Name: Cytotoxique efficacité de la thérapie photodynamique dans les cellules ostéosarcome In Vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Découvrez l'efficacité cytotoxique de la thérapie photodynamique sur les cellules d'ostéosarcome in vitro. Cette méthode mesure l'absorption du photosensibilisateur M-T-H-P-C et évalue la viabilité cellulaire par dosage WST-1.

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Les auteurs tiennent à remercier biolitec Research GmbH (Jena, Allemagne) d&#39;avoir bien voulu nous communiquer la formulation liposomale de mTHPC, avec des remerciements particuliers à Susanna Gräfe et Arno Wiehe pour leur aide et leur expertise technique. Nous tenons également à remercier Kerstin Reidy, qui a généré une grande partie des résultats et était coresponsable de sa publication 11. Ce travail a été soutenu par des subventions du Schweizerischer Verein Balgrist, l&#39;Université de Zurich, le Krebsliga Zurich ainsi que par une subvention de la Fondation Walter L. et loup Johanna, Zurich, Suisse et une subvention de EuroNanoMed ERA-NET / SNF suisse National Science Foundation 31NM30-131004/1. Ce travail a également été soutenu par le programme (très médecine spécialisée) de l&#39;appareil locomoteur oncologie du canton de Zurich HSM.

Une. Comparaison de l&#39;absorption de mTHPC dans le respectifs faible et très métastatique HOS et 143B OS lignées cellulaires <ol><li> Préparer un milieu de culture cellulaire contenant du DMEM, Ham F12, et inactivé sérum de veau foetal de chaleur dans un rapport 4.5:4.5:1. Remarque: La formulation liposomale de la PS mTHPC a été dissous dans de l&#39;eau à une concentration finale de 1,5 mg / ml mTHPC. </li><li> Plaque de 0,2 x 10 6 cellules HOS et 143B / puits dans des plaques 6 puits (triple pour chaque condition) et laissez les cellules adhèrent nuit. Remarque: le nombre doit être ajusté à des lignées de cellules individuelles. A une confluence de 80-90% est le plus approprié au moment de l&#39;expérience. </li><li> Le jour suivant, incuber les cellules avec une concentration fixe de mTHPC pour différentes périodes de temps (de l&#39;absorption en fonction du temps), ou avec des concentrations croissantes de mTHPC pendant une période de temps fixe (dose d&#39;absorption dépendant). </li><li> Incuber les cellules avec mTHPC pendant p spécifiqueoints ou concentrations de mTHPC. Nota: Dans cette étude, à la fois le HOS et les lignées de cellules 143B ont été mises en incubation avec 0,6 ug / ml mTHPC pendant 0, 2,5, 5, ou 10 heures, ou avec 0, 0,6, 2,5 et 10 pg / ml mTHPC pendant 5 heures. Les périodes de temps et les doses appliquées peuvent varier en fonction de la lignée cellulaire qui est utilisée. </li><li> Rappelez-vous de toujours travailler dans l&#39;obscurité ou dans des conditions de lumière tamisée pour éviter l&#39;exposition de la lumière directe des cellules. </li><li> Après incubation des cellules dans des conditions indiquées, aspirer le milieu et laver les cellules trois fois avec du PBS. Ensuite, détacher les cellules avec 0,5 ml de trypsine / EDTA et compter les cellules. </li><li> Après détachement, centrifuger les cellules à 400 xg pendant 5 minutes, aspirer le milieu et remettre en suspension les cellules dans du PBS à une densité finale de 200 000 cellules / ml. </li><li> Introduire à la pipette 100 ul de la suspension cellulaire obtenue (soit 20 000 cellules) dans une plaque de 96 puits et de mesurer la fluorescence de ces cellules dans un spectrophotomètre à fluorescence. Le paramètres pour les mesures de fluorescence sont mTHPC: 417 nm pour l&#39;excitation et 652 nm pour l&#39;émission. </li><li> Pour calculer la quantité de mTHPC intériorisée par cellule, normaliser l&#39;unité de fluorescence relative (RFU) pour le nombre de cellules et le volume des cellules de la manière suivante: </li><li> Préparer une courbe d&#39;étalonnage en utilisant des concentrations différentes de mTHPC dans du PBS 0-4 pg / ml (mesures en triple utilisation). Introduire à la pipette 100 ul de chaque dilution dans une plaque de 96 puits et de mesurer la fluorescence des puits en utilisant les paramètres décrits dans l&#39;étape 1.6. </li><li> Diviser la RFU (obtenu pour 20 000 cellules) par la pente de la courbe d&#39;étalonnage linéaire de mTHPC, ce qui donne la concentration de mTHPC (en pg / ml) dans le puits. </li><li> Diviser cette concentration mTHPC par 10 pour obtenir le montant total de mTHPC dans un puits (en ug, soit 100 pi de suspension cellulaire) et diviser cette valeur par le volume de 20.000 cellules. </li><li> Calculer le volume de la formule pour une sphère: (4/3 x π) xr 3. Obtenir le rayon r en mesurant le diamètre de 20 cellules trypsinisées sous un microscope, et en divisant cette valeur par deux. </li><li> Enfin, normaliser toutes les valeurs à celles obtenues pour les cellules HOS après 10 h d&#39;incubation (dose d&#39;absorption dépendant) ou traitées avec 10 pg / ml mTHPC (absorption en fonction du temps), ce qui a été défini à 100%. </li></ol> 2. Mesure de la phototoxicité de PS In Vitro <ol><li> Fleurs 3000 cellules / puits dans une plaque de 96 puits (triple pour chaque concentration de mTHPC utilisés) et permettent de faire adhérer la nuit. Préparer même une plaque de 96 puits supplémentaires et de traiter les cellules comme décrit ci-dessous, puis les mettre de côté pour l&#39;imagerie de contraste de phase. Remarque: le nombre doit être ajusté pour chaque ligne de cellule individuelle. A une confluence de 50 à 60% au moment de l&#39;expérience est idéal. <ol><li> Gardez à l&#39;esprit pour ajouter le contrôle de toxicité dans l&#39;obscurité correspondant de cellules pour chacune des concentrations mTHPC. Lasoi sont des cellules qui seront incubés en l&#39;absence ou en présence de concentrations sélectionnées de mTHPC, mais ne sera pas allumé. </li></ol></li><li> Le jour suivant, incuber les cellules avec des concentrations différentes de mTHPC (0, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,03, 0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5 et 10 pg / ml) en fonction des lignées cellulaires et les garder dans l&#39;obscurité pendant 5 heures. <ol><li> Reportez-vous à la section 1.3.2 Remarque: Le temps d&#39;incubation avant l&#39;illumination dépend de la lignée cellulaire et le PS utilisé, par conséquent, il est recommandé de tester des concentrations différentes et de différents points dans le temps dans des expériences séparées. </li></ol></li><li> Après incubation pendant la période indiquée, laver les cellules deux fois avec du PBS et ajouter de nouvelles du milieu frais sans mTHPC. </li><li> Éclairer les cellules avec une diode laser de 652 nm, spécifique pour le spectre d&#39;absorption mTHPC (voir la figure 1). <ol><li> Réglez le laser à 21.88 mW / cm 2 puissance à une hauteur de 13,5 cm distance à partir des cellules, afin d&#39;obtenir une dose d&#39;énergie de 5 J / cm 2. Éclairer les cellules pour 230 sec. Ne pas éclairer les cellules sombres de contrôle de la toxicité (avec et sans mTHPC). Remarque: Toujours porter des lunettes pour protéger les yeux de la lumière laser utilisée pour l&#39;excitation du PS. </li></ol></li><li> Après l&#39;illumination, maintenir les cellules dans l&#39;obscurité à 37 ° C pendant 24 heures. Par la suite, ajouter de l&#39;eau tétrazolium soluble (WST-1) réactif (10 μl/100 ul de milieu). </li><li> Trois heures après l&#39;addition du réactif WST-1, mesurer l&#39;absorbance de chaque puits de la plaque à 96 puits à 415 nm. </li><li> Afin de calculer le pourcentage de cellules survivantes, réglez la moyenne des valeurs obtenues pour les cellules non traitées mTHPC pour chaque condition à 100% (c.-à-éclairés, sans mTHPC et non éclairée, sans mTHPC). </li></ol> 3. Estimation du nombre de cellules par Comptage des cellules <ol><li> Semences cellules 20000 / nousll dans une plaque de 24 puits et permettent de faire adhérer la nuit. </li><li> Incuber les cellules pendant 5 heures avec mTHPC (0,001, 0,003, 0,15, 0,6, et 1,25 pg / ml) et de les illuminer, comme décrit ci-dessus. </li><li> Recueillir le milieu, laver les cellules une fois avec du PBS, trypsiniser eux et à leur rassemblement par centrifugation à 400 g pendant 5 min. </li><li> Après centrifugation, aspirer le milieu et remettre en suspension les cellules dans 200 ul de milieu frais. </li><li> Compter les cellules dans une chambre de Neubauer. </li></ol>

<ol><li>Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+of+cancer.+Basic+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Transl.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications.</a> Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).</li>
<li>Agostinis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+of+cancer%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy of cancer: an update.</a> CA Cancer. 61, 250-281 (2011).</li>
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<li>Ma, L., Moan, J., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+new+photosensitizer%2C+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin%2C+for+use+in+photodynamic+therapy%3A+a+comparison+of+its+photobiological+properties+with+those+of+two+other+photosensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers.</a> Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).</li>
<li>Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTHPC-mediated+photodynamic+therapy+is+effective+in+the+metastatic+human+143B+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells.</a> Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).</li>
<li>Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+sensitivity+of+microvascular+endothelial+cells%2C+fibroblasts+and+tumor+cells+after+in+vitro+photodynamic+therapy+with+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.</a> Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).</li>
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<li>Burch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+canine+osseous+tumors+with+photodynamic+therapy%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt ou conflits d&#39;intérêts financiers concurrents.

Pour atteindre la cytotoxicité optimale en réponse à la PDT, il est essentiel de choisir les bons réglages de lumière laser et des temps d&#39;incubation. Les procédures décrites ici sont cohérentes et efficaces pour déterminer PS absorption et de quantifier la cytotoxicité induite par PDT in vitro. En utilisant les longueurs d&#39;onde d&#39;absorption spécifique de la PS mTHPC, l&#39;absorption cellulaire de PS peut être déterminée d&#39;une manière directe, et le PS peut être activé afin de générer des espèc...

L&#39;état du traitement de l&#39;art de l&#39;ostéosarcome (OS) d&#39;aujourd&#39;hui, une tumeur osseuse primaire, englobe une combinaison de chimiothérapie néoadjuvante et chirurgie. Ce schéma de traitement a révélé une augmentation du taux de patients avec une maladie localisée à partir d&#39;environ 20% avant l&#39;utilisation de la chimiothérapie de survie, à ce moment entre 60 à 70% 3, 4. Cependant, dans les deux dernières décennies, la survie globale des patients atteints de la maladie d&#39;OS locale a atteint un plateau 4, 5. De plus, 30 à 40% de ces patients rechutent dans les 3 ans après le diagnostic et les patients avec une maladie métastatique continuer à avoir un faible taux de survie de 20 à 30% 4, 6, 7. Pour améliorer les résultats de ces patients, de nouvelles stratégies thérapeutiques doivent être développées. La thérapie photodynamique (PDT), un lieu nouveau traitement anticancéreux, utilise la lumière d&#39;une longueur d&#39;onde spécifique pour l&#39;excitation d&#39;un photosensibilisanttizer (PS), qui s&#39;accumule dans les cellules tumorales après son injection dans la circulation sanguine. La lumière laser d&#39;excitation de la PS génère des radicaux oxygène en présence d&#39;oxygène, qui induisent une réaction cytotoxique dans les cellules tumorales et la mort cellulaire. Outre ce mécanisme primaire, deux PDT supplémentaire évoquée processus biologiques contribuent à la croissance tumorale réduite: PDT provoque une vasoconstriction et la formation de thrombus de la microvascularisation de la tumeur et, par conséquent, l&#39;hypoxie et l&#39;anoxie locale à l&#39;intérieur de la tumeur, ce qui conduit à un infarctus d&#39;une tumeur. Enfin, PDT blessé et les cellules tumorales meurent déclencher une réponse immunitaire locale, une caractéristique assez unique de PDT. Il s&#39;agit du système du complément et l&#39;activation des cellules dendritiques présentatrices d&#39;antigène 8. Ainsi, des conditions sont créées pour la présentation des antigènes tumoraux avec l&#39;activation subséquente des cellules lymphoïdes, qui conduit à une immunité spécifique de la tumeur. Jusqu&#39;à présent, la PDT a été utilisé pour traiter plusieurs types de tumeurs des tissus mous et hyperplasie du, comme la kératose actinique, l&#39;oesophage de Barrett, une tumeur endobronchique, cancer de la vessie, des carcinomes baso-cellulaires, et le traitement palliatif du cancer tête et cou 2. Le traitement est connu pour provoquer, à grande échelle d&#39;une nécrose locale avec seulement peu d&#39;effets secondaires, et a donc le potentiel pour éliminer de manière sélective du tissu tumoral. Malgré ces avantages, l&#39;application de la PDT reste techniquement plus exigeant que l&#39;administration de médicaments chimiothérapeutiques. Afin d&#39;obtenir une efficacité maximale, la concentration en PS, le temps d&#39;exposition de lumière et de transfert de l&#39;énergie totale de la lumière doivent être optimisés. Cela peut être fait dans des expériences in vivo, mais, en raison du grand nombre relatif de paramètres qui doivent être optimisé, il est plus efficace de déterminer les conditions optimales d&#39;abord in vitro. Dans les expériences décrites ci-dessous, nous avons testé l&#39;efficacité in vitro de la PDT en utilisant le PS 5,10,15,20-tétrakis-(méta-hydroxyphényl) chlOrin, en abrégé mTHPC (figure 1A). mTHPC est la substance active dans le médicament Foscan, qui est actuellement utilisé en clinique pour le traitement palliatif du cancer tête et cou. Il est l&#39;un des plus puissants PS, induisant des lésions cellulaires massif déjà à de faibles concentrations, et il a été démontré pour être supérieur à l&#39;autre PS en termes de pénétration de tissu 9, 10. Son spectre d&#39;absorption de la lumière (Figure 1B) montre deux pics importants, l&#39;un à 417 nm et une seconde à 652 nm, qui sont utilisés pour la localisation tissulaire de PS et d&#39;accumulation pour la PDT induction, respectivement. Actuellement, une formulation liposomale pour mTHPC est en cours de développement. Ici, nous décrivons les procédures de quantifier l&#39;absorption de cette formulation liposomale, et pour effectuer des PDT dans deux lignées de cellules humaines OS, le faible HOS métastatique et les cellules métastatiques 143B élevés. Certaines des données présentées ici ont été signalés plus tôt 11. Thapproche e décrit ici nous permet d&#39;étudier l&#39;effet d&#39;un phénotype métastatique sur PDT efficacité. Cellules 143B, orthotopiquement injectés dans les membres postérieurs des souris SCID immunodéficientes provoquent des métastases des tumeurs primaires intratibial, un modèle imitant de près la maladie de métastases humaine. Ainsi, les expériences proposées in vitro sont parfaitement adaptés pour évaluer les paramètres optimaux PDT pour être utilisés plus tard dans des expériences in vivo.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>PAA GmbH, Fribourg, Allemagne</td><td>E15-883</td><td></td></tr><tr><td>HAM F12</td><td>PAA GmbH, Fribourg, Allemagne</td><td>E15-817</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur</td><td>GIBCO, Bâle, Suisse</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>mTHPC</td><td>biolitec Research GmbH, Iéna, Allemagne</td><td></td><td>Comme cette formulation liposomale est issue de la R& D aucun numéro de catalogue n’est disponible pour le moment. Bouillon : 1,5 mg/ml ; fourni dans un mélange 9:1 de dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) et de dipalmitoylphosphatidylglycérol (DPPG ; pureté >99 %)</td></tr><tr><td>Spectramax Gemini XS lecteur de plaques</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>ID# 861</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Zeiss Observer.Z1</td><td>Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceralas PDT 652 nm Laser</td><td>biolitec AG, Jena, Allemagne</td><td>LD652nm2W400u</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de tétrazolium soluble dans l’eau (WST)</td><td>Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Suisse</td><td>1644807</td><td></td></tr></tbody></table>

cytotoxique efficacité de la thérapie photodynamique dans les cellules ostéosarcome<em&gt; in vitro</em

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Au cours des dernières années, on a observé la difficulté de trouver des traitements plus efficaces contre le cancer avec moins d&#39;effets secondaires systémiques. Par conséquent thérapie photodynamique est une nouvelle approche pour un traitement sélectif plus de tumeur. La thérapie photodynamique (PDT) qui rend l&#39;utilisation d&#39;un photosensibilisateur non toxique (PS), qui, lors de l&#39;activation avec de la lumière d&#39;une longueur d&#39;onde spécifique en présence d&#39;oxygène, génère des radicaux oxygène qui suscitent une réponse cytotoxique 1. Malgré son approbation il ya près de vingt ans par la FDA, PDT n&#39;est plus utilisé que pour traiter un nombre limité de types (de la peau, de la vessie) et les maladies nononcological (psoriasis, la kératose actinique) 2 cancer. L&#39;avantage majeur de l&#39;utilisation de la PDT est la capacité à effectuer un traitement local, ce qui empêche les effets secondaires systémiques. En outre, il permet le traitement de tumeurs sur des sites sensibles (par exemple autour des nerfs ou des vaisseaux sanguins). Ici, un intraoperative demande de PDT est considéré dans l&#39;ostéosarcome (OS), une tumeur de la moelle, à une cible, les satellites de la tumeur primaire a laissé la tumeur dans les tissus environnants après la résection chirurgicale de la tumeur. Le traitement vise à diminuer le nombre de récidives et à réduire le risque de (post-opératoire) métastase. Dans la présente étude, nous présentons in vitro procédures PDT à établir les paramètres PDT optimales pour un traitement efficace de lignées cellulaires OS largement utilisés qui sont utilisés pour reproduire la maladie chez l&#39;homme dans les modèles de souris OS intratibial bien établies. L&#39;absorption de la PS mTHPC a été examiné avec un spectrophotomètre et la phototoxicité a été provoqué par une lumière laser excitation de mTHPC à 652 nm pour induire la mort cellulaire évaluée par un test WST-1 et par le comptage des cellules survivantes. Les techniques établies nous permettent de définir les paramètres optimaux PDT pour de futures études sur des modèles animaux. Ils sont un outil simple et rapide pour l&#39;évaluation de l&#39;efficacité de la TPD <em&gt; In vitro avant une application in vivo.

Avec les techniques ici rapportés, nous avons étudié PDT à base de mTHPC dans les cellules du système d&#39;exploitation de l&#39;homme. En premier lieu, l&#39;heure et la dose d&#39;absorption dépendant mTHPC a été étudiée dans le bas HOS métastatique et dans les lignées cellulaires hautement métastatiques 143B OS. mTHPC absorption peut être évaluée en mesurant la fluorescence de mTHPC avec un spectrophotomètre de fluorescence (figure 2, reproduite avec la permission de Reidy et al. 11).<...

Le protocole présenté ici permet l&#39;évaluation de l&#39;efficacité de la thérapie photodynamique (PDT) dans des lignées cellulaires et l&#39;optimisation des paramètres de PDT avant l&#39;application de la thérapie chez des modèles animaux.

Cytotoxique efficacité de la thérapie photodynamique dans les cellules ostéosarcome<em&gt; In Vitro</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

L’objectif général de l’expérience suivante est de montrer l’efficacité cytotoxique de la thérapie photodynamique dans les cellules d’ostéosarcome. Ceci est réalisé en mesurant d’abord l’absorption intracellulaire du photosensibilisant M-T-H-P-C par les cellules d’ostéosarcome. Dans la deuxième étape, une lumière laser est appliquée sur les cellules pour activer le M-T-H-P-C et produire des radicaux oxygénés cytotoxiques.Enfin, le métabolisme cellulaire et le nombre de cellules sont mesurés par un test de tétra-oléum soluble dans l’eau ou un test WST. En fin de compte, le test WST, ainsi que le comptage direct des cellules, peuvent être utilisés pour mesurer la cytotoxicité de la thérapie photodynamique sur les cellules de l’ostéosarcome. Les implications de cette technique s’étendent au traitement de l’ostéosarcome car elle permet de mesurer l’efficacité de la thérapie photodynamique in vitro et ressemble à la technique actuellement utilisée chez les patients.Pour comparer l’absorption M-T-H-P-C entre les lignées cellulaires d’ostéosarcome, commencez par plaquer 0,2 fois 10 au sixième Hoss et 143 cellules B par puits. En trois exemplaires dans des plaques à six puits, laisser les cellules adhérer pendant la nuit à une fluidité de 80 à 90 %, puis le lendemain, incuber les cellules avec une concentration fixe de M-T-H-P-C pendant différentes périodes de temps dans l’obscurité pour évaluer l’absorption du photosensibilisateur par les cellules en fonction du temps. Après les incubations, aspirez le milieu et lavez les cellules trois fois avec du PBS, puis détachez les cellules avec 0,5 millilitre de tripsin EDTA et comptez-les.Ensuite, faites tourner les cellules pendant cinq minutes à 400 fois G et à température ambiante. Aspirez le milieu et mettez à nouveau la pastille en suspension dans du PBS jusqu’à une densité finale de deux fois 10 à la cinquième cellules par millilitre. Pipeter 100 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’un 96.Mesurez la fluorescence des cellules dans un spectrophotomètre de fluorescence réglé sur une excitation de 417 nanomètres et une émission de 652 nanomètres. Préparez ensuite une courbe standard en plaquant 100 microlitres de zéro à quatre milligrammes par millilitre de concentrations de M-T-H-P-C en trois exemplaires. Dans une plaque de 96 puits et mesurez la fluorescence comme nous venons de le démontrer pour générer une courbe standard pour calculer l’unité de fluorescence relative de chaque cellule contenant bien à partir de la plaque précédemment mesurée.Pour mesurer la phototoxicité du photosensibilisant, ensemencez d’abord 3000 cellules par puits en trois exemplaires pour chaque concentration de M-T-H-P-C dans une plaque de 96 puits, y compris des cellules de contrôle de la toxicité sombre pour chaque concentration de PHOTOSENSIBILISANT. Laissez les cellules adhérer toute la nuit à une fluidité de 50 à 60 % le lendemain. Incuber les cellules avec une gamme de concentrations M-T-H-P-C dans l’obscurité pendant cinq heures après l’incubation.Aspirez le milieu et lavez les cellules deux fois avec du PBS et ajoutez un milieu frais sans M-T-H-P-C alors spécifique pour le spectre d’absorption M-T-H-P-C, en portant une protection oculaire appropriée. Réglez un laser à diode de 652 nanomètres sur une puissance de 21,88 milliwatts par centimètre carré à une hauteur de 13,5 centimètres. Éloignez-vous des cellules pour obtenir une dose d’énergie de cinq joules par centimètre carré.Ensuite, allumez les cellules, à l’exception des cellules de contrôle de toxicité sombres, pendant 230 secondes après l’allumage. Gardez les cellules dans l’obscurité à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Ajoutez ensuite 10 microlitres de wst, un réactif pour 100 microlitres de milieu trois heures après l’ajout de wst, un réactif mesure l’absorbance des puits individuels à 415 nanomètres.Enfin, calculez le nombre de cellules survivantes en plus du test WST. Le comptage direct des cellules est une deuxième méthode de mesure de la toxicité cellulaire. Pour calculer le pourcentage de cellules viables, ensemencez deux fois 10 à la quatrième cellules par puits dans 2 plaques de 24 puits et laissez-les adhérer pendant la nuit.Le lendemain, incubez les cellules pendant cinq heures dans l’obscurité avec M-T-H-P-C et éclairez-les comme nous venons de le démontrer. Gardez les cellules de contrôle sombres dans l’obscurité après 24 heures, collectez le surnageant, lavez les cellules une fois avec des yeux de PBS et de trypsine, ils tournent enfin vers le bas des cellules et remettent en suspension la pastille dans 200 microlitres de milieu frais pour compter. Les résultats illustrés dans ce graphique montrent dans la partie supérieure l’absorption de M-T-H-P-C de manière dépendante du temps, avec une intensité de fluorescence de la suspension cellulaire représentant les niveaux intracellulaires de M-T-H-P-C.Dans le panneau inférieur. L’absorption dose-dépendante du M-T-H-P-C peut être évaluée en mesurant la fluorescence du M-T-H-P-C à l’aide d’un spectrophotomètre de fluorescence. Ce graphique illustre l’absorption d’une concentration fixe de M-T-H-P-C d’une manière dépendante du temps, l’intensité de fluorescence de la suspension cellulaire représentant les niveaux intracellulaires de M-T-H-P-C.Ce graphique montre l’absorption dose-dépendante de M-T-H-P-C dans les cellules Haass et 143 cellules B après une incubation de cinq heures. L’absorption dans la lignée cellulaire à haut taux métastatique 143 B était significativement plus élevée que dans la lignée cellulaire hôte parentale à faible métastase. La toxicité sombre dose-dépendante des cellules de l’ostéosarcome est démontrée.143 lymphocytes B ont été traités avec différentes doses de M-T-H-P-C et comparés à des cellules non traitées, une diminution dose-dépendante de l’activité métabolique et du nombre de cellules mesurées par un test a été observée. Une diminution de la viabilité cellulaire a été reconnue à une concentration M-T-H-P-C égale ou supérieure à 2,5 microgrammes par millilitre. Le graphique du bas illustre la toxicité dose-dépendante du M-T-H-P-C.Les cellules ont été traitées avec différentes doses M-T-H-P-C et un éclairage ultérieur à cinq joules par centimètre carré. Une diminution conséquente de l’activité métabolique cellulaire ainsi qu’une diminution du nombre de cellules ont été observées. Le développement de cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du cancer pour appliquer cette méthode à des modèles in vivo d’ostéosarcome ainsi qu’à d’autres investigations précliniques.

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