Anti-nucléaire de dépistage des anticorps Utilisation cellules HEP-2

L’objectif global de l’expérience suivante est d’utiliser un test d’immunofluorescence indirecte pour dépister les anticorps antinucléaires. Ceci est réalisé en incubant le sérum du patient avec des lames de substrat hep deux. Le sérum non lié du patient est lavé, les anticorps automatiques liés sont ensuite incubés avec un conjugué spécifique marqué à la fluorescéine, et le réactif non lié est lavé.

Lorsqu’ils sont examinés à l’aide d’un microscope à fluorescence, les échantillons positifs pour les anticorps automatiques présentent une fluorescence vert pomme correspondant aux zones de la cellule ou des noyaux où l’anticorps anti-auto s’est lié selon un modèle de fluorescence indiquant la présence de l’antigène. En fin de compte, la présence d’arna peut être utilisée pour aider au diagnostic des maladies du tissu conjonctif. Le principal avantage de la méthode d’immunofluorescence indirecte par rapport à d’autres méthodes comme la phase solide Eliza, est que le substrat cellulaire Hep Two contient plus de 100 antigènes exprimés dans leur configuration native.

Cela permet d’identifier presque tous les anticorps O cliniquement pertinents, ce qui n’est pas possible avec les techniques à face solide car la méthode d’immunofluorescence indirecte est une technique très spécialisée. Les personnes novices dans cette méthode ont besoin de temps et de pratique pour maîtriser la procédure de traitement des lames. L’interprétation des images du microscope et l’apprentissage de l’identification des motifs pertinents sont également des compétences qui prennent du temps à maîtriser.

Avec les réactifs et les outils appropriés, les résultats sont plus cohérents et plus faciles à interpréter. Cassandra Bryant, technologue du Laboratoire de développement de l’asay immunofluorescent, fera la démonstration de la procédure. Retirez les réactifs de l’emballage et laissez chaque article revenir à température ambiante, préparez les réactifs et diluez le sérum du patient selon la direction.

Cette procédure illustre le traitement manuel des diapositives. Les laboratoires à haut débit, cependant, peuvent opter pour un équipement de traitement automatisé des lames avec des capacités de lecture de codes-barres. Les instruments Inova sont connectés via un réseau intelligent centralisé qui permet de contrôler les résultats du flux de travail et les rapports.

Pour l’IFA. Cela se traduit par une identification positive du patient grâce au traitement et à l’élimination des erreurs de transcription et des erreurs associées. Versez une goutte de contrôle positif et une goutte de contrôle négatif sur la lame appropriée.

Pipette de 20 à 25 microlitres de sérum de patient dilué vers les puits restants. Traitez une lame à la fois. Placez la lame dans un récipient tachant avec une serviette en papier humide au fond, couvrez le récipient et incubez la lame pendant 30 minutes.

Les conditions humides empêcheront le substrat de se dessécher, ce qui pourrait entraîner des taches artificielles. Pendant cette période d’incubation, les anticorps antinucléaires présents dans le sérum du patient vont se lier aux antigènes des cellules qui sont fixées sur chaque puits. Après la période d’incubation, rincez le sérum à l’aide d’un léger jet de tampon de lavage afin d’éviter d’endommager le support.

Inclinez légèrement la lame de manière à ce que le jet ne soit pas directement pointé sur le substrat. Cette orientation des lames aidera également à prévenir le croisement des échantillons entre les puits. Tapotez l’excès de tampon de lavage et placez la diapositive dans un pot Copeland contenant un tampon de lavage.

Le temps d’incubation pour l’étape de lavage doit être d’environ cinq minutes. Retirez les lames du tampon de lavage et tapotez doucement. Pour enlever l’excès de tampon de lavage, appliquez une goutte de conjugué fluorescent sur chaque puits.

Pour un test NA, l’utilisation d’un conjugué spécifique IgG FC est recommandée. Incuber les lames pendant 30 minutes dans le récipient humidifié et assurez-vous de replacer le couvercle de coloration. Le conjugué est sensible à la lumière et le couvercle protégera les lames de l’exposition à la lumière.

Pendant cette période d’incubation, le conjugué se liera aux anticorps antinucléaires du patient qui se sont liés aux antigènes cellulaires. Cette liaison conjuguée entraîne la présence d’une fluorescence dans les puits après l’incubation. Lavez la diapositive avec un tampon de lavage.

Comme précédemment, placez une lamelle sur une serviette en papier et appliquez le support de montage en ligne continue sur le bord inférieur de la lamelle. Retirez chaque glissière du tampon de lavage et tapotez doucement la glissière. Pour retirer l’excès de tampon de lavage, touchez le bord inférieur de la glissière sur le bord de la lamelle.

Abaissez doucement la glissière sur la lamelle de manière à ce que le support de montage sur la lamelle s’écoule vers le bord supérieur de la glissière sans que la bulle d’air ne glisse, y compris la quantité optimale de support de montage est une technique qui demande de la pratique pour une vue parfaite. Les lames avec un microscope fluorescent situé dans une pièce sombre, le balayage de l’ensemble du puits doit être effectué avec un objectif 20x ou 25x. Pour évaluer la distribution cellulaire et l’uniformité de la fluorescence, passer à un objectif 40x.

Pour faire l’interprétation finale concernant la positivité et le modèle, examinez les contrôles positifs et négatifs. Le contrôle négatif peut ne pas apparaître complètement sombre, mais affichera souvent une fluorescence non spécifique de faible niveau. Le témoin positif affichera une fluorescence vert pomme brillante dans le noyau.

La positivité peut être évaluée à l’aide d’une échelle de notation de la réactivité de un plus à quatre plus. En plus de l’interprétation manuelle, les lames peuvent être chargées et numérisées par le microscope à fluorescence automatisé. Aucune pièce noire n’est nécessaire.

Après avoir créé un projet en sélectionnant le type de diapositive approprié, l’instrument acquiert et stocke des images numériques haute résolution des cellules de chaque puits. De plus, Nova View mesure l’intensité de la lumière fluorescente et classe les résultats comme positifs ou négatifs et fournit une reconnaissance de forme pour les échantillons positifs. Les images sont visualisées par l’opérateur sur un écran d’ordinateur haute résolution, ce qui permet l’interprétation finale, la révision et la confirmation de Nova View.

Des rapports de résultats peuvent être générés sur la base de résultats confirmés. La liaison de l’auto-anticorps sur les structures protéiques constitutives du noyau donne lieu à cinq grands modèles nucléaires, notamment un centromère homogène et moucheté, un nucléolaire et un point nucléaire. Pour identifier un motif homogène comme illustré ici, identifiez les cellules mitotiques ou en division.

Les cellules mitotiques présentent une fluorescence uniforme et solide, souvent plus prononcée que dans les cellules au repos. Les noyaux des cellules au repos doivent être uniformes avec une coloration diffuse. Ce motif caractéristique est très probablement le résultat d’auto-anticorps dirigés contre l’ADN double brin.

Une caractéristique clé du motif moucheté est l’apparence de la fente des cellules mitotiques en métaphase. La région chromosomique de ces cellules est négative. Les cellules au repos présentent un motif de mouchetures dans tout le noyau.

Les mouchetures peuvent être définies comme grossières ou fines. Le chatoiement est le résultat d’anticorps automatiques contre le SM et le RNP. Les mouchetures fines peuvent être dues à des anticorps automatiques dirigés contre la S-S-A-S-S-B ainsi que contre l’ARN polymérase.

Le modèle DFS est appelé dense, finement moucheté et indique la présence d’anticorps automatiques contre DFS 70. Les cellules mitotiques présentent des taches mouchetées tandis que les cellules au repos présentent de fines taches uniformément réparties dans tout le noyau. Dans ces cas, des tests de confirmation doivent être effectués car les auto-anticorps DFS 70 sont prévalents chez les personnes en bonne santé par rapport aux patients atteints d’une maladie du tissu conjonctif.

Pour identifier le motif du centromère, scannez les puits et identifiez les cellules mitotiques ou en division. Les cellules en division ont de nombreuses taches discrètes en étroite association les unes avec les autres, souvent appelées barre de métaphase. Les cellules au repos présentent environ 40 à 60 taches discrètes réparties dans tout le noyau.

Le motif centromère est associé à des auto-anticorps contre les protéines centromères avec le motif nucléolaire. La coloration de la région chromosomique dans les cellules mitotiques est variable. Le motif nucléolaire est associé à une coloration homogène ou mouchetée des noyaux, ainsi qu’à une coloration faible, mouchetée ou homogène du nucléoplasme des noyaux cellulaires au repos.

Ce modèle est associé à des auto-anticorps dirigés contre l’ARN polymérase, trois fibrillines et les anticorps PM SCL. Le motif de points nucléaires est associé à une métaphase négative, à des cellules mitotiques et à quelques points discrets dans les noyaux des cellules au repos. Ce schéma caractéristique est souvent le résultat d’auto-anticorps dirigés contre SP 100 PML ou P 80 colan.

Ces anticorps sont associés à la cirrhose biliaire primitive et à l’hépatite auto-immune. Dans l’image présentée, le motif de points nucléaires présente une coloration cytoplasmique due à des anticorps automatiques contre les antigènes mitochondriaux. La détection des anticorps antinucléaires et la reconnaissance des formes constituent un outil important pour aider au diagnostic des patients.

La compréhension de l’importance des différents modèles permet aux cliniciens et au personnel de laboratoire d’effectuer des tests de suivi appropriés. Les facteurs les plus importants pour identifier correctement les modèles d’anticorps antinucléaires sont la sélection d’un substrat cellulaire de haute qualité et le traitement des lames avec une bonne technique constante. La lecture des lames est traditionnellement effectuée par microscopie fluorescente dans des chambres sombres et est effectuée par des technologues formés qui connaissent bien les différents modèles dans le contexte du cycle cellulaire et de la morphologie cellulaire.

Au cours des dernières années, des systèmes d’imagerie numérique ont été développés pour la lecture automatisée des diapositives, de tels instruments ont automatisé le flux de travail et augmenté la cohérence de la lecture et de l’interprétation. De plus, grâce à l’utilisation de lames à code-barres, la traçabilité des échantillons tout au long du processus élimine les erreurs de transcription potentielles et augmente l’intégrité des données et la sécurité des patients. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer chaque étape de la procédure d’immunofluorescence indirecte et d’identifier les modèles d’anticorps antinucléaires cliniquement pertinents.