Name: Synthèse dune protéine artificielle induite par une intéine Hydrogel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 6 s
Description: Découvrez la synthèse d'un hydrogel protéique stable par réaction de trans-épissage d'intéines divisées. Cette méthode permet l'immobilisation de protéines fonctionnelles pour des applications biotechnologiques.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr David Tirrell (Caltech) pour son aimable don du plasmide pQE9 AC 10 ATRP 12, le Dr Tom Muir (Université de Princeton) pour son aimable don du plasmide KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Dr Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Japon) pour son aimable don du plasmide PET30-ACTU-Astuce1 10, et le Dr Jay D. Keasling (UC Berkley) pour son aimable don du plasmide pJD757 13 . Ce travail a été financé en partie par la National Science Foundation CARRIÈRE, US Air Force PIJ et de recherche avancée Hackman Norman.

Une. Construction des plasmides REMARQUE: Tous les gènes ont été amplifiés dans des réactions de PCR standard utilisant Phusion haute fidélité ADN polymérase selon les spécifications du fabricant. Les amorces utilisées pour le clonage ont été décrits précédemment 9. Toutes les constructions sont énumérés dans le tableau 1. <ol><li> Pour générer ACTU-NpuN (N, tableau 1): <ol><li> Amplifier par PCR des gènes de l&#39;ACTU et NpuN de plasmides PET30-ACTU-Astuce1 10 et KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, respectivement, en utilisant les amorces appropriées. </li><li> Digérer ces fragments avec les enzymes de restriction appropriées et insérer séquentiellement ces fragments dans le vecteur pET26b entre le promoteur T7 et un 6xHistidine tag C-terminal pour générer N (figure 2A). </li></ol></li><li> Pour générer NpuC-S-ACTU (C, tableau 1): <ol><li> Amplifier par PCR NpuC, l&#39;ACTU et S fragmentationt [AG 3 (PEG)] 10 à partir du plasmide KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, PET30-ACTU-Astuce1 10 et pQE9 AC 10 ATRP 12, respectivement, en utilisant les amorces appropriées. </li><li> Digérer ces fragments avec les enzymes de restriction appropriées et insérer séquentiellement ces fragments dans le vecteur pET26b entre le promoteur T7 et un 6xHistidine C-terminale de générer C (figure 2B). </li></ol></li><li> Pour générer NpuC-S-SH3 lig-ACTU (C-SH3 lig, tableau 1): <ol><li> Amplifier par PCR utilisant des amorces contenant ACTU une lig SH3 (PPPALPPKRRR) et une liaison flexible (GGGGS) 2 pour générer fragment SH3 lig-ACTU. </li><li> Remplacer le gène de l&#39;ACTU de C avec un fragment de SH3 lig-ACTU. </li></ol></li><li> Pour générer SH3-GFP (tableau 1): <ol><li> Amplifier le gène SH3 de plasmide pJD757 13 en utilisant laamorces appropriées. </li><li> Fusionner ce fragment avec le gène de la GFP et l&#39;insérer dans le vecteur pET26b entre le promoteur T7 (figure 2C) et une 6xHistidine tag C-terminal. </li></ol></li></ol> 2. Expression de la protéine <ol><li> Transformer 50 ul d&#39;chimiquement compétente Escherichia coli BL21 (DE3) par le plasmide d&#39;expression approprié. </li><li> Après transformation, diluer en série de ces cellules, et de la plaque sur les Luria-Bertani (LB) / plaques de gélose contenant 50 ug / ml de kanamycine. </li><li> Incuber les plaques contenant des cellules transformées à 37 ° C pendant environ 15 heures. </li><li> Après incubation, choisir une plaque qui contient 50-100 colonies et la suspension de toutes les colonies dans 5 ml de bouillon LB. </li><li> Transfert suspension à 1 L de bouillon LB contenant de la kanamycine (50 pg / ml) et la culture de cellules à 37 ° C avec agitation à 250 tours par minute. Surveillance de l&#39;absorbance à 600 nm (DO 600). Cultiver la culture jusqu&#39;à DO600 ~ 0,8. <ol><li> C et C-SH3 lig, induire l&#39;expression de protéine par addition d&#39;isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à la culture (1 mM de concentration finale) et incuber la culture à 37 ° C pendant 4 heures avec une agitation à 250 tours par minute. </li><li> Pour les N-GFP et SH3, refroidir la culture à ~ 18 ° C en plongeant le flacon de culture dans un bain d&#39;eau glacée pendant ~ 5 min. Induire l&#39;expression de protéine par addition d&#39;IPTG à la culture (concentration finale 1 mM) et incuber la culture à 18 ° C pendant 14 à 18 heures avec une agitation à 250 tours par minute. </li></ol></li><li> Après expression de la protéine, centrifuger la culture à 6000 g pendant 20 min à 4 ° C pour recueillir le culot. culot cellulaire de magasin à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 3. Protein Purification <ol><li> La purification du N (conditions dénaturantes) <ol><li> les culots de cellules de remettre en suspension dans du tampon A (tableau 2) à 10 ml / g de culot humide. </li><li> Immersenvoyer la suspension de granulés dans un bain d&#39;eau glacée et de rompre les cellules par traitement aux ultrasons (10 ampères, avec une impulsion de s et 6 s pause pendant 1 min). </li><li> Centrifuger le lysat à 16 000 x g pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Jeter le surnageant. Reprendre le culot dans du tampon DA (contenant 8 M d&#39;urée) et centrifuger la suspension à 16 000 xg pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Passez le surnageant à travers une colonne de 5 ml d&#39;acide Ni-nitrilotriacétique (NTA) préalablement équilibrée avec DA tampon. </li><li> Laver la colonne avec 30 ml de tampon DA supplémenté avec 45 mM d&#39;imidazole. Éluer la protéine purifiée en utilisant 20 ml de tampon DA supplémenté avec 150 mM d&#39;imidazole. </li><li> Réduire la concentration d&#39;urée dans l&#39;échantillon de protéine à &lt;1 mM, soit par l&#39;une des méthodes suivantes données dans 3.1.7.1 3.1.7.2 ou: <ol><li> Dialyser la protéine dans du tampon DPBS (tableau 2) à 4 ° C pendant une nuit en utilisant des tubes avec &lt;20 kDa coupure. </li><li> Centrifugeuse purifié la protéine dans un 30 &amp; #160; kDa colonne de centrifugation ultra-filtration à 2800 x g, 4 ° C jusqu&#39;à ce que le volume est inférieur à 1 ml. Ajouter 14 ml de tampon DPBS à la colonne de diluer l&#39;échantillon de protéine. Répétez la centrifugation / dilution étapes trois fois. </li></ol></li><li> Après l&#39;échange de tampon, ajouter du dithiothréitol (DTT) à la protéine purifiée (finale 2 mM) et on concentre la protéine à ~ 100 mg / ml par centrifugation à travers une colonne de centrifugation ultra-filtration de 30 kDa à 2800 x g, 4 ° C. </li><li> Aliquoter la protéine concentré et conserver à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Purification de C et C-SH3 lig (état natif) <ol><li> les culots de cellules de remettre en suspension dans du tampon B (pH 6,0) (Tableau 2) complété avec un inhibiteur de protéase 1x cocktail à 10 ml / g de culot humide. Utilisation tampon acide pour réduire au minimum la dégradation protéolytique de la protéine cible. </li><li> Perturber suspension cellulaire par sonication comme décrit au paragraphe 3.1.2. Centrifuger les lysmangé à 16 000 g pendant 20 min à 4 ° C et garder le surnageant. </li><li> Passer le lysat soluble à travers une colonne Ni-NTA de 5 ml équilibrée au préalable avec du tampon B. </li><li> Laver la colonne avec du tampon B supplémenté avec 45 mM d&#39;imidazole, et éluer la protéine cible dans 20 ml de tampon B supplémenté avec 150 mM d&#39;imidazole. </li><li> C, passez à l&#39;étape 3.2.6. C-SH3 lig, procéder à une étape de purification par échange d&#39;ions supplémentaires pour éliminer la protéine partiellement dégradée comme indiqué dans les étapes 3.2.5.1 à 3.2.5.3 <ol><li> Réduire la concentration de NaCl dans C-SH3 lig &lt;1 mM suivant la procédure décrite au point 3.1.7. </li><li> Charger la protéine cible sur un échangeur d&#39;anions ml perlé colonne de la matrice d&#39;agarose à 5 préalablement équilibrée avec du tampon phosphate de sodium (50 mM, pH 7,0). </li><li> Éluer la protéine cible à partir de la colonne par l&#39;exécution d&#39;un gradient à partir d&#39;une solution contenant 10 mM Tris-HCl pH 8,0 buffer à une solution contenant le même tampon additionné de NaCl 1 M. Prélever des échantillons au cours de l&#39;élution de la protéine et de mise en commun des échantillons avec la plus grande pureté sur la base de sodium dodécyl sulfate polyacrylamide L&#39;électrophorèse sur gel (SDS-PAGE). </li></ol></li><li> Échanger le tampon de la protéine purifiée dans du tampon DPBS, comme décrit dans 3.1.7. </li><li> Ajouter du DTT pour la protéine purifiée (concentration finale de 2 mM) et on concentre la protéine à ~ 100 mg / ml en utilisant une colonne de centrifugation ultra-filtration de 30 kDa comme décrit dans 3.1.8. Aliquote et magasin concentrés de protéines à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> La purification de la GFP-SH3 <ol><li> culots cellulaires Remettre en suspension à l&#39;aide d&#39;un tampon A à 10 ml / g de culot humide. </li><li> Perturber culot suspension par sonication comme décrit au paragraphe 3.1.2. </li><li> Centrifuger le lysat à 16 000 x g pendant 20 min à 4 ° C et collecter le surnageant. </li><li> Passer le surnageant (lysat soluble) à travers une colonne Ni-NTA de 5 ml équilibrée au préalable avecTampon A. </li><li> Laver la colonne avec 30 ml de tampon A additionné de 45 mM d&#39;imidazole. Éluer la protéine purifiée en utilisant 20 ml de tampon A additionné de 150 mM d&#39;imidazole. </li><li> Échanger le tampon de la protéine purifiée dans du tampon DPBS utilisant une approche similaire à celle décrite dans 3.1.7 et concentrer la protéine de ~ 150 mg / ml en utilisant une colonne de centrifugation ultra-filtration de 30 kDa comme décrit dans 3.1.8. </li><li> Aliquote et magasin de protéines purifiées à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Analyse SDS-PAGE des échantillons purifiés contenant ACTU <ol><li> Diluer chaque protéine purifiée dans de l&#39;eau bidistillée pour réduire la concentration de NaCl à ~ 1 mM. A cette concentration de NaCl, la plupart des protéines ACTU trimères exploités en tant que monomères sur les gels SDS-PAGE. </li><li> Mélanger les échantillons avec un tampon échantillon SDS 2x (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% glycerol, 10% p / v de SDS, 0,1% p / v bromo-phénol bleu, 2% β-mercaptoéthanol), incubées à 95 ° C pendant 5 min. </li><li> Chargez le samples sur un gel SDS-PAGE à 12%. Effectuer l&#39;électrophorèse à une tension constante de 200 V pendant environ 50 min. </li><li> Observer les protéines dans les gels par coloration au bleu brillant de Coomassie R250 suivant les protocoles standards (Figure 1C). </li></ol></li></ol> 4. Hydrogel Formation REMARQUE: les hydrogels échantillons effectuées dans cette étude contiennent 1,6 mM de chaque bloc de construction d&#39;hydrogel, sauf indication contraire. Cette concentration de protéine donne un hydrogel souple et stable. ATTENTION: azide de sodium (NaN3) est ajouté à l&#39;hydrogel à une concentration finale de 0,5% p / v pour empêcher la contamination bactérienne. NaN3 est très toxique et doit être manipulé avec un soin extrême, comme indiqué dans la fiche de données de sécurité. <ol><li> Calculer le volume de chacune des protéines concentrées nécessaires pour atteindre une concentration finale de 1,6 mM dans un échantillon de 100 ul hydrogel. Par exemple: Concentration de N:100 mg / ml Poids moléculaire de N: 26,3 kDa (voir le tableau 1) Concentration 100 pi désiré: Volume désiré 1,6 mM <img alt="" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" width="600" /></li><li> Pour faire un pi hydrogel 100 (1,6 mM), mélange C (x pi, volume calculé d&#39;après 4,1) avec 5% de NaN 3 (10 ul), 100 mM de DTT (5 de pi) et N (y ul, volume calculé d&#39;après 4.1) à l&#39;intérieur d&#39;un flacon de 2 ml en verre. </li><li> Ajouter tampon DPBS ((85 - x - y) ul) dans le flacon pour obtenir un volume final de 100 ul, et mélanger tous les composants manuellement par l&#39;intermédiaire d&#39;un mouvement de tourbillonnement au moyen d&#39;un embout de pipette. Remarque: La solution devient très visqueuse lors du mélange. </li><li> Centrifuger le mélange pendant 2 min à 8000 xg pour éliminer les bulles d&#39;air. </li><li> Incuber le mélange à la chambretempérature pendant une nuit pour permettre à la réaction de trans-épissage d&#39;intéine pour atteindre l&#39;achèvement. Confirmez formation d&#39;hydrogel en tournant le tube à l&#39;envers. Les protéines ne seront pas versés si un hydrogel est formé. </li><li> Estimer le rendement de trans-épissage d&#39;intéine en vérifiant des échantillons (0,5 pi chacun) prélevés avant et après l&#39;étape 4.2 étape 4.5 sur un gel SDS-PAGE, tel que décrit au point 3.4 (figure 1C). </li></ol> 5. Immobilisation de la GFP via accueil Protein (DP) et station d&#39;accueil pour Peptide (DSP) Interaction <ol><li> Pour effectuer une 50 ul GFP-hydrogel fonctionnalisé (1,2 mM), combiner C-SH3 lig (x pi, calculé selon 4.1) et SH3-GFP (y ul, calculé selon 4.1) à 1:01 dans un rapport molaire de 1,7 ml microtube et incuber le mélange à la température ambiante pendant 30 min. </li><li> Ajouter 5% de NaN3 (5 pi), 100 mM de DTT (2.5 pi), (42,5 - x - &lt;em&gt; y) ul DPBS à la même tube. Ajouter N (y ul, calculé selon l&#39;4,1) pour atteindre un rapport molaire de 1:1 de N et C-SH3 lig. Mélanger l&#39;échantillon en utilisant une pointe de pipette par un mouvement tourbillonnant. </li><li> Centrifuger le mélange à 8000 g pendant 2 min et laisser incuber le mélange à la température ambiante pendant une nuit dans l&#39;obscurité. Un hydrogel encapsulation formes SH3-GFP pendant l&#39;incubation. </li></ol> 6. L&#39;utilisation de mM hydrogel 1.6 comme un échafaudage d&#39;immobilisation pour la réaction enzymatique dans un solvant organique <ol><li> Utiliser la HRP comme enzyme de modèle. Préparer une solution stock de HRP (28 mg / ml ou 0,63 mM) dans du DPBS. </li><li> Pour faire un hydrogel 30 ul (1,6 mM) piégeant HRP, combiner C (x pi, calculé selon 4.1) avec HRP (2 ul), 5% de NaN3 (3 pi) et du DTT (1,5 ul de 100 mM) dans un 1,7 ml tube de centrifugation. </li><li> Ajouter N (y &lt;/ Em&gt; pi, calculé conformément au point 4.1) et DPBS (23,5 - x - y) ul. Mélanger avec une pointe de pipette avec un mouvement tourbillonnant. </li><li> Centrifuger le mélange à 8000 g pendant 2 min et incuber à température ambiante pendant une nuit. ATTENTION: les régents utilisés pour le dosage de l&#39;activité suivante sont hautement toxiques. Utilisez les recommandations de sécurité spécifiques par les fiches de données de sécurité correspondantes. </li><li> Par réaction enzymatique, immerger l&#39;hydrogel dans 1 ml de cocktail de réaction contenant du N, N-diméthyl-p-phénylène diamine (5,8 mM), du phénol (5,8 mM) et de l&#39;hydroperoxyde de tert-butyle (2,9 mM) dans du n-heptane 14. Perturber le gel manuellement en utilisant un embout de pipette pour augmenter la zone de surface de contact de l&#39;hydrogel et le solvant. </li><li> Détecter la HRP produit, un colorant du type indophénol, par mesure de l&#39;absorbance optique des échantillons prélevés à des moments différents à 546 nm dans un lecteur de plaque (Figure 5). </li> &lt;/ Ol&gt;

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</ol>

Aucun intérêt financier concurrentes existent.

Dans ce travail, nous avons démontré la synthèse d&#39;un hydrogel de protéine induite par une intéine très stable. L&#39;utilisation d&#39;une fraction de l&#39;hydrogel permet intéine être conditionnellement formée en réponse au mélange de deux composants en phase liquide. Plus précisément, la scission de façon covalente relie intéine deux blocs de construction en phase liquide par une réaction de trans-épissage, ce qui donne une unité de polypeptide flanqué par des unités de réticulation qui à son tour, auto...

Hydrogels entièrement en protéines transportent le potentiel de faire progresser considérablement domaines aussi divers que l&#39;ingénierie tissulaire, l&#39;administration de médicaments et biofabrication 1. Ils offrent des avantages plus hydrogels traditionnels de polymères synthétiques dont la biocompatibilité et la possibilité de soutenir de manière non invasive l&#39;incorporation de protéines globulaires bioactifs. Dans ce travail, nous décrivons le développement d&#39;un nouveau hydrogel protéique formé par l&#39;intermédiaire d&#39;une fraction de protéine induite par une intéine réaction de trans-épissage et de son application comme un échafaudage de protéines d&#39;immobilisation (figure 1). Les blocs de construction pour cet hydrogel sont deux copolymères à blocs de protéines, chacune comprenant le fragment N-ou C-terminale d&#39;une intéine dissociée (IN et IC) et une sous-unité d&#39;une protéine multimérique de réticulation. L&#39;intéine DnaE de Nostoc punctiforme (Npu) a été utilisé comme le 2,3 intéine dissociée et une petite protéine trimérique (12 kDa) ACTU de Pyrococcus horikoshii &lt;/ Em&gt; a été utilisé comme le 4,5 de protéine de réticulation. Différents agents de réticulation sont reliés par le biais réaction de trans-épissage d&#39;intéine catalysée, ce qui conduit à la formation d&#39;un réseau de protéines hautement réticulé (hydrogel). Npu intéine a été choisi en raison de sa cinétique de réaction rapide (t 1/2 = 63 sec) et le rendement de trans-épissage élevé (près de 80%) 2,3. La protéine de l&#39;ACTU a été choisi comme l&#39;agent de réticulation en raison de sa grande stabilité. ACTU trimères ont une température de dénaturation de près de 150 ° C et de conserver la structure quaternaire trimérique dans des solutions contenant pas moins de 5 M de chlorhydrate de guanidine 4,6. Depuis l&#39;échange d&#39;unité entre les différents agents de réticulation est un contributeur majeur de la surface hydrogel physique érosion 7, la très forte interaction entre la sous-unité dans l&#39;ACTU devrait décourager de tels échanges de sous-unités, conduisant à un hydrogel plus stable. L&#39;un de ces blocs de construction contient également un peptide S-fragment hautement hydrophile que le mi-bloc pour faciliter l&#39;eaurétention 8. Le mélange des deux éléments de base d&#39;hydrogel initie une réaction de trans-épissage entre l&#39;IN et IC fragments d&#39;intéine, la génération d&#39;une chaîne polypeptidique plus longtemps avec des agents de reticulation aux deux extrémités. Les agents de reticulation à partir de plusieurs de ces unités moléculaires interagissent les uns avec les autres, formant un réseau d&#39;hydrogel hautement réticulé (Figure 1A). Un «peptide station d&#39;accueil&quot; spécifique (DSP) est incorporé dans l&#39;un des blocs de construction d&#39;hydrogel pour faciliter l&#39;immobilisation stable d&#39;une &quot;protéine d&#39;amarrage» (DP) à marquage protéine cible dans l&#39;hydrogel. L&#39;utilisation d&#39;une intéine dissociée de servir de médiateur de l&#39;ensemble de l&#39;hydrogel non seulement fournit une flexibilité supplémentaire pour la synthèse de protéines de l&#39;hydrogel, mais permet également à haute densité, le chargement uniforme de la protéine cible dans l&#39;ensemble de l&#39;hydrogel, comme les protéines cibles sont chargées avant la formation de l&#39;hydrogel. La protéine hydrogel intéine médiation est très stable dans une solution aqueuse avec peu ou pas d&#39;érosion détectable après 3 mois à température ambiante. La stabilité est maintenue dans une large gamme de pH (6-10) et de températures (4-50 ° C), et l&#39;hydrogel est également compatible avec des solvants organiques. Cet hydrogel est utilisé pour l&#39;immobilisation de deux protéines globulaires: la protéine fluorescente verte (GFP) et de la peroxydase de raifort (HRP). Hydrogel emprisonner cette dernière protéine est utilisée pour réaliser la biocatalyse dans un solvant organique.

<table><tbody><tr><td> Phusion High Fidelity DNA polymérase </td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td> </td></tr><tr><td> Compétent Escherichia coli BL21 (DE3) </td><td>New England BioLabs</td><td>C2527I</td><td> </td></tr><tr><td> Luria Bertani </td><td>VWR</td><td>90003-350</td><td> </td></tr><tr><td> Bacto Agar Media </td><td>VWR</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Sulfate de kanamycine</td><td>VWR</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> IPTG </td><td>VWR</td><td>EM-5820</td><td> </td></tr><tr><td> imidazole </td><td>VWR</td><td>EM-5720</td><td> </td></tr><tr><td> Urée </td><td>VWR</td><td>EM-9510</td><td> </td></tr><tr><td> dithiothréitol (DTT) </td><td>Fisher</td><td>BP172-5</td><td> </td></tr><tr><td> Cocktail d’inhibiteurs de protéase </td><td>Roche Applied Science</td><td>11836153001</td><td> </td></tr><tr><td> DPBS </td><td>VWR</td><td>82020-066</td><td> </td></tr><tr><td> Bleu brillant R </td><td>Acros Organics</td><td>A0297990</td><td> </td></tr><tr><td> azoture de sodium </td><td>Fisher</td><td>AC190380050</td><td> attention, hautement toxique </td></tr><tr><td> Raifort peroxydase </td><td>Sigma</td><td>P8125-5KU</td><td> </td></tr><tr><td>N,N-diméthyl-p-phénylène diamine</td><td></td>Fisher<td>AC408460250</td><td> Attention, hautement toxique </td></tr><tr><td> phénol </td><td>Fisher</td><td>AC149340500</td><td> Attention, hautement toxique </td></tr><tr><td>hydroperoxyde de tert-butyle</td><td></td>Fisher<td>AC180340050</td><td> Attention, hautement toxique</tr><tr><td> > n-heptane </td><td>Acros Organics</td><td>120340010</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td> Shaker/Incubator </td><td>Fisher Scientific</td><td>Max Q 6000</td><td> < </td></tr> p <tr><td> >Centrifugeuse </td><td>Sorvall</td><td>RC 6</td><td> </td></tr><tr><td> Sonicator </td><td>QSonica</td><td>Misonix 200</td><td> </td></tr><tr><td> Tubes d’ultrafiltration </td><td>Amicon Ultra</td><td>UFC903024</td><td> </td></tr><tr><td>  ; Colonne HisTrap haute performance Ni Sepharose </td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5248-01</td><td> </td></tr><tr><td> HiTrap SP Colonne d’échange d’ions Sepharose FF </td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5156-01</td><td> </td></tr><tr><td> Lecteur de plaques </td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>SpectraMax Gemini EM</td><td> </td></tr></tbody></table>

synthèse d&#39;une protéine artificielle induite par une intéine hydrogel

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Nous présentons la synthèse d&#39;un hydrogel de protéine hautement stable à médiation par une réaction de trans-épissage d&#39;intéine divisée catalysée par la protéine. Les éléments constitutifs de cet hydrogel sont deux copolymères à blocs de protéines contenant chacun une sous-unité d&#39;une protéine trimérique qui sert d&#39;agent de réticulation et une moitié d&#39;une intéine dissociée. Un enroulement aléatoire hautement hydrophile est insérée dans l&#39;un des copolymères séquences pour la rétention d&#39;eau. Le mélange des deux copolymères séquences de la protéine déclenche une réaction de trans-épissage d&#39;intéine, ce qui donne une unité de polypeptide avec des agents de réticulation à chaque extrémité qui rapidement s&#39;auto-assemble en un hydrogel. Cet hydrogel est très stable dans les conditions acides et basiques, à des températures allant jusqu&#39;à 50 ° C, et dans des solvants organiques. L&#39;hydrogel rapidement des réformes après la rupture due au cisaillement. Constitution d&#39;une &quot;station d&#39;accueil peptide&quot; dans le bloc de construction d&#39;hydrogel permet l&#39;incorporation pratique de «protéine d&#39;accueil&quot; marqués protéines cibles.L&#39;hydrogel est compatible avec un milieu de croissance de culture de tissus, favorise la diffusion des molécules de 20 kDa, et permet l&#39;immobilisation de protéines globulaires bioactifs. L&#39;application de l&#39;hydrogel de protéine induite par une intéine en tant que biocatalyseur-solvant organique compatible avec l&#39;encapsulation a été démontrée par l&#39;enzyme de peroxydase de raifort et corroborer son activité.

Un schéma pour la formation induite par une intéine de protéines d&#39;hydrogel est présentée en figure 1A. Les blocs de construction de l&#39;hydrogel sont la protéine copolymères ACTU-NpuN (N) et NpuC-S-ACTU (C) (figure 1A, tableau 1). NpuN / C sont les N-/C-fragments du DnaE naturellement intéine dissociée de Nostoc punctiforme (Npu). L&#39;ACTU est une protéine trimérique stable de Pyrococcus horikoshii 4,5. Le mélange purifié de N et de C, en présence de l&#39;a...

Nous présentons la synthèse d&#39;un hydrogel split-induite par une intéine de protéines. Les éléments constitutifs de cet hydrogel sont deux copolymères de protéines contenant chacun une sous-unité d&#39;une protéine trimérique qui sert d&#39;agent de réticulation et une moitié d&#39;une intéine dissociée. Le mélange des deux copolymères de protéine déclenche une réaction de trans-épissage d&#39;intéine, ce qui donne une unité de polypeptide qui s&#39;auto-assemble en un hydrogel. Cet hydrogel est très stable au pH et à la température, compatible avec des solvants organiques, et incorpore facilement les protéines globulaires fonctionnels.

Synthèse d&#39;une protéine artificielle induite par une intéine Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

L'objectif général de cette procédure est de synthétiser un hydrogel protéique hautement stable pouvant être utilisé comme échafaudage général pour l'immobilisation de protéines. Cela est réalisé en synthétisant d'abord deux blocs de construction d'hydrogel protéique dans un hôte bactérien. Chaque bloc de construction contient une sous-unité d'une protéine chimérique servant de réticulateur et une moitié de l'ène NPU divisé.Ces protéines sont ensuite purifiées par chromatographie d'affinité dans une deuxième étape. Les blocs constitutifs protéiques purifiés sont mélangés, déclenchant des réactions de splicing *trans* qui reconstituent un polypeptide s'auto-assemblant, flanqué de réticulateurs induisant la formation d'un hydrogel. Cet hydrogel est hautement stable en solution grâce à l'incorporation d'un motif de liaison approprié dans le bloc protéique.Les copolymères permettent l'incorporation pratique et spécifique de protéines fonctionnelles dans les blocs constitutifs de l'hydrogel, conduisant à la formation d'un hydrogel qui immobilise les protéines ; ces dernières présentent un faible taux de lessivage sur une période de trois semaines à température ambiante. Enfin, les enzymes immobilisées dans cet hydrogel protéique sont protégées contre la dénaturation par les solvants organiques. Ainsi, cet hydrogel peut également servir de bioréacteur pour la synthèse organique.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes de fixation stable des protéines, notamment celles faisant intervenir la réticulation de la surface LI ou la liaison avec des échafaudages solides, l'encapsulation d'enzymes dans des supports poreux ou la réticulation inter-enzymes, réside dans la capacité d'immobiliser de façon stable des protéines cibles dans un environnement poreux et fortement hydraté, sans aucune modification chimique de la chaîne latérale de la protéine. Cette technologie permet également l'assemblage de plusieurs enzymes d'une même voie métabolique selon un arrangement tridimensionnel prédéterminé, ce qui peut faciliter le transfert de substrats entre les enzymes. Avant de commencer cette procédure, produisez les deux copolymères protéiques N et C par construction de plasmide à l'aide de techniques d'ADN recombinant, suivie d'une expression protéique et de purification chez E. coli B 21 de trois, puis resuspendez les pastilles cellulaires dans le tampon A à raison de 10 millilitres par gramme de pastille humide.Ensuite, plonger la suspension du culot dans un bain d’eau glacée et lyser les cellules par sonication à 10&nbsp;A, avec une impulsion d’une seconde et une pause de six secondes, pendant une minute. Centrifuger le lysat à 6&nbsp;000&nbsp;×g pendant 20&nbsp;minutes à 4&nbsp;°C. Après avoir retiré le tube de la centrifugeuse, éliminer le surnageant&nbsp;S et resuspendre le culot dans le tampon&nbsp;DA après une nouvelle centrifugation dans les mêmes conditions qu’auparavant, puis faire passer le surnageant à travers une colonne NTA de 5&nbsp;mL préalablement équilibrée avec le tampon&nbsp;DA, en utilisant un système de chromatographie à basse pression.Ensuite, lavez la colonne avec 30 millilitres de tampon DA supplémenté en 45 millimolaire d'ole, puis élué le protéine purifiée à l’aide de 20 millilitres de tampon DA supplémenté en 150 millimolaire d'ole. Transférez la protéine purifiée dans un tube d'ultracentrifugation contenant une colonne de filtration ultra-concentrateur de 30 kilodaltons. Centrifugez l'échantillon à 2 800 × g et à 4 degrés Celsius jusqu'à ce que le volume soit inférieur à un millilitre.Lorsque l'opération est terminée, ajouter 14 millilitres de tampon DPBS sur la colonne afin de diluer l'échantillon protéique. Répéter les étapes de centrifugation et de dilution trois fois supplémentaires après l'échange de tampon, puis ajouter du DTT à la protéine purifiée pour obtenir une concentration finale de deux millimolaire. Ensuite, concentrer la protéine à environ 100 milligrammes par millilitre par centrifugation à travers une colonne à filtration ultrafine de 30 kilodaltons, à 2 800 ×g et à quatre degrés Celsius pendant environ 45 minutes à une heure.Pour préparer un mélange d'hydrogel de 100 microlitres, mélanger 42 microlitres d'une solution mère à 100 milligrammes par millilitre de C avec 10 microlitres d'azoture de sodium à 5 %, 5 microlitres de DTT à 100 millimolaire et 42 microlitres d'une solution mère à 100 milligrammes par millilitre de N. Dans un flacon en verre de deux millilitres, ajouter un microlitre de tampon DPBS au flacon afin d'obtenir un volume final de 100 microlitres, puis mélanger manuellement tous les composants par un mouvement de rotation à l'aide d'une pipette. Après une centrifugation du mélange pendant deux minutes à 8 000 ×g, l'incuber à température ambiante toute la nuit pour permettre la complétion de la réaction de trans-épissage ENE. Ensuite, confirmer la formation de l'hydrogel en retournant le tube afin d'obtenir 50 microlitres d'un hydrogel fonctionnalisé à la GFP à 1,2 millimolaire.Combiner 17 microlitres d'une solution mère contenant 100 milligrammes par millilitre de ligand CSH trois et 9 microlitres d'une solution de SH 3G FP à 230 milligrammes par millilitre dans un rapport molaire un pour un dans un tube de centrifugeuse de 1,7 millilitre, puis incuber le mélange à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, ajouter 5 microlitres d'azoture de sodium à 5 %, 2,5 microlitres de DTT à 100 millimolaire et 0,5 microlitre de DPBS dans le même tube. Puis ajouter 16 microlitres de N pour obtenir un rapport molaire un pour un entre N et le ligand CSH trois, et mélanger l'échantillon par un mouvement de vortex à l'aide d'une pipette. Centrifuger le mélange à 8 000 ×g pendant deux minutes.Lorsque l'opération est terminée, incuber le mélange à température ambiante pendant la nuit, à l'abri de la lumière, afin de former un hydrogel et d'encapsuler la SH 3G FP. Pour une application supplémentaire, préparer une solution mère de peroxydase de raifort (HRP) à 0,63 millimolaire dans du DPBS afin d'obtenir 30 microlitres d'un hydrogel à 1,6 millimolaire piégeant l'HRP : combiner 12 microlitres d'une solution mère de C à 100 milligrammes par millilitre avec 2 microlitres d'HRP, 3 microlitres d'azoture de sodium à 5 % et 0,5 microlitre de DTT à 300 millimolaire dans un tube de centrifugeuse de 1,7 millilitre. Ajouter 12 microlitres d'une solution de N à 100 milligrammes par millilitre et 0,5 microlitre de DPBS, puis mélanger la solution par un mouvement de rotation à l’aide d’une pointe IPE. Après centrifugation du mélange à 8 000 ×g pendant deux minutes, incuber celui-ci à température ambiante pendant la nuit.Pour la réaction enzymatique, immergez l'hydrogel dans un millilitre d'un mélange réactionnel contenant 5,8 millimolaire de NN diméthyl PPH phénol diamine, 5,8 millimolaire de phénol et 2,9 millimolaire de t-butyl hydroperoxyde dans du n-heptane. Perturbez manuellement le gel à l’aide d’une pointe de pipette afin d’augmenter la surface de contact entre l’hydrogel et le solvant. Détectez le produit de la peroxydase (HRP) et le colorant de type indophénol en prélevant des échantillons du solvant à différents intervalles et en mesurant l’absorbance optique à 546 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaques. Le mélange des protéines purifiées N et C en présence de l’agent réducteur DTT induit la formation d’une troisième protéine, le produit ligaturé J individuellement. Les briques constitutives de l’hydrogel, n NC, existent sous forme de fluides visqueux ; leur mélange donne un matériau semi-solide transparent qui reste au fond d’un flacon en verre après retournement, ce qui indique la formation d’un hydrogel.Ce gel hydrophobe protéique médié par l'ène présente une grande stabilité en solution. Il y a peu ou pas de perte du squelette de gel hydrophile réticulé après 21 jours à 22 degrés Celsius dans le tampon DPBS. Étant donné que la quantité totale de protéine libérée dans le tampon DPBS dépasse légèrement la quantité théorique de l'ène épissé à partir du gel hydrophile, la cytométrie en milieu dense a révélé que, lors de la formation du gel hydrophile, les réactions d'épissage trans étaient d'environ 80 % efficaces.L'analyse par électrophorèse sur gel SDS a montré que de faibles quantités seulement du produit d'épissage trans étaient présentes dans le tampon entourant l'hydrogel, confirmant que la perte du réseau hydrogel réticulé par érosion est minime. La principale protéine présente dans le tampon entourant l'hydrogel est l'inteine excisée.Aucun signe visible d'érosion n'a été observé sur un hydrogel intact, immergé dans une solution aqueuse à température ambiante pendant plus de trois mois. L'hydrogel est également très stable à 37 degrés Celsius ainsi que dans des tampons acides et basiques. Pour faciliter l'immobilisation des protéines, une protéine et son ligand peptidique ont été utilisées afin d'ancrer les protéines d'intérêt dans l'échafaudage d'hydrogel.Nous avons choisi la protéine SH3, un domaine d'homologie SAR3 provenant de la protéine d'adaptation CRK, comme protéine d'ancrage destinée à être fusionnée à une protéine d'intérêt, tandis que son ligand sert de peptide d'ancrage pour l'incorporation dans la matrice hydrogel. Ce couple d'interaction a été sélectionné en raison de sa taille moléculaire relativement réduite et de son affinité élevée. Un ligand SH3 a été inséré entre NPUC et cut A afin de former CSH3 ligand.La protéine S SH trois a été fusionnée au terminus C-terminal d'une protéine cible mod&egrave;le de type globulaire, la GFP. Le proc&eacute;d&eacute; d&eacute;crit dans le protocole permet d'obtenir un hydrogel contenant 1,2 millimolaire de blocs de construction du r&eacute;seau polym&egrave;re d'hydrogel obtenus par &eacute;pissage trans et 1,2 millimolaire de GFP. L'hydrogel contenant la GFP a pr&eacute;sent&eacute; une stabilit&eacute; similaire &agrave; celle de l'hydrogel d&eacute;pourvu de GFP, avec environ 35 % de perte totale de prot&eacute;ine apr&egrave;s 21 jours.Dans le tampon DPBS, la majorité des protéines présentes dans le tampon d'érosion étaient clivées dans les teen. La lixiviation de la SH 3G FP à partir d'un hydrogel contenant le ligand S SH trois est d'environ 30 % après trois semaines, nettement plus faible que celle provenant d'un hydrogel dépourvu du ligand s sh trois, comme on le voit ici sur l'hydrogel contenant le peptide station d'ancrage. Le ligand S SH trois conserve la majeure partie de la fluorescence GFP.Après trois semaines, tandis que l'hydrogel dépourvu du ligand SSH devient pratiquement non fluorescent. La densité de GFP immobilisée dans ce travail représente environ 33 pour cent molaire de l'hydrogel. Une densité d'immobilisation plus élevée pourrait potentiellement être obtenue lorsque plusieurs peptides de station d'ancrage sont intégrés au bloc constitutif de l'hydrogel.Ensuite, l'enzyme HRP a été incorporée dans l'hydrogel protéique afin de démontrer sa capacité à stabiliser des biocatalyseurs dans des solvants organiques. L'activité enzymatique a été mesurée en surveillant au fil du temps le couplage oxydatif de la NN-diméthyl-p-phénylènediamine et du phénol avec le peroxyde de tert-butyle. L'hypothèse était que l'environnement hydraté de l'hydrogel protégerait l'enzyme fixée des effets dénaturants du solvant organique.Après immersion dans un solvant organique, l'hydrogel contenant la peroxydase de raifort (HRP) a été manuellement fragmenté en petits agrégats afin d'augmenter la surface de l'interface hydrophile-hydrophobe. L'HRP intégrée dans l'hydrogel a efficacement catalysé la réaction d'oxydation rapide, produisant un composé colorimétrique. L'accumulation du produit suit une pente linéaire, indiquant peu ou pas d'inactivation enzymatique.Au cours de l'expérience, la HRP dissoute dans le DPBS, puis ajoutée au solvant organique, a pu catalyser la conversion, mais à un taux de réaction nettement réduit. Le faible taux de conversion des enzymes dissoutes dans le DPBS est probablement dû à la petite surface interfaciale entre le DPBS et le solvant organique, ce qui limite la diffusion du substrat et du produit. L'incorporation du fragment s fortement hydrophile dans l'ossature du gel hydrogel, qui piège efficacement l'eau à l'intérieur du gel et empêche le solvant organique d'accéder à l'intérieur du gel, permet à celui-ci de résister à l'effet désaturant du solvant organique.Ces résultats indiquent que l'hydrogel protéique médié par l'ène peut constituer un support efficace pour les réactions enzymatiques en solvant organique. La flexibilité structurelle et la grande stabilité de cet hydrogel auto-assemblé permettent de l'utiliser non seulement dans la protéine et la mobilisation, mais également dans d'autres applications telles que les piles à combustible biologiques, les vecteurs injectables pour la distribution de médicaments et les supports pour le génie tissulaire.

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