Name: Anti-nucléaire de dépistage des anticorps Utilisation cellules HEP-2 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-23T18:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Découvrez le test d'immunofluorescence indirecte pour détecter les anticorps antinucléaires dans le sérum humain à l'aide de lames HEP-2. Cette méthode permet de diagnostiquer les maladies auto-immunes systémiques.

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Nous remercions Cassandra Bryant pour effectuer l&#39;expérience IIF et Carol Büchner pour son examen technique d&#39;experts.

1. Exemple de sélection et de préparation du support <ol><li> Éliminer les réactifs de l&#39;emballage et de permettre à chaque article à venir à la température ambiante. Préparer les réactifs et diluer le sérum du patient en fonction de la pièce rapportée de direction. Remarque: diapositives NOVA Lite sont un code à barres et peuvent être facilement intégrés dans les systèmes automatisés en collaboration avec le Laboratoire Système d&#39;information LIS. Cette procédure illustre le traitement manuel de diapositives; laboratoires à haut débit, cependant, peuvent opter pour un équipement automatisé de traitement de diapositive. </li></ol> 2. Ajout des contrôles et des échantillons <ol><li> Distribuer une goutte de contrôle positif et une goutte de contrôle négatif dans les puits de glissement appropriées. Introduire à la pipette 20 à 25 pl de sérum dilué patient dans les puits restants. Traiter une diapositive à la fois. </li><li> Placer la lame (s) dans un récipient de coloration avec une serviette en papier humide sur le fond. Couvrir le récipient et laisser incuber le coulisseau (s) pendant 30 min. Note: Les conditions humides seraempêcher le substrat de sécher. Séchage des puits pourrait entraîner une coloration un artefact. Au cours de cette période d&#39;incubation, les anticorps anti-nucléaires dans le sérum du patient se lient aux antigènes des cellules qui sont fixés sur chaque puits. </li><li> Après la période d&#39;incubation, rincer le sérum en utilisant un léger courant de tampon de lavage. Afin d&#39;éviter d&#39;endommager le substrat et empêcher cross-over entre les puits d&#39;échantillons, la glissière angle légèrement pour éviter de diriger le jet directement sur les puits. Secouez tampon de lavage en excès et placer la lame dans une jarre Coplin contenant du tampon de lavage pendant environ 5 min. </li></ol> 3. Ajout de conjugué fluorescent <ol><li> Un par un, supprimer les diapositives de la mémoire tampon de lavage et tapotez doucement pour enlever le tampon de lavage en excès. Appliquer 1 goutte de conjugué fluorescent (FITC marqué anti-IgG humaine) sur chaque puits. Incuber les lames pendant 30 min dans le conteneur humidifié, et assurez-vous de remplacer la colorationcouvercle du récipient. Remarque: Pour les tests ANA, l&#39;utilisation d&#39;un conjugué spécifique d&#39;IgG Fc est recommandée. Le conjugué est sensible à la lumière, et le couvercle protège les diapositives de l&#39;exposition à la lumière en plus de maintenir l&#39;environnement humide. Au cours de cette période d&#39;incubation, le conjugué se lie à des anticorps anti-nucléaires du patient qui se sont liés aux antigènes cellulaires. Ce conjugué de liaison se traduit par la présence de la fluorescence dans les puits. </li><li> Rincer et laver la lame comme décrit ci-dessus. </li><li> Placer une lamelle couvre-objet sur une serviette en papier et appliquer un milieu de montage dans une ligne continue sur le bord inférieur de la lamelle. </li><li> Retirez chaque diapositive du tampon de lavage et appuyez sur la diapositive doucement pour enlever le tampon de lavage en excès. Appuyez sur le bord inférieur de la lame vers le bord de la lamelle. </li><li> Abaisser doucement le glisser sur la lamelle couvre-objet de telle manière que le milieu de montage sur la lamelle couvre-objet s&#39;écoule vers le bord supérieur de la lame sans formation de bulles d&#39;air. Note: Coverslipping, y compris en utilisant la quantité optimale de milieu de montage, est une technique qui demande de la pratique de la perfection. </li></ol> 4. Identification des résultats positifs et négatifs Interprétation Manuel <ol><li> Voir glisse avec un microscope à fluorescence, situé dans une pièce sombre. Effectuer un balayage de l&#39;ensemble du bien avec un objectif 20X ou 25X pour évaluer la distribution de cellules et l&#39;uniformité de la fluorescence </li><li> Basculer vers un objectif 40X pour rendre l&#39;interprétation finale concernant la positivité et le motif. </li><li> Regardez les contrôles positifs et négatifs. positivité de grade en utilisant une échelle de notation de la réactivité de 1 + à 4 +. Remarque: Le contrôle négatif peut ne pas apparaître complètement sombre, mais souvent afficher fluorescence non spécifique faible niveau. Le contrôle positif afficher pomme lumineux fluorescence verte dans le noyau (figure 1). </li></ol> Interprétation automatisée Remarque: En additià l&#39;interprétation manuelle, la charge et Numérisation de diapositives par NOVA Voir Microscope à fluorescence automatisé ou tout autre instrument d&#39;imagerie numérique automatisé; pas de chambre noire est nécessaire. Après avoir créé un projet en sélectionnant le type de diapositive échéant, l&#39;instrument acquiert et stocke des images numériques haute résolution de cellules dans chaque puits. En outre, NOVA Voir mesure l&#39;intensité de la lumière fluorescente, et catégorise les résultats positifs ou négatifs, et fournit une reconnaissance de motif pour les échantillons positifs. Images sont visualisées par l&#39;opérateur sur un écran d&#39;ordinateur à haute résolution, permettant l&#39;interprétation finale, la révision et la confirmation de NOVA Voir résultat. Les rapports peuvent être générés sur les résultats confirmés. Microscopie numérique doit être utilisé en conjonction avec un technicien de laboratoire expérimenté car il est destiné à faciliter l&#39;interprétation des résultats.

<ol><li>Meroni, P. L., Schur, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANA+screening%3A+an+old+test+with+new+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">ANA screening: an old test with new recommendations.</a> Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).</li>
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<li>Salomonsson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serologic+marker+for+fetal+risk+of+congenital+heart+block%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">A serologic marker for fetal risk of congenital heart block.</a> Arthritis Rheum. 46 (5), 1233-1241 (2002).</li>
<li>Miyawaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+serological+heterogeneity+in+patients+with+anticentromere+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Clinical and serological heterogeneity in patients with anticentromere antibodies.</a> J Rheumatology. 32 (8), 1488-1494 (2005).</li>
<li>Raijamkers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PM-Scl-75+is+the+main+autoantigen+in+patients+with+the+polymyositis%2Fscleroderma+overlap+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">PM-Scl-75 is the main autoantigen in patients with the polymyositis/scleroderma overlap syndrome.</a> Arthritis Rheum. 50 (2), 565-569 (2004).</li>
<li>Yang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+scleroderma+sera+contain+autoantibodies+to+protein+components+specific+to+the+UC+small+nucleolar+RNP+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Human scleroderma sera contain autoantibodies to protein components specific to the UC small nucleolar RNP complex.</a> Arthritis Rheum. 48 (1), 210-217 (2003).</li>
<li>Granito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+antibodies+as+ancillary+markers+in+primary+biliary+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 12 (1), 65-74 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs Gabriella Lakos, Cassandra Bryant, Carol Buchner, et Anna Eslami sont des employés de INOVA Diagnostics.

Le dépistage par cellules HEp-2 est une première étape essentielle dans le diagnostic des patients atteints de SARD. Cependant, les méthodes IIF manquent d’harmonisation. Les sources de variabilité comprennent la préparation des lames, la spécificité conjuguée, l’efficacité du microscope fluorescent et l’expérience du lecteur. Malgré ces préoccupations, l’IIF reste la « référence » pour les tests ANA. Les cellules HEp-2 contiennent une grande variété d’auto-antigènes et constituent le substrat idéal pour la détection de ces auto-anticorps. Dans certains laboratoires, l’IIF a été remplacé par des méthodes de dépistage en phase solide telles que le dosage multiplex ou l’ELISA. L’inconvénient de ces tests est qu’ils ne présentent pas toute la gamme d’antigènes pour être suffisamment sensibles. En plus des problèmes de retard de traitement et de diagnostic erroné, des coûts de santé supplémentaires peuvent survenir en raison de la répétition de tests de confirmation ou d’investigations diagnostiques inutiles. Compte tenu des défis inhérents à l’IIF, il est primordial d’exécuter correctement cette technique pour éviter la subjectivité dans les résultats.
Pour garantir une interprétation et une communication précises des résultats du dépistage ANA, il est essentiel d’utiliser un substrat de la plus haute qualité. Lors de la sélection d’un substrat HEp-2, il est essentiel que les cellules soient optimisées pour exprimer des épitopes cliniquement pertinents dans leur état protéique natif. Les lignées cellulaires HEp-2 transfectées ou autrement modifiées peuvent ne pas permettre une liaison anticorps-antigène correcte. De plus, lorsque plusieurs auto-anticorps différents sont présents simultanément, les cellules recombinantes peuvent masquer un ou plusieurs motifs. Un grand nombre de cellules mitotiques doivent également être présentes dans le substrat. Un nombre adéquat de cellules mitotiques permet une identification rapide et précise des motifs. 
En plus des attributs du substrat, l’objectif de ce protocole vidéo est de décrire la technique IIF en montrant les étapes critiques telles que l’ajout d’échantillon, le lavage des lames, l’ajout de conjugué, le glissement de la couverture et la détermination des résultats positifs et négatifs. Les résultats peuvent être compromis si la technique appropriée n’est pas utilisée pour chacune de ces étapes. Un bon lavage est important pour éliminer tous les anticorps non liés. Certains patients présentent de très grandes quantités d’auto-anticorps et dans ces cas, il est important de laver le sérum des puits afin qu’il ne contamine pas d’autres puits. 
Bien que l’IIF ait toujours été une méthode de laboratoire très exigeante en main-d’œuvre et subjective, les nouvelles technologies telles que les processeurs de lames, les lames à code-barres et la microscopie numérique automatisée peuvent considérablement simplifier le flux de travail, augmenter la cohérence et réduire les sources de variabilité de l’interprétation.

L&#39;anticorps antinucléaires terme (ANA) décrit une variété d&#39;auto-anticorps qui réagissent avec les constituants des noyaux de cellules dont l&#39;ADN, des protéines et ribonucléoprotéines 1, 2. La cellule HEp-2, une matrice de protéine native avec des centaines d&#39;antigènes, fournit un substrat idéal pour la détection d&#39;une ANA. La détection de l&#39;ANA dans le sérum humain est un outil de dépistage important pour les maladies du tissu conjonctif, et IIF est la méthode de référence pour tester ANA 1. Récemment, IIF sur cellules HEp-2 a été remplacé dans certains laboratoires avec des dosages immunologiques spécifiques de l&#39;antigène et méthodes multiplex. En raison de préoccupations au sujet des résultats faussement négatifs et le manque de transparence pour les cliniciens, l&#39;American College of Rheumatology a formé un groupe de travail qui a conclu que l&#39;aide IIF cellules HEp-2 devrait être le «gold standard» pour le dépistage ANA 1. En raison de la nature subjective de criblage ANA, la qualité des cellules HEp-2 est enintégrante de rapports précis et sûr des résultats. La présence d&#39;un nombre élevé de cellules en mitose, la morphologie cellulaire optimale, la confluence suffisante, et l&#39;expression des antigènes en question sont particulièrement importants. Reconnaissance de formes IIF sert comme un outil important pour aider au diagnostic du patient. Comprendre l&#39;importance de divers modèles permet aux cliniciens et le personnel de laboratoire pour effectuer les essais de suivi approprié pour confirmer le diagnostic. Par exemple, le motif ANA homogène peut se produire en présence d&#39;anticorps anti-ADN double brin chromatine ou, et peut être associé à un lupus érythémateux disséminé (SLE) 3. De l&#39;autre côté, il a été récemment décrit que la configuration dite fine et dense mouchetée (DFS) qui est couramment observée jusqu&#39;à 12% des échantillons de routine, a surtout été associée à des anticorps anti-DFS70. Ces auto-anticorps, une fois trouvé dans l&#39;isolement (sans autre ANA spécifique de la maladie) ne sont pas associés à des maladies rhumatismales auto-immunes systémiques &lt;sup&gt; 4-9. Tests de confirmation de ce fait pour les anticorps anti-DFS70 peut aider à réduire les tests de réflexe inutile, offrir des économies considérables, et soulager l&#39;anxiété du patient. Étant donné que l&#39;IIF est la première méthode de dépistage de la ligne pour détecter des auto-anticorps, il est primordial que l&#39;utilisateur comprenne comment le choix des réactifs et des substrats de tissus peut influer sur les résultats. Depuis la technique IIF est intrinsèquement subjective, il est important que les réactifs utilisés fournissent les résultats de la plus haute qualité. Cet objectif de ce protocole vidéo est de familiariser l&#39;utilisateur avec les bonnes mesures nécessaires pour exécuter la méthode IIF, les modèles communs associés à ANA, et d&#39;introduire de nouvelles avancées qui peuvent rationaliser le flux de travail de laboratoire et de normaliser les résultats.

<table><tbody><tr><td>NOVA Lite HEp-2 IgG (conjugué DAPI)</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>708102</td><td></td></tr><tr><td>NOVA View Instrument</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>NV2000</td><td></td></tr><tr><td>QUANTA Link Workstation</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>LINK010</td><td></td></tr><tr><td>QUANTA Link Workstation License</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>LINK001</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de codes-barres</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>LINK019</td><td></td></tr></tbody></table>

anti-nucléaire de dépistage des anticorps utilisation cellules hep-2

Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

L&#39;American College of Rheumatology énoncé de position sur les tests ANA prévoit l&#39;utilisation de l&#39;IIF que la méthode de l&#39;étalon-or pour le dépistage ANA 1. Bien IIF est un excellent test de dépistage dans des mains expertes, les difficultés techniques de traitement et de lecture IIF glisse - comme la intensif de traitement du travail de diapositives, une lecture manuelle, la nécessité d&#39;une expérience, les technologues formés et l&#39;utilisation de la salle sombre - rendre la méthode IIF difficile de faire entrer dans le flux de travail de laboratoires automatisés, modernes. La première étape cruciale vers la haute qualité dépistage ANA est le traitement de diapositive attention. Cette procédure est laborieuse et nécessite une bonne compréhension du processus, ainsi que l&#39;attention aux détails et l&#39;expérience. Glisser lecture est effectuée par microscopie à fluorescence dans des pièces sombres, et se fait par des techniciens qualifiés qui sont familiers avec les différents modèles, dans le cadre du cycle cellulaireet la morphologie de l&#39;interphase et les cellules en division. À condition que l&#39;IIF est le premier outil de dépistage de la ligne pour l&#39;ADRD, comprendre les étapes à exécuter correctement cette technique est critique. Récemment, des systèmes d&#39;imagerie numérique ont été développés pour la lecture automatique des diapositives IIF. Ces systèmes, tels que le NOVA Voir microscope à fluorescence automatisé, sont conçus pour faciliter le travail IIF routine. NOVA Voir acquiert et stocke les images numériques de haute résolution des puits, séparant ainsi l&#39;acquisition d&#39;images à partir de l&#39;interprétation; images sont visualisées sur une interprétation d&#39;un des écrans d&#39;ordinateur à haute résolution. Il stocke les images pour référence future et prend en charge l&#39;interprétation de l&#39;opérateur en fournissant des données d&#39;intensité de lumière fluorescentes sur les images. Il classe également au préalable les résultats positifs ou négatifs, et fournit une reconnaissance de motif pour les échantillons positifs. En résumé, il élimine le besoin de chambre noire, et automatise et rationalise le readi IIFng / flux de travail d&#39;interprétation. Surtout, il augmente la cohérence entre les lecteurs et les lectures. De plus, avec l&#39;utilisation de diapositives à code-barres, les erreurs de transcription sont éliminés en fournissant la traçabilité des échantillons et l&#39;identification positive du patient. Il en résulte l&#39;intégrité des données du patient et de sécurité accrue. L&#39;objectif global de cette vidéo est de démontrer la procédure IIF, y compris le traitement de diapositives, l&#39;identification de modèles IIF communes, et l&#39;introduction de nouvelles avancées pour simplifier et harmoniser cette technique.

Lors de l&#39;évaluation des résultats de coloration cellulaire pour HEp-2, cinq grands modèles nucléaires sont les plus fréquemment rapportés: homogène, moucheté, centromère, nucléolaire et points nucléaires. Ces modèles sont le résultat de la liaison d&#39;auto-anticorps spécifiques de constituants du noyau. Bien que les tests ANA est spécifique aux structures nucléaires, cytoplasmiques modèles associés à des auto-anticorps contre les structures cytoplasmiques peuvent également être observés. Dans certains cas, plusieurs auto-anticorps peuvent être présents dans un échantillon, et l&#39;image peuvent apparaître comme un modèle mixte. Il existe d&#39;autres, moins fréquemment observé, et souvent des modèles spécifiques du cycle cellulaire qui peuvent être détectés par la méthode IIF; plus récemment, un soi-disant modèle finement mouchetée dense de signification clinique spéciale a été décrite dans certains sérums positif ANA. Motif homogène Pour identifier un modèle homogène, analyser le bien et identifier mitotique ou séparationcellules. La chromatine condensée des cellules en mitose (figure 2, orange flèche) présente solide, fluorescence uniforme, qui est souvent plus prononcée que dans la cellule de repos nuclei.In la structure homogène, les cellules au repos exposition uniforme, fluorescence diffuse de l&#39;ensemble du noyau (Figure 2, flèche blanche). Ce motif caractéristique est souvent le résultat d&#39;anticorps anti-ADN double brin 10. Motif tacheté Dans le motif moucheté grossier, les cellules mitotiques ne présentent pas de coloration des régions chromosomiques condensés (Figure 3, orange flèche). Les cellules au repos présentent une fluorescence granulaire dans l&#39;ensemble du noyau. La moucheture nucléaire peut être définie comme grossier ou fin. Le motif de taches grossier est souvent le résultat d&#39;anti-Sm et anti-RNP 11. Dans le modèle finement mouchetée, les cellules au repos montrent taches amende ou diffus à travers les noyaux, généralement en uniforme distribution (figure 4, flèche blanche). Le motif finement mouchetée est souvent le résultat de l&#39;anti-anti-SSB SSAand 12. Dense Motif Fin tacheté Il est maintenant reconnu que l&#39;amende motif tacheté dense (DFS) est commun dans les tests de routine, et autant que 12% des échantillons sont positifs pour les auto-anticorps anti-DFS70. Cependant, ces auto-anticorps, quand trouvés dans l&#39;isolement, ne sont pas associés à des maladies rhumatismales auto-immunes systémiques 4 -6. Ces anticorps sont répandues dans les individus et les patients porteurs de maladies non liées à l&#39;ADRD 6 sains. Les tests de confirmation des anticorps anti-DFS70 peut aider à réduire les tests de réflexe inutile, offrir des économies considérables, et soulager l&#39;anxiété du patient. Depuis le modèle DFS est difficile d&#39;identifier et ANA positivité peut causer de l&#39;anxiété pour les patients et les médecins, il est fortement recommandé d&#39;effectuer un test de confirmation après identification<html> Fying un motif suggestif d&#39;anticorps anti-DFS70 de clarifier la signification clinique de l&#39;ANA positivty 5,6. Dans ce modèle, les cellules en mitose (figure 5, flèche orange) montrent une coloration mouchetée positif de la chromatine en métaphase, tout en se reposant noyaux cellulaires (figure 5, flèche blanche) présentent des fines mouchetures uniformément réparties dans tout le noyau. Motif centromère Pour identifier le modèle de centromère, analyser les puits et identifier mitotique ou cellules en division. Dans les cellules en mitose (figure 6, flèche orange), ces mouchetures discrètes deviennent étroitement associés à ce qui est souvent décrit comme une &quot;barre de métaphase&quot;. Dans le modèle de centromère, les cellules au repos (figure 6, flèche blanche) montrent environ 40-60 mouchetures discrètes réparties dans les noyaux. Le motif de centromère est le résultat d&#39;anti-CENP A, B, C des anticorps 13. étape &quot;&gt; Motif Nucleolar Certains motifs nucléolaires sont associées à une coloration cytoplasmique diffuse dans les cellules en mitose (figure 7, orange flèche) et de la région chromosomique négative, tandis que d&#39;autres modèles nucleolear présentent une coloration positive de la région chromosomique. L&#39;aspect nucléolaire est associé à la coloration homogène ou tacheté des nucléoles (figure 7, flèche blanche), avec fontaine faible ou coloration homogène du nucléoplasme. Ces motifs sont associés à anti-ARN polymérase III, anti-fibrillarine, anti-Th/To et anti-PM/Scl anticorps 14,15. Motif de point nucléaire Le motif de points nucléaire est associée à des cellules négatives métaphase de la mitose (figure 8, flèche orange) et avec quelques mouchetures discrètes dans les noyaux des cellules de repos (figure 8, flèche blanche). Ce motif caractéristique est souvent le résultat d&#39;auto-anticorps p80 colin sp-100, PML, ou. Ces anticorps sont aussi<html> sociated avec la cirrhose biliaire primitive et l&#39;hépatite auto-immune 16. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig1highres.jpg" width="500" /> . Figure 1 témoin négatif (à gauche): Les cellules affichent un faible niveau de fluorescence non spécifique, mais pas de coloration nucléaire spécifique contrôle positif (à droite):. Cellules affichent pomme fluorescence nucléaire vert. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2. Modèle homogène. Des cellules mitotiques (de orangearrow) montrent fluorescence solide. Les cellules au repos montrent même, coloration diffuse (whitearrow). &quot;Width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figure 3. Grossier mouchetée modèle. Cellules mitotiques (de flèche orange) montrent une coloration négative. Les cellules au repos montrent une tache tacheté distincte (flèche blanche). <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4. Motif Beaux mouchetée. Des cellules mitotiques (flèche orange) montrent une coloration négative. Les cellules au repos montrent une fluorescence finement mouchetée distincte (flèche blanche). <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig5highres.jpg" width="500" /> Figure 5. Dense motif fin moucheté. Des cellules mitotiques (flèche orange) montrent une coloration solide granulaire fine. Les cellules au repos montrent une très fine, tache mouchetée diffuse (whitearrow). Figure 6. Modèle centromère. Des cellules mitotiques (de) orangearrow spectacle uniforme, mouchetures discrètes. Les cellules au repos (whitearrow) montre 40-60 mouchetures discrètes par noyau de la cellule. <img alt="Figure 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig7highres.jpg" width="500" /> Figure 7. Modèle Nucleolar. Des cellules mitotiques (de orangearrow) apparaissent comme des grappes de coloration granulaire. Repos cellule nucleishows fluorescence dans les nucléoles (whitearrow). <img alt="Figure 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig8highres.jpg" width="500" /> Figure 8. Motif de points nucléaire. Des cellules mitotiques (de orangearrow) semble négative. Les cellules au repos montrent un peu discrmouchetures ete dans le noyau (whitearrow). De plus, le modèle de point Nucelar peuvent coexister avec une coloration cytoplasmique associée à des auto-anticorps contre les antigènes mitochondriaux (flèche rouge).

Immunofluorescence indirecte (IFI) les essais ont traditionnellement été utilisés pour la détection des anticorps antinucléaires (ANA) dans le sérum humain. La présence de ces anticorps peut aider au diagnostic de maladies rhumatismales auto-immunes systémiques (ADRD). Ce protocole montre comment effectuer efficacement la technique IIF pour détecter avec précision ces auto-anticorps.

Anti-nucléaire de dépistage des anticorps Utilisation cellules HEP-2

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser un dosage immunofluorescent indirect pour dépister des anticorps anti-nucléaires. Cette détection s'effectue en incubant le sérum du patient avec des lames porteuses de cellules Hep-2. Le sérum non fixé est éliminé par lavage, puis les autoanticorps liés sont incubés avec un conjugué spécifique marqué à la fluorescéine. Enfin, le réactif non lié est éliminé par un nouveau lavage.Lorsqu'on les observe au microscope à fluorescence, les échantillons positifs aux auto-anticorps présentent une fluorescence verte pomme correspondant aux zones de la cellule ou du noyau où les auto-anticorps se sont fixés, selon un motif de fluorescence indiquant la présence de l'antigène. En fin de compte, la détection d'ARNa peut contribuer au diagnostic des maladies du tissu conjonctif. Le principal avantage de la méthode d'immunofluorescence indirecte par rapport à d'autres méthodes comme le ELISA en phase solide réside dans le fait que le substrat cellulaire Hep-2 exprime plus de 100 antigènes sous leur configuration native.Cela permet d'identifier presque tous les anticorps O cliniquement pertinents, ce qui n'est pas possible avec les techniques en phase solide telles que la méthode d'immunofluorescence indirecte, une technique très spécialisée. Les personnes novices dans cette méthode doivent consacrer du temps et s'exercer afin de maîtriser correctement le protocole de traitement des lames. L'interprétation des images au microscope et l'apprentissage de l'identification des motifs pertinents constituent également une compétence qui demande du temps pour être maîtrisée.Avec les bons réactifs et outils, les résultats sont plus cohérents et plus faciles à interpréter. La procédure sera démontrée par Cassandra Bryant, technologue du laboratoire de développement d'analyse par immunofluorescence. Retirer les réactifs de leur emballage et laisser chaque élément atteindre la température ambiante, préparer les réactifs et diluer le sérum du patient conformément à la notice d'insertion. Les lames sont codées à barres et peuvent être facilement intégrées dans des systèmes automatisés.Cette procédure illustre le traitement manuel des lames. Toutefois, les laboratoires à haut débit peuvent opter pour un équipement automatisé de traitement des lames doté de capacités de lecture de codes-barres. Les instruments Inova sont reliés par un réseau intelligent centralisé qui permet de contrôler les résultats du flux de travail et les rapports.Pour IFA. Ceci permet l'identification positive du patient en assurant le traitement et l'élimination des erreurs de transcription et des erreurs connexes. Déposer une goutte de contrôle positif et une goutte de contrôle négatif sur la lame appropriée.Prélève 20 à 25 microlitres de sérum dilué du patient dans les puits restants à l’aide d’une pipette. Traite une lame à la fois. Place la lame dans un récipient de coloration contenant une serviette en papier humide au fond, couvre le récipient et incube la lame pendant 30 minutes.Les conditions humides empêcheront le substrat de sécher, ce qui pourrait entraîner une coloration artéfactuelle. Pendant cette période d'incubation, les anticorps antinucléaires présents dans le sérum du patient se lieront aux antigènes des cellules fixées dans chaque puits. À la fin de l'incubation, rincez le sérum à l'aide d'un flux doux de tampon de lavage afin d'éviter d'endommager le substrat.Inclinez légèrement la lame afin que le flux ne soit pas directement dirigé vers le substrat. Cette orientation des lames aidera également à prévenir le recouvrement des échantillons entre les puits. Secouez délicatement la lame pour éliminer l'excès de tampon de lavage, puis placez-la dans un bocal de Copeland contenant du tampon de lavage.Le temps d'incubation pour l'étape de lavage doit être d'environ cinq minutes. Retirer les lames de la solution de lavage et les tapoter doucement. Pour éliminer l'excès de solution de lavage, appliquer une goutte de conjugué fluorescent sur chaque puits.Pour un test de NA, l'utilisation d'un conjugué spécifique de la fraction FC des IgG est recommandée. Incubez les lames pendant 30 minutes dans un récipient humidifié et veillez à remplacer le couvre-lame de coloration. Le conjugué est sensible à la lumière et le couvercle protégera les lames de l'exposition à la lumière.Au cours de cette période d'incubation, le conjugué se lie aux anticorps anti-nucléaires du patient qui se sont fixés sur les antigènes cellulaires. Cette liaison du conjugué entraîne la présence d'une fluorescence dans les puits après incubation. Laver la lame avec la solution de lavage.Comme précédemment, placez un coverslip sur une serviette en papier et appliquez un milieu de montage en une ligne continue sur le bord inférieur du coverslip. Retirez chaque lame du tampon de lavage et tapez doucement sur la lame. Pour éliminer l'excès de tampon de lavage, touchez le bord inférieur de la lame au bord du coverslip.Abaisser délicatement la lame sur la lamelle de manière à ce que le milieu de montage présent sur la lamelle s'écoule vers le bord supérieur de la lame sans inclusion de bulles d'air. La technique de pose de lamelle, incluant la quantité optimale de milieu de montage, nécessite de la pratique pour être parfaitement maîtrisée. Observer les lames au microscope à fluorescence dans une pièce sombre ; effectuer un balayage complet du puits à l’aide d’un objectif 20 x ou 25 x. Pour évaluer la distribution des cellules et l’uniformité de la fluorescence, passer à un objectif 40 x.Pour interpréter définitivement la positivité et le motif, examinez les contrôles positif et négatif. Le contrôle négatif peut ne pas apparaître complètement sombre, mais affiche souvent une faible fluorescence non spécifique. Le contrôle positif affichera une fluorescence verte pomme intense dans le noyau.La positivité peut être évaluée en utilisant une échelle de réactivité allant d'un plus à quatre plus. En complément de l'interprétation manuelle, les lames peuvent être chargées et numérisées par le microscope de fluorescence automatisé. Aucune chambre noire n'est nécessaire.Après avoir créé un projet en sélectionnant le type de lame approprié, l'instrument acquiert et stocke des images numériques haute résolution des cellules de chaque puits. De plus, Nova View mesure l'intensité de la lumière fluorescente, classe les résultats comme positifs ou négatifs et fournit une reconnaissance de motif pour les échantillons positifs. Les images sont visualisées par l'opérateur sur un écran d'ordinateur haute résolution, permettant l'interprétation finale, la révision et la confirmation des résultats de Nova View.Des rapports de résultats peuvent être générés à partir de résultats confirmés. La liaison des auto-anticorps aux structures protéiques constitutives du noyau entraîne cinq grands types de motifs nucléaires, notamment homogène, tacheté, centromérique, nucléolaire et en points nucléaires. Pour identifier un motif homogène tel qu'illustré ici, repérez les cellules en mitose ou en division.Les cellules en mitose présentent une fluorescence homogène et intense, souvent plus marquée que dans les cellules au repos. Les noyaux des cellules au repos doivent être homogènes avec une coloration diffuse. Ce profil caractéristique est très probablement dû à la présence d'autoanticorps dirigés contre l'ADN double brin.Une caractéristique clé du motif tacheté est l'aspect de fente de pièce des cellules mitotiques en métaphase. La région chromosomique de ces cellules est négative. Les cellules au repos présentent un motif en taches réparti dans tout le noyau.L’aspect tacheté peut être défini comme grossier ou fin. Un aspect tacheté grossier résulte d’auto-anticorps dirigés contre SM et RNP. Un aspect tacheté fin peut être dû à des auto-anticorps dirigés contre S-S-A-S-S-B ainsi que contre l’ARN polymérase.Le motif DFS est qualifié de fin dense et est indicatif d'autoanticorps dirigés contre le DFS 70. Les cellules en mitose présentent une coloration en taches, tandis que les cellules au repos affichent des taches fines uniformément réparties dans tout le noyau. Dans ces cas, des tests de confirmation doivent être réalisés, car les autoanticorps anti-DFS 70 sont fréquents chez les individus en bonne santé par rapport aux patients atteints d'une maladie du tissu conjonctif.Pour identifier le motif du centrom&egrave;re, examinez les puits et rep&eacute;rez les cellules mitotiques ou en division. Les cellules en division pr&eacute;sentent de nombreuses taches discr&egrave;tes en association &eacute;troite les unes avec les autres, souvent appel&eacute;es barre de m&eacute;taphase. Les cellules au repos montrent environ 40 &agrave; 60 taches discr&egrave;tes r&eacute;parties dans tout le noyau.Le motif centromérique est associé à des autoanticorps dirigés contre les protéines centromériques avec le motif nucléolaire. La coloration de la région chromosomique dans les cellules en mitose est variable. Le motif nucléolaire est associé à une coloration homogène ou en taches des noyaux, ainsi qu’à une coloration faible, en taches ou homogène du nucléoplasme des noyaux cellulaires au repos.Ce type de fluorescence est associé à des auto-anticorps dirigés contre la polymérase ARN III, la fibrilline et les anticorps PM-Scl. Le motif en points nucléaires est associé à une absence de fluorescence dans les cellules en métaphase, des cellules mitotiques et quelques points discrets dans les noyaux des cellules au repos. Ce motif caractéristique est souvent dû à la présence d'auto-anticorps dirigés contre la SP-100, la PML ou la coïline P-80.Ces anticorps sont associés à la cirrhose biliaire primitive et à l'hépatite auto-immune. Sur l'image présentée, le motif de points nucléaires présente une coloration cytoplasmique due aux auto-anticorps dirigés contre les antigènes mitochondriaux. La détection des anticorps antinucléaires et la reconnaissance des motifs constituent un outil important pour aider au diagnostic du patient.Comprendre l'importance des différents motifs permet aux cliniciens et au personnel de laboratoire de réaliser les examens de suivi appropriés. Les facteurs les plus importants pour identifier correctement les motifs d'anticorps antinucléaires consistent à choisir un substrat cellulaire de haute qualité et à traiter les lames avec une technique constante et rigoureuse. La lecture des lames est traditionnellement effectuée par microscopie à fluorescence dans des pièces sombres, et est réalisée par des technologues formés, familiers avec les divers motifs dans le contexte du cycle cellulaire et de la morphologie cellulaire.Au cours des dernières années, des systèmes d'imagerie numérique ont été mis au point pour la lecture automatisée des lames, des instruments qui automatisent le flux de travail et améliorent la cohérence de la lecture et de l'interprétation. De plus, grâce à l'utilisation de lames codées à barres, la traçabilité des échantillons tout au long du processus élimine les erreurs de transcription potentielles et renforce l'intégrité des données ainsi que la sécurité des patients. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer chaque étape du protocole d'immunofluorescence indirecte et de reconnaître les motifs d'anticorps antinucléaires cliniquement pertinents.

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

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