH de haut niveau est désavantageuse pour les bactéries car les enzymes basculent G et bon B dégradent le glutamate nécessaire à l’anabolisme. En revanche, la synthèse de deux gdhs fonctionnels est avantageuse pour les bactéries lorsque le glutamate exogène est disponible, car en plus du glucose G, le glutamate est utilisé comme source de carbone.

Des résultats similaires ont été obtenus dans une expérience de commutation de matrice. Encore une fois, les bactéries dotées d’une activité GDH de haut niveau ont été concurrencées par des cellules ayant une activité GDH réduite dans des milieux de croissance dépourvus de glutamate. En revanche, les bactéries synthétisant une seule GDH active ont été éliminées de la culture.

Lorsque le milieu a été complété par du glutamate, il est clair que la composition initiale de la population cellulaire mixte est restée presque constante au fil du temps. Indépendamment de Fluor pris ensemble. L’utilisation de Flora Force est un outil puissant pour surveiller la compétition intra-espèce dans une population cellulaire bactérienne une fois que les forces des concurrents ont été générées.

Cette technique peut être réalisée en cinq jours si elle est correctement exécutée.