Cytotoxique efficacité de la thérapie photodynamique dans les cellules ostéosarcome

L’objectif général de l’expérience suivante est de montrer l’efficacité cytotoxique de la thérapie photodynamique dans les cellules d’ostéosarcome. Ceci est réalisé en mesurant d’abord l’absorption intracellulaire du photosensibilisant M-T-H-P-C par les cellules d’ostéosarcome. Dans la deuxième étape, une lumière laser est appliquée sur les cellules pour activer le M-T-H-P-C et produire des radicaux oxygénés cytotoxiques.

Enfin, le métabolisme cellulaire et le nombre de cellules sont mesurés par un test de tétra-oléum soluble dans l’eau ou un test WST. En fin de compte, le test WST, ainsi que le comptage direct des cellules, peuvent être utilisés pour mesurer la cytotoxicité de la thérapie photodynamique sur les cellules de l’ostéosarcome. Les implications de cette technique s’étendent au traitement de l’ostéosarcome car elle permet de mesurer l’efficacité de la thérapie photodynamique in vitro et ressemble à la technique actuellement utilisée chez les patients.

Pour comparer l’absorption M-T-H-P-C entre les lignées cellulaires d’ostéosarcome, commencez par plaquer 0,2 fois 10 au sixième Hoss et 143 cellules B par puits. En trois exemplaires dans des plaques à six puits, laisser les cellules adhérer pendant la nuit à une fluidité de 80 à 90 %, puis le lendemain, incuber les cellules avec une concentration fixe de M-T-H-P-C pendant différentes périodes de temps dans l’obscurité pour évaluer l’absorption du photosensibilisateur par les cellules en fonction du temps. Après les incubations, aspirez le milieu et lavez les cellules trois fois avec du PBS, puis détachez les cellules avec 0,5 millilitre de tripsin EDTA et comptez-les.

Ensuite, faites tourner les cellules pendant cinq minutes à 400 fois G et à température ambiante. Aspirez le milieu et mettez à nouveau la pastille en suspension dans du PBS jusqu’à une densité finale de deux fois 10 à la cinquième cellules par millilitre. Pipeter 100 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’un 96.

Mesurez la fluorescence des cellules dans un spectrophotomètre de fluorescence réglé sur une excitation de 417 nanomètres et une émission de 652 nanomètres. Préparez ensuite une courbe standard en plaquant 100 microlitres de zéro à quatre milligrammes par millilitre de concentrations de M-T-H-P-C en trois exemplaires. Dans une plaque de 96 puits et mesurez la fluorescence comme nous venons de le démontrer pour générer une courbe standard pour calculer l’unité de fluorescence relative de chaque cellule contenant bien à partir de la plaque précédemment mesurée.

Pour mesurer la phototoxicité du photosensibilisant, ensemencez d’abord 3000 cellules par puits en trois exemplaires pour chaque concentration de M-T-H-P-C dans une plaque de 96 puits, y compris des cellules de contrôle de la toxicité sombre pour chaque concentration de PHOTOSENSIBILISANT. Laissez les cellules adhérer toute la nuit à une fluidité de 50 à 60 % le lendemain. Incuber les cellules avec une gamme de concentrations M-T-H-P-C dans l’obscurité pendant cinq heures après l’incubation.

Aspirez le milieu et lavez les cellules deux fois avec du PBS et ajoutez un milieu frais sans M-T-H-P-C alors spécifique pour le spectre d’absorption M-T-H-P-C, en portant une protection oculaire appropriée. Réglez un laser à diode de 652 nanomètres sur une puissance de 21,88 milliwatts par centimètre carré à une hauteur de 13,5 centimètres. Éloignez-vous des cellules pour obtenir une dose d’énergie de cinq joules par centimètre carré.

Ensuite, allumez les cellules, à l’exception des cellules de contrôle de toxicité sombres, pendant 230 secondes après l’allumage. Gardez les cellules dans l’obscurité à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Ajoutez ensuite 10 microlitres de wst, un réactif pour 100 microlitres de milieu trois heures après l’ajout de wst, un réactif mesure l’absorbance des puits individuels à 415 nanomètres.

Enfin, calculez le nombre de cellules survivantes en plus du test WST. Le comptage direct des cellules est une deuxième méthode de mesure de la toxicité cellulaire. Pour calculer le pourcentage de cellules viables, ensemencez deux fois 10 à la quatrième cellules par puits dans 2 plaques de 24 puits et laissez-les adhérer pendant la nuit.

Le lendemain, incubez les cellules pendant cinq heures dans l’obscurité avec M-T-H-P-C et éclairez-les comme nous venons de le démontrer. Gardez les cellules de contrôle sombres dans l’obscurité après 24 heures, collectez le surnageant, lavez les cellules une fois avec des yeux de PBS et de trypsine, ils tournent enfin vers le bas des cellules et remettent en suspension la pastille dans 200 microlitres de milieu frais pour compter. Les résultats illustrés dans ce graphique montrent dans la partie supérieure l’absorption de M-T-H-P-C de manière dépendante du temps, avec une intensité de fluorescence de la suspension cellulaire représentant les niveaux intracellulaires de M-T-H-P-C.

Dans le panneau inférieur. L’absorption dose-dépendante du M-T-H-P-C peut être évaluée en mesurant la fluorescence du M-T-H-P-C à l’aide d’un spectrophotomètre de fluorescence. Ce graphique illustre l’absorption d’une concentration fixe de M-T-H-P-C d’une manière dépendante du temps, l’intensité de fluorescence de la suspension cellulaire représentant les niveaux intracellulaires de M-T-H-P-C.

Ce graphique montre l’absorption dose-dépendante de M-T-H-P-C dans les cellules Haass et 143 cellules B après une incubation de cinq heures. L’absorption dans la lignée cellulaire à haut taux métastatique 143 B était significativement plus élevée que dans la lignée cellulaire hôte parentale à faible métastase. La toxicité sombre dose-dépendante des cellules de l’ostéosarcome est démontrée.

143 lymphocytes B ont été traités avec différentes doses de M-T-H-P-C et comparés à des cellules non traitées, une diminution dose-dépendante de l’activité métabolique et du nombre de cellules mesurées par un test a été observée. Une diminution de la viabilité cellulaire a été reconnue à une concentration M-T-H-P-C égale ou supérieure à 2,5 microgrammes par millilitre. Le graphique du bas illustre la toxicité dose-dépendante du M-T-H-P-C.

Les cellules ont été traitées avec différentes doses M-T-H-P-C et un éclairage ultérieur à cinq joules par centimètre carré. Une diminution conséquente de l’activité métabolique cellulaire ainsi qu’une diminution du nombre de cellules ont été observées. Le développement de cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du cancer pour appliquer cette méthode à des modèles in vivo d’ostéosarcome ainsi qu’à d’autres investigations précliniques.