Name: Étude de phagolysosome biogenèse dans les macrophages en direct (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Découvrez la biogenèse du phagolysosome dans les macrophages en temps réel par imagerie à fluorescence. Cette méthode quantitative offre une haute résolution temporelle pour étudier la maturation des phagosomes.

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Nous remercions les membres du Laboratoire de Biologie Phagosome pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail est soutenu par une subvention de Helmholtz Young Investigator (Initiative et les fonds de mise en réseau de l&#39;Association Helmholtz) et un programme de priorité SPP1580 Grant du Conseil de recherches en allemand (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

<ol><li>Greenberg, S., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and innate immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).</li>
<li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).</li>
<li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+adaptive+immunity+by+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of adaptive immunity by the innate immune system.</a> Science. 327, 291-295 (2010).</li>
<li>Stuart, L., Ezekowitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+elegant+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li>
<li>Blander, J. M., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+regulation+of+phagosome+maturation+and+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">On regulation of phagosome maturation and antigen presentation.</a> Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+aging+gracefully%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: aging gracefully.</a> Biochem. J. 366, 689-704 (2002).</li>
<li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagosome%3A+compartment+with+a+license+to+kill%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The phagosome: compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8, 311-330 (2007).</li>
<li>Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+mechanisms+of+phagocytes+and+bacterial+evasion+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).</li>
<li>Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes%3A+fusion+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes: fusion and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).</li>
<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).</li>
<li>Luzio, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-endosome+fusion+and+lysosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis.</a> J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).</li>
<li>Eissenberg, L., Goldman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+lysosomes+with+phagosomes+containing+Histoplasma+capsulatum%3A+use+of+fluoresceinated+dextran%29%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran).</a> Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).</li>
<li>de Souza Carvalho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization%2C+phagolysosomal+biogenesis+and+killing+of+mycobacteria+in+enucleated+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).</li>
<li>Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+and+sequential+delivery+of+fluorescent+lysosomal+probes+into+phagosomes+in+mouse+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages.</a> J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).</li>
<li>Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomes+Fuse+with+Late+Endosomes+and%2For+Lysosomes+by+Extension+of+Membrane+Protrusions+along+Microtubules%3A+Role+of+Rab7+and+RILP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP.</a> Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).</li>
<li>Huynh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAMP+proteins+are+required+for+fusion+of+lysosomes+with+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes.</a> EMBO J. 26, 313-324 (2007).</li>
<li>Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+mechanism+of+cargo+sorting+during+lysosome-phagosome+fusion+is+controlled+by+Rab34%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).</li>
<li>Snijder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li>
<li>Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).</li>
<li>Hemmi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Toll-like+receptor+recognizes+bacterial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA.</a> Nature. 408, 740-745 (2000).</li>
<li>Underhill, D., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors%3A+key+mediators+of+microbe+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors: key mediators of microbe detection.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).</li>
<li>Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I+and+class+III+phosphoinositide+3-kinases+are+required+for+actin+polymerization+that+propels+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes.</a> J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+receptor-ligand+interactions+modulate+gene+expression+and+phagosomal+properties+during+both+early+and+late+stages+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis.</a> Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+phagosome+maturation+as+a+function+of+phagosome%2Flysosome+fusion+and+acquisition+of+hydrolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity.</a> Traffic. 6, 413-420 (2005).</li>
<li>Savina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX2+controls+phagosomal+pH+to+regulate+antigen+processing+during+crosspresentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells.</a> Cell. 126, 205-218 (2006).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+phagosome+maturation+through+the+real-time%2C+spectrofluorometric+measurement+of+hydrolytic+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities.</a> Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).</li>
<li>Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+phagosomal+degradation+and+antigen+presentation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).</li>
<li>Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Responds+to+Chloride+and+pH+as+Synergistic+Cues+to+the+Immune+Status+of+its+Host+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li>
<li>Aziz, M., Yang, W. -L., Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current protocols in immunology. Coliganet, J. E., et al. 14, (2013).</li>
<li>Rogers, L., Foster, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).</li>
<li>Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -M., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+pH%2C+ROS+production%2C+maturation%2C+and+degradation+in+dendritic+cell+phagosomes+using+cytofluorometry-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays.</a> Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Dans la section suivante, nous allons discuter des étapes critiques de la méthode présentée et de ses limites. En outre, nous allons connecter certains des problèmes communs avec leurs solutions, apporter des modifications possibles et considérer les avantages de notre méthode ainsi que les méthodes complémentaires appropriés pour cette approche. La préparation des billes, y compris le couplage de l&#39;IgG à la surface des billes, est essentielle et l&#39;utilisation de préparations unfresh...

Phagocytes professionnels, y compris les macrophages, joue un crucial dans le système immunitaire. En plus d&#39;être la première ligne de défense du système immunitaire inné, ils jouent également un rôle essentiel dans l&#39;activation de l&#39;immunité adaptative par leur signalisation et présentant l&#39;antigène rôle 1-3. Bien que la fonction des phagocytes professionnels est à multiples facettes, phagosome maturation est l&#39;épine dorsale critique de la fonction de traitement bactéricide et l&#39;antigène des phagocytes professionnels 4,5. Lors de l&#39;immersion et de l&#39;absorption d&#39;une cible phagocytaires, tels que des bactéries médiée par le récepteur, le phagosome naissante passe par une séquence complexe et bien orchestrée de l&#39;interaction et des échanges avec des compartiments du réseau d&#39;endocytose et plusieurs autres organites cellulaires 6. La nature des composés échangé avec ces entités cellulaires ainsi que la réglementation et le calendrier des événements de fusion détermine la luminale phagosome milieu et les phagoscomposition de omal de membrane et donc 7, le sort du phagosome échéant le 8. La pertinence physiologique de maturation du phagosome est illustré par les diverses stratégies employées par les différents agents pathogènes intracellulaires d&#39;échapper, arrêter ou renverser phagosome maturation 9. La plupart de ces stratégies prévenir directement ou indirectement la phase finale et critique du processus de maturation du phagosome: la fusion de phagosome avec des compartiments fin endosomal / lysosomales, qui leur apporte l&#39;essentiel des enzymes hydrolytiques et des facteurs anti-bactériennes du phagosome maturité 7 , 8,10. L&#39;analyse de cette étape finale et critique peut donc nous fournir des indicateurs solides sur l&#39;état de maturation des phagosomes et si l&#39;état physiologique naturel est d&#39;être positivement ou négativement affecté dans les paramètres expérimentaux particuliers qui sont utilisés. Le compartiment endosomes tardifs / lysosomess sont généralement considérés comme les compartiments de raccordement de la voie d&#39;endocytose, définis et distingués des compartiments d&#39;endocytose début par la présence de divers, en scène, des molécules spécifiques de marqueurs. Par exemple des enzymes hydrolytiques ou composants de la membrane telles que les protéines de la membrane lysosomale associés (lampes) entre autres 11. Le terminal endocytose compartiments-appelée simplement comme lysosomes-servent également de l&#39;emplacement principal pour les phases finales de la digestion à la fin de la voie de phagocytose / 12 endocytose. De cette manière, des sondes non digestibles peuvent être chargés par l&#39;intermédiaire de l&#39;endocytose et macropinocytose le milieu extracellulaire et transportés à travers la voie d&#39;endocytose vers les lysosomes, où il s&#39;accumule 13,14 après avoir suivi un cycle défini de l&#39;absorption et de chasse. sondes conjugué à un fluorophore pour la microscopie fluorescente telle que le dextrane polymère organique non digestible sont couramment utilisés comme endocyticprobes 15-17. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Dans cette méthode, nous décrivons l&#39;utilisation de microbilles recouvertes d&#39;IgG en tant que cargaison phagocytaire d&#39;enquêter phagosome maturation par l&#39;analyse de la livraison de contenu lysosomale luminale de phagosomes. En utilisant une sonde dextran conjugué à un fluorophore comme un marqueur facilement détectable des lysosomes dans les macrophages os vivant de moelle dérivés (BMM) et vidéo en temps réel l&#39;imagerie avec un microscope confocal à balayage laser microscope, nous suivons le processus dynamique de la livraison de marchandises en phagosomes à haute résolution temporelle. Nous décrivons ensuite comment les données d&#39;imagerie time-lapse collectées peuvent être évaluées en utilisant open-source et disponible gratuitement le logiciel d&#39;analyse d&#39;image, Fidji (ou ImageJ), une analyse statistique en utilisant Microsoft Excel et présenté en utilisant le logiciel GraphPad Prism 14,18. Après la description de notre méthode, des expériences analogues peuvent être conçus en utilisant les paramètres et les facteurs modifiés pour étudier leur influence sur la maturation du phagosome, pratiquement n&#39;importe quel otson type de cellules phagocytaires primaires ou de lignées cellulaires adhérentes, perte génétique des expériences de fonction incluant le gène knock-out et knock-down, mutants ou l&#39;expression de protéines de fusion, phagocytaires-cibles, les produits de revêtement de microbilles, des sondes endosomal / lysosomal et des facteurs comme une cytokines, des inhibiteurs chimiques ou siRNA entre autres, sont autant de variables qui peuvent être appliqués à l&#39;approche de base de cette méthode. Nous définissons l&#39;objectif et les exigences de base de cette méthode comme suit: <ul type="disc"><li> Objectif de la méthode: pour permettre l&#39;observation directe, quantitative et qualitative et l&#39;analyse de la maturation du phagosome avec une haute résolution temporelle dans les cellules phagocytaires vivre. </li><li> Cargaison phagocytaire: une microparticule revêtue de manière appropriée ou d&#39;une cible biologique. Ici, nous utilisons recouvertes d&#39;IgG 3 um microparticules sphériques de polystyrène qui sont facilement internalisées via le récepteur Fc-γ phagocytose médiée. Sinon, tout micro-organisme ou micro revêturoparticle pour lequel un récepteur phagocytaire est présent sur les cellules peut être utilisé. </li><li> Les cellules phagocytaires: les cellules phagocytaires adhérentes exprimant les récepteurs phagocytaires appropriées. Ici, nous utilisons primaires BMMS de souris qui expriment les récepteurs Fc abondamment-γ. En variante, les cellules dendritiques (DC), les monocytes ou les cellules épithéliales phagocytaires ou à leurs mutants ou variants génétiques knock-out peuvent être utilisés. </li><li> Lysosomale cargaison: Une sonde lysosomale marqué par fluorescence. Ici, le Texas Red-conjugué 70,000 kiloDaltons dextran (Dex70kD) est utilisé en tant que la cargaison de luminal des lysosomes. En variante, n&#39;importe quel marqueur détectable par fluorescence d&#39;un compartiment cellulaire ou organite, ou une sonde appropriée pour les propriétés de phagosome tels que l&#39;acidité ou la capacité de dégradation, peut être utilisée pour étudier la progression de la maturation phagosome. </li><li> Les facteurs d&#39;influence: Par exemple, les molécules, les composés chimiques, gène knock-down, ou l&#39;expression transitoire de protéines mutantes pourraient signalisation. Ici, nous avons FÖRGun l&#39;utilisation d&#39;un tel facteur pour des raisons de simplicité, mais pour un exemple récent avec l&#39;expression de la protéine mutante et knock-down facteurs influençant s&#39;il vous plaît voir Kasmapour et al. 18 Tout facteur qui peut affecter la phagocytose ou les circonstances et la mobilité des phagosomes et / ou les compartiments qui interagissent avec les phagosomes échéance pourraient être utilisés. </li></ul>

<table><tbody><tr><td>Milieu Dulbecco’s Modified Eagles (D-MEM)</td><td>PAA, Autriche</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>Milieu Dulbecco’s Modified Eagles sans rouge de phénol (D-MEM)</td><td>PAA, Autriche</td><td>E15-047</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal de bovin (FBS)</td><td>PAA, Autriche</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>PAA, Autriche</td><td>M11-004</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA, Autriche</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>PAA, Autriche</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>WillCo-dish&reg ; Plat à fond en verre (35 mm &empty ;, #1.5)</td><td>WillCo Wells, Pays-Bas</td><td>GWSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>CELLviewTM Plat à fond en verre, 35 mm</td><td>Greiner Bio one, Allemagne</td><td>627871</td><td>Alternative : Disponible en microsphères de</td></tr><tr><td>latex carboxylées</td> segmentées <td>Polysciences, USA</td><td>#09850</td><td>Disponible en différents diamètres, nous avons utilisé 3 &mu ; m</td></tr><tr><td>Microparticules de polystyrène</td><td>Kisker Biotech, Allemagne</td><td>PPs-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH, Allemagne</td><td>305.1.3</td><td></td></tr><tr><td>souris entière IgG</td><td>Rockland, États-Unis</td><td>010-0102</td><td></td></tr><tr><td>Réticulant EDAC</td><td>Sigma-Aldrich,</td><td>États-Unis E6383-1g</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 ml Omnifix -F</td><td>B.Braun, Allemagne</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>26&nbsp ; Aiguille G (0.45*25 mm)</td><td>B.Baun, Allemagne</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA, Autriche</td><td>E15-039</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval</td><td>Gibco, USA</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu ; Filtre monté sur seringue M</td><td>Sartorius, Allemagne</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr></tbody></table>

Étude de phagolysosome biogenèse dans les macrophages en direct

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Les cellules phagocytaires jouent un rôle majeur dans le système immunitaire inné en enlevant et en éliminant les micro-organismes envahisseurs dans leurs phagosomes. Phagosome maturation est le processus complexe et étroitement réglementé au cours de laquelle un phagosome naissant subit une transformation radicale par des interactions bien orchestrées avec divers organites cellulaires et des compartiments dans le cytoplasme. Ce processus, qui est essentiel pour la fonction physiologique des cellules phagocytaires en dotant phagosomes avec leurs propriétés lytiques et bactéricides, culmine dans la fusion des phagosomes avec les lysosomes et la biogenèse des phagolysosomes qui est considéré comme la dernière étape critique de la maturation pour phagosomes. Dans ce rapport, nous décrivons une méthode basée imagerie des cellules vivantes pour l&#39;analyse qualitative et quantitative de la dynamique de lysosome pour phagosome livraison de contenu, ce qui est une caractéristique de phagolysosome biogenèse. Cette approche utilise des microbilles recouvertes d&#39;IgG comme un modèle pour phagocytose et molécules de dextran fluorophore conjugué comme sonde de fret lysosomale luminale, afin de suivre la livraison de contenu dynamique de lysosmal aux phagosomes en temps réel dans les macrophages vivants en utilisant l&#39;imagerie time-lapse et la microscopie confocale à balayage laser. Ici, nous décrivons en détail l&#39;arrière-plan, les étapes de préparation et de la mise en place, étape par étape expérimentale pour permettre un déploiement facile et précis de ce procédé à d&#39;autres laboratoires. Notre méthode décrite est simple, robuste, et surtout, peuvent être facilement adaptés à l&#39;étude des interactions phagosome et la maturation dans les différents systèmes et sous divers paramètres expérimentaux tels que l&#39;utilisation de différents types de cellules phagocytaires, des expériences de perte de fonction, différentes sondes, et particules phagocytaires.

La préparation correcte des cellules et les billes pour l&#39;imagerie est critique. Figure 1 montre le contour de l&#39;ensemencement, la sonde de chargement et les étapes de formation d&#39;image initiaux dans ce procédé, sur la base de notre protocole optimisé pour BMMS. Il est donc essentiel que les paramètres de protocole être testées et optimisées en fonction du type de cellules et des sondes qui doivent être utilisés. Après addition des billes recouvertes d&#39;IgG au...

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de capturer en temps réel le processus dynamique de maturation des phagosomes et de biogenèse des phagolysosomes dans les phagocytes. Ceci est réalisé en chargeant les compartiments lysosomaux des cellules avec un dextran marqué fluorescent pour permettre la visualisation des compartiments lysosomaux et le transfert de leur contenu luminal vers les phagosomes. Dans un deuxième temps, des microparticules sont ajoutées, qui servent de modèle phagocytaire.Ensuite, la livraison du matériel lysosomal vers les phagosomes est analysée à l'aide d'une imagerie en temps réel et d'un traitement numérique ultérieur des images. Afin de quantifier le processus de maturation des phagosomes, les résultats montrent l'effet de divers facteurs sur ce processus en fonction de l'acheminement du contenu lysosomal vers les phagosomes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'évaluation de la maturation des macrophages dans des cellules fixées, réside dans l'obtention d'un signal quantitatif présentant une haute résolution temporelle. Commencez par dissoudre la dextrane marquée par le rouge Texas de 70 kilodaltons ou Dex 70 kD dans du PBS à 20 milligrammes par millilitre et conservez des aliquotes à moins 20 degrés Celsius.Ensuite, diluez la solution mère de Dex 70 kD dans du milieu de culture cellulaire complet Docos, milieu de Eagle modifié ou DMEM à environ un milligramme par millilitre. Soniquez l'aliquote de brin DExT dans un bain à ultrasons pendant cinq minutes. Puis centrifugez la solution dans une microcentrifugeuse à vitesse maximale pendant cinq minutes afin d'éliminer tous les agrégats ou contaminants présents dans la solution.Déplacez soigneusement le SuperAgent dans un tube propre en évitant le culot au fond. Ensuite, diluez la solution à une concentration finale de travail de 20 microgrammes par millilitre dans un milieu de culture cellulaire complet. DMEM et filtration.Stérilisez la solution à l’aide d’un filtre monté sur seringue de 0,22 micromètre. Ensuite, ajoutez deux millilitres de macrophages murins dérivés de moelle osseuse à une concentration de 5 × 10⁴ cellules par millilitre. Dans du DMEM, placez les cellules dans une boîte en verre non revêtue avec fond en verre et incubez-les pendant au moins 12 heures à 37 °C dans une atmosphère tamponnée contenant 5 % de dioxyde de carbone.Pour assurer l'attachement et l'acclimatation après l'attachement, aspirez le milieu et ajoutez deux millilitres de DMEM DExT préchauffé dans la boîte en verre à fond plat, puis incubez les cellules pendant deux à huit heures après l'incubation. Lavez les cellules trois fois avec du DMEM complet préchauffé. Aspirez le milieu après le dernier rinçage et ajoutez deux millilitres de DMEM complet.Incubez les cellules pendant quatre à douze heures. Rincez ensuite les cellules avec du DMEM complet sans rouge de phénol préchauffé, puis ajoutez deux millilitres de DMEM complet filtré sans rouge de phénol au moins 30 minutes avant le début de l'acquisition d'images. Ensuite, portez un aliquot de suspension de betteraves enrobées d'IgG à 1 %, préparée comme décrit dans le protocole texte associé, à température ambiante.Soniquez la solution dans un bain à ultrasons pendant deux à trois minutes. Ensuite, sous une hotte de sécurité biologique de classe deux, ajoutez un à six microlitres de la suspension de billes aux cellules. Diffusez le nuage dense de billes en utilisant une pipette pour mélanger doucement la suspension dans la boîte en verre à fond plat.Ensuite, placez l'échantillon sous le microscope et focalisez-vous sur la région d'intérêt. Avant l'acquisition d'images en laps de temps, optimisez les paramètres, notamment le balayage, la vitesse, le grossissement et la résolution, afin de pouvoir capturer une image toutes les sept à vingt secondes.Ajustez les paramètres d'excitation et d'émission en fonction du système d'imagerie et des sondes utilisées, et optimisez-les afin d'éviter un blanchiment photo excessif. Ensuite, enregistrez la vidéo en lapse de temps et sauvegardez-la au format de fichier natif de votre microscope. Évitez d'exporter la vidéo dans des formats compressés tels que JPG ou PNG.Ensuite, lancez Fiji, une distribution d'ImageJ contenant un package de traitement d'image avec des menus d'outils réorganisés et des greffons natifs supplémentaires disponibles gratuitement. Téléchargez-le. Ouvrez le fichier dans Fiji et sélectionnez la vidéo à évaluer. Puis configurez les options, les filtres et les paramètres de mesure conformément au protocole écrit joint.Ensuite, examinez attentivement les images en notant l'instantané où un phagosome naissant pleinement formé apparaît et où la cupule acide F est fermée. Utilisez l'outil de sélection ovale pour délimiter une région d'intérêt (ROI) circulaire sur la bille internalisée. Veillez à ce que la sélection épouse étroitement le bord extérieur de la bille.Ensuite, allez dans analyser et cliquez sur mesurer pour exécuter la mesure. Le résultat s'affichera dans une fenêtre distincte intitulée résultats. Dans l'image suivante d'intérêt, ajustez la position de la zone d'intérêt au cas où la perle se serait déplacée et répétez la mesure, qui sera ajoutée à la liste dans la fenêtre des résultats.Chaque image analysée peut être identifiée en fonction de la valeur dans la colonne d'étiquette. Après avoir terminé la mesure de toutes les images pertinentes, copiez les valeurs de la colonne int den dans une application de feuille de calcul. La colonne int den représente les intensités de la zone sélectionnée.À l'aide de ces méthodes, des images nettes ont été obtenues de macrophages dérivés de moelle osseuse chargés avec les sondes à brin DExT. Cette image correspond au temps zéro, c'est-à-dire juste au moment où la cellule a terminé l'absorption de la microbille codée IgG indiquée ici. Les images présentées ont été colorisées artificiellement pour une meilleure visibilité et montrent le phagosome de zéro à 85 minutes après l'absorption.Le phagosome mesuré, la région d'intérêt (ROI), est délimité par une ligne en pointillés, et les instants de livraison et d'accumulation de la dextrane dans le phagosome sont indiqués par les flèches. Des graphiques ont ensuite été générés à partir de ces images et montrent une tendance temporelle claire de l'association du signal au phagosome au fil du temps. Ce graphique représente la moyenne de 10 phagosomes provenant des deux cellules illustrées ici.Bien que l'intensité absolue du signal varie souvent entre chaque phagosome analysé, la tendance temporelle est généralement très similaire. La livraison du Dex 70 KD aux phagosomes atteint un plateau entre 35 et 40 minutes après la phagocytose. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment évaluer la maturation des phagosomes à l'aide de la microscopie confocale en temps réel.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Cette vidéo présente une technique de microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) à haute résolution pour la visualisation en temps réel de la formation et de la fermeture des phagosomes pendant la phagocytose médiée par les macrophages de globules rouges (GR) opsonisés par les IgG fixés à la surface d’une boîte à fond de verre. Les macrophages étendent les pseudopodes autour des globules rouges et les engloutissent à l’intérieur des phagosomes, les détachant de la surface du...

Visualisation de la formation et de la fermeture des phagosomes par microscopie TIRF

Nous décrivons des méthodes de microscopie vidéo cellules vivantes...

Video Microscopy cellules vivantes de la phagocytose des pathogènes fongiques

Nous décrivons un dispositif expérimental permettant de visualiser avec une haute résolution sans précédent la formation et la fermeture de phagosomes en trois dimensions dans des macrophages vivants, en utilisant la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale. Il permet de surveiller la base de la cupule phagocytaire, les pseudopodes en extension, ainsi que le site précis de scission du phagosome.

&quot;Phagosome Clôture Assay&quot; pour visualiser Formation Phagosome en trois dimensions en utilisant la réflexion interne totale Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Nous décrivons une méthode pour mesurer la vitesse des phagosomes se déplaçant vers le centre cellulaire dans des cellules vivantes infectées avec ou sans le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) de type 1, en utilisant la microscopie confocale à fluorescence à disque rotatif pour identifier les cellules infectées par fluorescence et la microscopie à champ clair pour détecter les phagosomes.

Phagosome Migration et Velocity Mesurée en direct primaire des macrophages humains infectés par le VIH-1

Nous décrivons ici une technique basée sur le microscope pour visualiser et quantifier les cascades précoces d’événements au cours de la phagocytose d’agents pathogènes tels que les champignons Candida albicans et les particules de plus de 0,5 μm, y compris les billes recouvertes de zymosan et d’IgG.

Visualiser les premiers stades de la phagocytose

Nous présentons des méthodes pour évaluer la capacité phagocytaire des primaires macrophages dérivés de la moelle osseuse murines utilisant des débris de la myéline fluorescent étiquetés et coloration de gouttelettes de lipides intracellulaires.

In Vitro Phagocytose des débris de la myéline par les Macrophages dérivés de la moelle osseuse

Nous décrivons ici une méthode simple et rapide pour l’isolement de Salmonella typhimurium-contenant des phagosomes des macrophages en enduisant les bactéries avec biotine et streptavidine.

Isolement de Salmonella typhimurium-contenant des Phagosomes des Macrophages

Nous décrivons ici des méthodes à l’aide de microscopie confocale de rotation disque aux événements phagocytaires unique image de macrophages péritonéaux résident de souris. Les protocoles peuvent être étendues à d’autres cellules phagocytaires.

Time-lapse imagerie 3D de phagocytose par les Macrophages de souris

Le mécanisme associé à la phagocytose dans l’infection à Leishmania reste mal compris. Ici, nous décrivons des méthodes pour évaluer les événements précoces se produisant lors de l’interaction de Leishmania avec les cellules hôtes.

Étude de la phagocytose de Leishmania à l’aide de la microscopie confocale

Cette étude élucide le traitement phagocytaire des particules de Godanti Bhasma (GB) dans les cellules de mammifères, en caractérisant leur absorption cellulaire, la dynamique des vacuoles, l’acidification et la dégradation. Ces résultats font non seulement progresser notre compréhension des mécanismes fondamentaux de la phagocytose, mais établissent également la GB comme un système modèle prometteur pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Exploration des événements cellulaires séquentiels de la phagocytose déclenchée par Godanti Bhasma dans les cellules de mammifères

Découvrez la biogenèse du phagolysosome dans les macrophages en temps réel par imagerie à fluorescence. Cette méthode quantitative offre une haute résolution temporelle pour étudier la maturation des phagosomes.

Étude de phagolysosome biogenèse dans les macrophages en direct

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