Anti-nucléaire de dépistage des anticorps Utilisation cellules HEP-2

L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser un dosage immunofluorescent indirect pour dépister des anticorps anti-nucléaires. Cette détection s'effectue en incubant le sérum du patient avec des lames porteuses de cellules Hep-2. Le sérum non fixé est éliminé par lavage, puis les autoanticorps liés sont incubés avec un conjugué spécifique marqué à la fluorescéine. Enfin, le réactif non lié est éliminé par un nouveau lavage.

Lorsqu'on les observe au microscope à fluorescence, les échantillons positifs aux auto-anticorps présentent une fluorescence verte pomme correspondant aux zones de la cellule ou du noyau où les auto-anticorps se sont fixés, selon un motif de fluorescence indiquant la présence de l'antigène. En fin de compte, la détection d'ARNa peut contribuer au diagnostic des maladies du tissu conjonctif. Le principal avantage de la méthode d'immunofluorescence indirecte par rapport à d'autres méthodes comme le ELISA en phase solide réside dans le fait que le substrat cellulaire Hep-2 exprime plus de 100 antigènes sous leur configuration native.

Cela permet d'identifier presque tous les anticorps O cliniquement pertinents, ce qui n'est pas possible avec les techniques en phase solide telles que la méthode d'immunofluorescence indirecte, une technique très spécialisée. Les personnes novices dans cette méthode doivent consacrer du temps et s'exercer afin de maîtriser correctement le protocole de traitement des lames. L'interprétation des images au microscope et l'apprentissage de l'identification des motifs pertinents constituent également une compétence qui demande du temps pour être maîtrisée.

Avec les bons réactifs et outils, les résultats sont plus cohérents et plus faciles à interpréter. La procédure sera démontrée par Cassandra Bryant, technologue du laboratoire de développement d'analyse par immunofluorescence. Retirer les réactifs de leur emballage et laisser chaque élément atteindre la température ambiante, préparer les réactifs et diluer le sérum du patient conformément à la notice d'insertion. Les lames sont codées à barres et peuvent être facilement intégrées dans des systèmes automatisés.

Cette procédure illustre le traitement manuel des lames. Toutefois, les laboratoires à haut débit peuvent opter pour un équipement automatisé de traitement des lames doté de capacités de lecture de codes-barres. Les instruments Inova sont reliés par un réseau intelligent centralisé qui permet de contrôler les résultats du flux de travail et les rapports.

Pour IFA. Ceci permet l'identification positive du patient en assurant le traitement et l'élimination des erreurs de transcription et des erreurs connexes. Déposer une goutte de contrôle positif et une goutte de contrôle négatif sur la lame appropriée.

Prélève 20 à 25 microlitres de sérum dilué du patient dans les puits restants à l’aide d’une pipette. Traite une lame à la fois. Place la lame dans un récipient de coloration contenant une serviette en papier humide au fond, couvre le récipient et incube la lame pendant 30 minutes.

Les conditions humides empêcheront le substrat de sécher, ce qui pourrait entraîner une coloration artéfactuelle. Pendant cette période d'incubation, les anticorps antinucléaires présents dans le sérum du patient se lieront aux antigènes des cellules fixées dans chaque puits. À la fin de l'incubation, rincez le sérum à l'aide d'un flux doux de tampon de lavage afin d'éviter d'endommager le substrat.

Inclinez légèrement la lame afin que le flux ne soit pas directement dirigé vers le substrat. Cette orientation des lames aidera également à prévenir le recouvrement des échantillons entre les puits. Secouez délicatement la lame pour éliminer l'excès de tampon de lavage, puis placez-la dans un bocal de Copeland contenant du tampon de lavage.

Le temps d'incubation pour l'étape de lavage doit être d'environ cinq minutes. Retirer les lames de la solution de lavage et les tapoter doucement. Pour éliminer l'excès de solution de lavage, appliquer une goutte de conjugué fluorescent sur chaque puits.

Pour un test de NA, l'utilisation d'un conjugué spécifique de la fraction FC des IgG est recommandée. Incubez les lames pendant 30 minutes dans un récipient humidifié et veillez à remplacer le couvre-lame de coloration. Le conjugué est sensible à la lumière et le couvercle protégera les lames de l'exposition à la lumière.

Au cours de cette période d'incubation, le conjugué se lie aux anticorps anti-nucléaires du patient qui se sont fixés sur les antigènes cellulaires. Cette liaison du conjugué entraîne la présence d'une fluorescence dans les puits après incubation. Laver la lame avec la solution de lavage.

Comme précédemment, placez un coverslip sur une serviette en papier et appliquez un milieu de montage en une ligne continue sur le bord inférieur du coverslip. Retirez chaque lame du tampon de lavage et tapez doucement sur la lame. Pour éliminer l'excès de tampon de lavage, touchez le bord inférieur de la lame au bord du coverslip.

Abaisser délicatement la lame sur la lamelle de manière à ce que le milieu de montage présent sur la lamelle s'écoule vers le bord supérieur de la lame sans inclusion de bulles d'air. La technique de pose de lamelle, incluant la quantité optimale de milieu de montage, nécessite de la pratique pour être parfaitement maîtrisée. Observer les lames au microscope à fluorescence dans une pièce sombre ; effectuer un balayage complet du puits à l’aide d’un objectif 20 x ou 25 x. Pour évaluer la distribution des cellules et l’uniformité de la fluorescence, passer à un objectif 40 x.

Pour interpréter définitivement la positivité et le motif, examinez les contrôles positif et négatif. Le contrôle négatif peut ne pas apparaître complètement sombre, mais affiche souvent une faible fluorescence non spécifique. Le contrôle positif affichera une fluorescence verte pomme intense dans le noyau.

La positivité peut être évaluée en utilisant une échelle de réactivité allant d'un plus à quatre plus. En complément de l'interprétation manuelle, les lames peuvent être chargées et numérisées par le microscope de fluorescence automatisé. Aucune chambre noire n'est nécessaire.

Après avoir créé un projet en sélectionnant le type de lame approprié, l'instrument acquiert et stocke des images numériques haute résolution des cellules de chaque puits. De plus, Nova View mesure l'intensité de la lumière fluorescente, classe les résultats comme positifs ou négatifs et fournit une reconnaissance de motif pour les échantillons positifs. Les images sont visualisées par l'opérateur sur un écran d'ordinateur haute résolution, permettant l'interprétation finale, la révision et la confirmation des résultats de Nova View.

Des rapports de résultats peuvent être générés à partir de résultats confirmés. La liaison des auto-anticorps aux structures protéiques constitutives du noyau entraîne cinq grands types de motifs nucléaires, notamment homogène, tacheté, centromérique, nucléolaire et en points nucléaires. Pour identifier un motif homogène tel qu'illustré ici, repérez les cellules en mitose ou en division.

Les cellules en mitose présentent une fluorescence homogène et intense, souvent plus marquée que dans les cellules au repos. Les noyaux des cellules au repos doivent être homogènes avec une coloration diffuse. Ce profil caractéristique est très probablement dû à la présence d'autoanticorps dirigés contre l'ADN double brin.

Une caractéristique clé du motif tacheté est l'aspect de fente de pièce des cellules mitotiques en métaphase. La région chromosomique de ces cellules est négative. Les cellules au repos présentent un motif en taches réparti dans tout le noyau.

L’aspect tacheté peut être défini comme grossier ou fin. Un aspect tacheté grossier résulte d’auto-anticorps dirigés contre SM et RNP. Un aspect tacheté fin peut être dû à des auto-anticorps dirigés contre S-S-A-S-S-B ainsi que contre l’ARN polymérase.

Le motif DFS est qualifié de fin dense et est indicatif d'autoanticorps dirigés contre le DFS 70. Les cellules en mitose présentent une coloration en taches, tandis que les cellules au repos affichent des taches fines uniformément réparties dans tout le noyau. Dans ces cas, des tests de confirmation doivent être réalisés, car les autoanticorps anti-DFS 70 sont fréquents chez les individus en bonne santé par rapport aux patients atteints d'une maladie du tissu conjonctif.

Pour identifier le motif du centromère, examinez les puits et repérez les cellules mitotiques ou en division. Les cellules en division présentent de nombreuses taches discrètes en association étroite les unes avec les autres, souvent appelées barre de métaphase. Les cellules au repos montrent environ 40 à 60 taches discrètes réparties dans tout le noyau.

Le motif centromérique est associé à des autoanticorps dirigés contre les protéines centromériques avec le motif nucléolaire. La coloration de la région chromosomique dans les cellules en mitose est variable. Le motif nucléolaire est associé à une coloration homogène ou en taches des noyaux, ainsi qu’à une coloration faible, en taches ou homogène du nucléoplasme des noyaux cellulaires au repos.

Ce type de fluorescence est associé à des auto-anticorps dirigés contre la polymérase ARN III, la fibrilline et les anticorps PM-Scl. Le motif en points nucléaires est associé à une absence de fluorescence dans les cellules en métaphase, des cellules mitotiques et quelques points discrets dans les noyaux des cellules au repos. Ce motif caractéristique est souvent dû à la présence d'auto-anticorps dirigés contre la SP-100, la PML ou la coïline P-80.

Ces anticorps sont associés à la cirrhose biliaire primitive et à l'hépatite auto-immune. Sur l'image présentée, le motif de points nucléaires présente une coloration cytoplasmique due aux auto-anticorps dirigés contre les antigènes mitochondriaux. La détection des anticorps antinucléaires et la reconnaissance des motifs constituent un outil important pour aider au diagnostic du patient.

Comprendre l'importance des différents motifs permet aux cliniciens et au personnel de laboratoire de réaliser les examens de suivi appropriés. Les facteurs les plus importants pour identifier correctement les motifs d'anticorps antinucléaires consistent à choisir un substrat cellulaire de haute qualité et à traiter les lames avec une technique constante et rigoureuse. La lecture des lames est traditionnellement effectuée par microscopie à fluorescence dans des pièces sombres, et est réalisée par des technologues formés, familiers avec les divers motifs dans le contexte du cycle cellulaire et de la morphologie cellulaire.

Au cours des dernières années, des systèmes d'imagerie numérique ont été mis au point pour la lecture automatisée des lames, des instruments qui automatisent le flux de travail et améliorent la cohérence de la lecture et de l'interprétation. De plus, grâce à l'utilisation de lames codées à barres, la traçabilité des échantillons tout au long du processus élimine les erreurs de transcription potentielles et renforce l'intégrité des données ainsi que la sécurité des patients. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer chaque étape du protocole d'immunofluorescence indirecte et de reconnaître les motifs d'anticorps antinucléaires cliniquement pertinents.