La production efficace et purification de recombinant murin Kindlin-3 à partir de cellules d'insectes pour les études biophysiques

L'objectif général des expériences suivantes est de produire efficacement des quantités de l'ordre du milligramme de Miran Kinlin trois à partir de cultures de cellules d'insectes, quantités qui ne peuvent être obtenues avec d'autres systèmes d'expression. Ceci est réalisé par transfection concomitante d'un vecteur de transfert KINLIN trois et d'un baculovirus modifié privé de son segment mid, afin de créer un baculovirus recombinant portant le gène KINLIN trois. Dans une deuxième étape, le virus est amplifié au sein de cellules d'insectes afin de produire une quantité suffisante de virions pour les étapes ultérieures.

Ensuite, les cellules d'insectes sont infectées afin de produire de grandes quantités de la protéine Kinlin trois, ce qui permet sa purification par chromatographie liquide rapide. Les résultats obtenus montrent que la kinlin trois fonctionnelle, de haute pureté, peut être produite en quantités de l'ordre du milligramme, comme en attestent l'analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et la chromatographie d'exclusion stérique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'expression de la kinling trois chez les bactéries, réside dans le fait que l'expression dans des cellules d'insectes infectées par le virus de la polyédrose nucléaire augmente le rendement en protéine recombinante d'un facteur dix.

Les cellules SF nine destinées à cette procédure sont cultivées et maintenues en suspension dans un milieu SF 902 enrichi avec 100 microgrammes par millilitre de pénicilline et 100 microgrammes par millilitre de streptomycine. Pour la génération du virus bao, les cellules doivent être cultivées jusqu'à une densité comprise entre cinq fois 10 à la puissance cinq et une fois 10 à la puissance six cellules par millilitre. Pour préparer les cellules SF nine en vue de la transfection, déposer environ une fois 10 à la puissance six cellules par puits d'une plaque de culture tissulaire stérile à six puits, dans deux millilitres de milieu SF 902 supplémenté en pénicilline et streptomycine. Laisser les cellules SF nine environ 20 minutes à température ambiante dans la hotte à flux laminaire afin qu'elles adhèrent au fond des puits en plastique et forment ainsi une monocouche. La génération du virus balo recombinant s'obtient par cotransfection d'ADN plasmidique et d'ADN BMid sur une culture mononucléée de cellules SF nine.

Le vecteur d'expression papine neuron ferm T trois contient le gène murin KINLIN trois ferm T trois. Sous le contrôle du promoteur viral P 10 BAO, il possède des séquences virales BAO flanquantes permettant la recombinaison avec le bacmid, et code une étiquette hiss six en position C-terminale destinée à la purification en aval. Pour chaque transfection, préparer une à deux microgrammes de MFI T trois purifié avec 0,5 microgramme de bacmid purifié et 100 microlitres de milieu SF 902 SFM sans antibiotiques. Il s'agit de la solution A. Dans un tube séparé, diluer six microlitres de réactif cell effect in deux avec 100 microlitres de milieu SF 902 SFM sans antibiotiques.

Pour chaque réaction de transfection, un mélange maître peut être préparé ici afin de réduire la manipulation de liquides si de nombreuses transfections sont nécessaires. Il s'agit de la solution B. Mélanger les deux solutions A et B en utilisant environ 200 microlitres de chaque solution par transfection, puis incuber à température ambiante pendant 20 minutes pour former des complexes ADN-lipides. Après 20 minutes, diluer les complexes ADN-lipides avec 800 microlitres par transfection de milieu SF 902 SFM sans antibiotiques. Ensuite, aspirer soigneusement le milieu de la monocouche de cellules SF nine et ajouter délicatement au-dessus de la monocouche SF nine le mélange de la solution AB et du milieu.

Incuber les cellules transfectées toute la nuit dans un incubateur humidifié à 27 degrés Celsius afin de créer un environnement humidifié et empêcher les cellules de se dessécher. Placer la plaque à six puits dans un récipient en plastique accompagné d'une serviette en papier humide. Le jour suivant, ajouter un millilitre supplémentaire de SF 900 au milieu SFM sans antibiotiques pour chaque culture en monocouche, puis incuber les cellules à 27 degrés Celsius pendant cinq jours supplémentaires.

Après cinq jours, récoltez le virus recombinant bao directement à partir du milieu de culture et transférez-le dans un tube de centrifugeuse propre. Clarifiez les débris cellulaires SF nine par centrifugation à 1000 G pendant cinq minutes. À température ambiante, transférez le virus, qui se trouve dans le surnageant obtenu et est désigné comme P1, dans un tube propre. On peut supposer que la génération de virus P1 possède une titre viral attendu de 1 × 10⁷ PFU par millilitre.

Bien qu'une analyse de plaque SA puisse être effectuée si nécessaire, conserver le stock viral P à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière jusqu'à utilisation. Les cellules SF neuf utilisées pour l'amplification du virus recombinant balo en suspension doivent avoir une densité de 1,4 × 10⁶ cellules par millilitre, et la culture doit occuper un vingtième du volume total du flacon. Par exemple, 50 millilitres dans un flacon de deux litres. Généralement, pour une amplification optimale du virus vao et une production protéique maximale, les cellules SF neuf doivent être uniformes en taille et sphériques.

Infectez la culture cellulaire SF9 avec le lot viral P1 à une multiplicité d'infection ou MOI de 0,1 en utilisant la formule suivante. Incubez la culture d'insectes infectée par P1 à 27 degrés Celsius avec agitation à 100 tr/min pendant 72 heures. Trois jours plus tard, récoltez le virus en séparant les cellules du milieu par centrifugation à 1000 G pendant cinq minutes.

À température ambiante, transférez le milieu enrichi en virus clarifié dans un tube propre. Ce stock viral est désigné comme P2 et le titre viral attendu est de 2 × 10⁸ PFU par millilitre. Conservez ce stock viral à 4 °C à l’abri de la lumière jusqu’à son utilisation, et conservez les culots cellulaires obtenus à −20 °C pour une confirmation ultérieure de la production du virus recombinant.

Pour commencer cette procédure, cultiver un volume adéquat de cellules SF nine en suspension dans du milieu SF 902 s fm, supplémenté avec 100 microgrammes par millilitre de pénicilline et 100 microgrammes par millilitre de streptomycine. Le rapport entre le volume total de culture et le volume du flacon doit être de un pour cinq.

Incuber les cultures en suspension à 27 degrés Celsius avec agitation à 100 tr/min jusqu'à ce qu'elles atteignent une densité cellulaire de deux fois 10 à la puissance six cellules par millilitre. Lorsque les cultures SF neuf atteignent une densité de deux fois 10 à la puissance six cellules par millilitre, elles sont prêtes pour l'infection par le virus balo. Compléter les cultures avec un sérum bovin fœtal à une concentration finale de 1 %, puis ajouter la souche virale P deux.

Pour obtenir un MOI de un, incuber les cultures infectées à 27 degrés Celsius avec agitation à 100 tr/min. Soixante-douze heures après l'infection, récolter les cellules SF9 exprimant la protéine recombinante Lin trois marquée par un polyhistidine en centrifugeant à 1000 ×g pendant 20 minutes à température ambiante. Conserver le culot cellulaire obtenu à moins 20 degrés Celsius jusqu'à utilisation, ou à moins 80 degrés Celsius pour une conservation à long terme. Cette procédure commence par une décongélation sur glace.

Les culots congelés de virus vao infectant des SF neuf exprimant la kinéine recombinante trois et Resus, en resuspendant les culots avec un tampon de lyse. Après avoir incubé les cellules resuspendues avec le tampon de lyse pendant cinq à dix minutes, vortexer jusqu'à l'obtention d'une suspension homogène pour une disruption cellulaire supplémentaire. Soniquer l'échantillon dans un bain de glace.

Clarifiez le lysat par centrifugation à 48 000 ×g pendant une heure à quatre degrés Celsius. Chargez le surnageant obtenu sur une colonne Histrap de cinq millilitres pré-équilibrée avec le tampon de lyse à quatre degrés Celsius, à un débit d'un millilitre par minute. Les étapes ultérieures de changement de tampon d'élution des protéines et de concentration des protéines ne seront pas démontrées ici, mais sont décrites en détail dans le manuscrit accompagnant.

Une fois la solution protéique après échange de tampon obtenue, appliquez-la sur une colonne heparine HP High Trap de cinq millilitres pré-équilibrée, à l’aide d’un système ACTA FPLC à un débit de 0,5 millilitre par minute. La protéine KINLIN trois retenue est élutée à l’aide d’un gradient linéaire de chlorure de sodium dans le même tampon, augmentant à raison de 10 millimolaire par millilitre, pour les variants recombinants portant des étiquettes histidine. On s’attend à ce que KINLIN trois soit élué vers 0,6 molaire en chlorure de sodium. Après concentration de la protéine, la dernière étape consiste à effectuer un nouvel échange de tampon par chromatographie d’exclusion stérique : appliquez la protéine purifiée sur une colonne SUEx S 210 30 et purifiez les protéines selon leur taille en appliquant le tampon sur la colonne à un débit de 0,5 millilitre par minute.

Les protéines éluées de la colonne sont fractionnées et surveillées à l'aide du détecteur d'absorbance à 280 nanomètres. La réussite de la génération du virus recombinant a été vérifiée en évaluant la présence de Kinlin recombinant trois et des cellules SF neuf co-transfectées par électrophorèse SDS et analyse Western, comme le montre ce dot blot Western représentatif de six cultures à petite échelle de cellules SF neuf, en utilisant un anticorps anti-his six. Une bande nette correspondant à une protéine marquée par une queue his de 75 kilodaltons était visible dans chaque échantillon une fois que le virus avait été amplifié et utilisé pour infecter des cellules SF neuf dans des expériences à grande échelle. Kinlin recombinant trois a été partiellement purifié par chromatographie d'affinité sur métal immobilisé.

L'image principale du gel sur cette figure montre une électrophorèse SDS-PAGE d'une kinlina murine recombinante purifiée par affinité au nickel, exprimée dans des cellules SF9 infectées par le virus BAO. La protéine absorbée a été élutionnée à l'aide d'un gradient d'imidazole, illustré au-dessus de l'image du gel. MW indique le marqueur de poids moléculaire, LYS correspond au lysat total de cellules, FT au flux traversant, WI au premier lavage et WII au deuxième lavage. Une analyse par immunotransfert (Western blot) a également été réalisée à partir des fractions d'élution afin de confirmer la présence de la marque his conçue sur la protéine recombinante.

Ensuite, la protéine KINLIN trois partiellement purifiée a été davantage purifiée jusqu'à une homogénéité quasi complète par chromatographie d'échange d'ions à l'aide d'une colonne d'héparine. Ce panneau montre le profil d'élution observé à 280 nanomètres en bleu, présentant un pic unique et symétrique éluant selon un gradient linéaire de chlorure de sodium indiqué en vert, en utilisant une gamme de concentration en chlorure de sodium allant de 0,05 molaire à 1,0 molaire. Le panneau inférieur montre les résultats de l'analyse par électrophorèse SDS-PAGE des fractions d'élution, démontrant la présence de la protéine Kinlin trois de 75 kilodaltons.

En tant qu'étape finale, la préparation de Kinlin trois a été purifiée par chromatographie d'exclusion stérique afin d'éliminer les agrégats et d'obtenir une préparation homogène. Ce profil représentatif de filtration sur gel correspond à Kinlin trois purifié à l'aide d'une colonne SUEx S 200 en tampon Tris HCl pH 7,5, 150 millimolaire de chlorure de sodium et 1 millimolaire de DTT à 20 degrés Celsius. D'après le volume d'élution, Kinlin trois migre comme attendu pour une protéine de 75 kilodaltons, ce qui suggère qu'elle est principalement monomérique.

La figure suivante présente les résultats de l'électrophorèse SDS-PAGE d'une préparation purifiée de kinéline trois recombinante fortement concentrée, désignée K3, à 14,5 milligrammes par millilitre. La production de quantités milligrammiques de kinéline trois murine pleine longueur, de haute pureté, en culture de cellules d'insectes permettra des études structurales approfondies ainsi qu'une analyse biochimique détaillée de la protéine. Un essai de décalage thermique basé sur la mesure de la fluorescence thermique a également été réalisé dans cette étude afin de déterminer quels tampons stabilisaient la kinéline trois.

KINLIN trois a été dilué dans divers tampons, composant un écran bidimensionnel de pH en fonction de la concentration en chlorure de sodium. Le panneau supérieur est un histogramme tridimensionnel des températures de transition et le panneau inférieur montre la variation de la température de transition par rapport à la moyenne calculée de 50,4 degrés Celsius. Les barres sont colorées selon la plage de températures à laquelle elles correspondent.

KINLIN trois s'est révélé stable à des concentrations élevées de chlorure de sodium dans la plage de PA de 7,0 à 9,0 avec une température de transition constante de 55 degrés Celsius. On a également observé que la température de transition de Kinlin trois était d'environ 55 degrés Celsius dans la plage de PA de 7,0 à 7,5, indépendamment de la concentration en chlorure de sodium.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'obtenir une kinésine recombinante fonctionnelle hautement pure, destinée à une caractérisation biophysique approfondie et à des études complémentaires. Des approches similaires peuvent être utilisées pour d'autres échantillons protéiques difficiles à préparer, et nous recommandons leur application dans de tels cas.