Name: Une méthode dextension cGMP applicable pour les agrégats de neurones humains des cellules souches et progénitrices dérivées de cellules souches pluripotentes ou fœtale tissu cérébral (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Découvrez une méthode de hachage mécanique pour étendre les agrégats de cellules souches neurales humaines sans dissociation enzymatique. Cette technique préserve les contacts cellulaires et permet une croissance logarithmique stable sur plus de 40 passages.

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Nous remercions le Dr Soshana Svendsen à la critique et l&#39;édition de ce rapport. Ce travail a été fourni par le NIH / NINDS 1U24NS078370-01 et le CIRM DR2A-05320.

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

<img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig6highres.jpg" width="500" /> Figure 6. Schéma découper. L&#39;expansion des cellules souches du sphéroïde / progénitrices en culture selon la méthode de découpage mécanique. Étapes critiques Un aperçu du paradigme de l&#39;expansion de coupe est représentée sur la figure 6. HNPC taille de la sphère est l&#39;...

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Brandon C. Shelley 
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Clive Svendsen

A correction was made to <a href="/video/51219">A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue</a>. The corresponding author was changed.

Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Il ya une longue histoire de l&#39;expansion des cellules souches neurales rongeurs en culture soit une monocouche 1-3 ou 4-7 neurosphères globales. En outre, les cellules progénitrices neurales humaines (hNPCs) isolés à partir de différentes régions du développement du système nerveux central 8-17 ont été élargies in vitro. Ces cellules sont bi-puissant, capable de se différencier en astrocytes et les neurones les deux et ont été un outil très utile pour étudier le développement neural 18,19 et 20,21 mécanisme maladie. hNPCs ont également été transplantées dans de nombreux modèles de la maladie du système nerveux central des animaux différents avec différents niveaux d&#39;intégration, à la survie et les effets fonctionnels 22-24. Traditionnellement, les rongeurs ou NPC foetales humaines dérivées sont exposés à des facteurs de croissance épidermique - souvent facteur de croissance (EGF) et / ou le facteur de croissance des fibroblastes-2 (FGF-2) et 25 à 28 - 29 à la fois adhérent et troisSystèmes de sphéroïdes dimensions sont généralement soumises à des passages en utilisant la dissociation enzymatique dans une suspension à cellule unique 30-34. La méthode standard pour développer des cellules pour la recherche ou l&#39;utilisation clinique est comme une monocouche adhérente raison d&#39;une manipulation facile. Cependant, nous avons montré que des passages monocouches et neurosphères hNPCs avec des solutions chimiques ou enzymatiques ont donné lieu à la sénescence précoce 35. En outre, la dissociation enzymatique peut entraîner une augmentation des niveaux de différenciation et des anomalies caryotypiques d&#39;après les données démontré avec des cellules souches embryonnaires de 36 à 38. Bien que la méthode standard de hNPCs de passages a produit les bonnes pratiques de fabrication (BPF) des produits de qualité qui sont passés en phase 1 des essais cliniques (cellules souches Inc., Neuralstem Inc.), la méthode autorisée seulement quelques cycles d&#39;amplification cellulaire, ce qui limite la potentiel bancaire. De toute évidence, les grandes expériences de recherche et d&#39;essais cliniques futurs pourraient bénéficier de la capacité depropager des cellules en vrac et à la sénescence retardée pour permettre la croissance à grande échelle et de banques de cellules. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé une façon nouvelle et automatisé de neurosphères intactes mécaniquement passages par &quot;couper&quot; en petits groupes pour maintenir le contact de cellule à cellule. Ce procédé augmente considérablement leur durée de vie et la culture en suspension 39 permet une utilisation plus efficace de l&#39;espace de l&#39;incubateur par rapport aux cultures en monocouche, comme on le voit avec une méthode de culture 3D de bioréacteur alternatif 40. Le protocole permet de hachage prévu pour la production de banques à grande échelle d&#39;un échantillon foetal supérieur passage 10, un exploit peu probable en utilisant des procédés standards de repiquage. Bien que cette méthode pour hNPCs de repiquage n&#39;est pas conventionnelle, il est de plus en plus en popularité et a été récemment publié avec d&#39;autres types tels que les cellules souches neurales dérivées de l&#39;embryon humain et les cellules souches pluripotentes induites cellulaires, permettant l&#39;expansion à grande échelle pour diverses applications, notamment dans vITRO modélisation de la maladie 41-46. Surtout, un hNPC banque de cellules cGMP de qualité a déjà été produit avec le procédé de hachage, ce qui démontre que la technique peut être appliquée à de futures applications cliniques.

<table><tbody><tr><td>Bécher, 50 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-100-50</td> plusieurs <td>fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Armoire de biosécurité, classe II</td><td>Baker</td><td>SG-603A</td><td>Modèle de 4 pi ou 6 pi.&nbsp ; Modèle de 6 pi recommandé ; plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Lames, Préparation à double tranchant</td><td>Personna</td><td>74-0002</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs.&nbsp ; ATTENTION :</td></tr><tr><td>Média de congélation Sharp Cell</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6295-50ML</td><td>DMSO, centrifugeuse sans sérum</td></tr><tr><td>, seau pivotant avec inserts de 15 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td> plusieurs <td>fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Tubes coniques, 15 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>S50712</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Tubes coniques, 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352074</td><td>plusieurs fabricants/ fournisseurs</td></tr><tr><td>Congélateur à débit contrôlé</td><td>Planer</td><td>Kryo 750</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Cryoflacons, 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Flacon de culture, Ventilé, T12.5</td><td>BD Falcon</td><td>353107</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Flacon de culture, Ventilé, T25</td><td>BD Falcon</td><td>353081</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Flacon de culture, Ventilé, T175</td><td>BD Falcon</td><td>353045</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Flacon de culture, Ventilé, T75&nbsp ;</td><td>BD Falcon</td><td>353110</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Filtre, 0.22 &micro ; m, coupelle attachée, 1 L</td><td>Millipore</td><td>SCGPU11RE</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Filtre, 0,22 & micro ; m, tasse attachée, 150 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGVU01RE</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Filtre, 0,22 & micro ; m, tasse attachée, 500 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Filtre, 0,22 & micro ; m, gobelet attaché, 50 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Papier filtre, cercles de 8,5 cm</td><td>Whatman/GE</td><td>1001-085</td><td></td></tr><tr><td>Pince, motif standard - Dentelé/Courbé/18 cm</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>11001-18</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de congélation, alcool isopropylique</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>"Mr. Frosty"</td></tr><tr><td>Incubateur, 37 &deg ; C/5 % CO2</td><td>Forma</td><td>série 370 plusieurs</td><td>fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Hémacytomètre, Phase</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Lafayette Instruments</td><td>TC752-</td><td>&nbsp ; Modification de la boîte de Pétri requise.&nbsp ; &nbsp ; MISE EN GARDE&NBSP ; Lame mobile et tranchante.</td></tr><tr><td>Micropipeteur, 1-10 &mu ; l</td><td>Gilson</td><td>F144562</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Micropipettor, 100-1 000 &mu ; l (kit de démarrage)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Micropipeteur, 2-20 &mu ; l (kit de démarrage)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Micropipeteur, 20-200 &mu ; l (kit de démarrage)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Tournevis, Autoclavable, 5/16</td>"<td>Steritool</td><td>10302</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipets, coton</td><td>bouché Fisherbrand</td><td>13-678-8B</td> plusieurs <td>fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri, Verre, Autoclavable</td><td>Corning</td><td>3160-100</td><td></td></tr><tr><td>Aide à la pipette</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Disque de cale</td><td>McMaster-Carr</td><td>VARIABLE</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Pointes de pipette à barrière stérile, 10 &mu ; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV10R-H</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Pointes de pipette à barrière stérile, 1 000 &mu ; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV1000</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Pointes de pipette à barrière stérile, 20 &mu ; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV20-H</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Pointes de pipette à barrière stérile, 200 &mu ; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV200-H</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Pipettes jetables stériles, emballage entièrement plastique, 10 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10J</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Pipettes jetables stériles, emballage tout plastique, 2 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-675-3C</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Pipettes jetables stériles, emballage entièrement plastique, 25 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10K</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Stérile Pipettes jetables, tout en plastique, 5 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10H</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Sachets de stérilisation, 19 x 33 cm</td><td>Crosstex</td><td>SCL</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Passoire, 40 & micro ; m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture tissulaire, 60 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Supports de tubes, à quatre voies imbriquées</td><td>Fisherbrand</td><td>03-448-17</td><td></td>Bain-marie</tr><tr><td></td><td>Fisherbrand</td><td>S52602Q</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Progéniteur neural Réactifs</td><td></td><td></td><td></td>de traitement spécifiques</tr><tr><td>aux cellules Cellules souches neurales Moyen d’expansion (Stemline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3194-500ML</td><td>Important d’utiliser la marque Stemline</td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique humain recombinant (EGF)</td><td>Millipore</td><td>GF316</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Facteur inhibiteur de la leucémie humaine recombinante (LIF)</td><td>Millipore</td><td>LIF1010</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>Bleu trypan (0,4 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td>plusieurs fabricants/fournisseurs</td></tr><tr><td>TrypLE Select (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12563-011</td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode d&#39;extension cgmp applicable pour les agrégats de neurones humains des cellules souches et progénitrices dérivées de cellules souches pluripotentes ou fœtale tissu cérébral

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Une technique d&#39;expansion cellulaire d&#39;amasser un grand nombre de cellules à partir d&#39;un seul échantillon pour des expériences de recherche et d&#39;essais cliniques bénéficierait grandement de la communauté sur les cellules souches. De nombreuses méthodes d&#39;expansion actuels sont laborieuses et coûteuses, et ceux qui impliquent la dissociation complète peuvent provoquer plusieurs types de souches et de cellules progénitrices à subir une différenciation ou la sénescence précoce. Pour surmonter ces problèmes, nous avons mis au point une méthode de repiquage mécanique automatisé dénommé &quot;hachage&quot; qui est simple et peu coûteux. Cette technique évite la dissociation chimique ou enzymatique dans les cellules simples et place permet l&#39;expansion à grande échelle de suspension, cultures sphéroïde qui maintiennent le contact cellule / cellule constante. Le procédé de hachage a été utilisée principalement pour les cellules cérébrales fœtales dérivé progénitrices neurales ou des neurosphères, et a été récemment publiée pour une utilisation avec des cellules souches neurales dérivées de cellules souches embryonnaires pluripotentes et induits. La procédure impliquantes semis neurosphères sur une culture de tissu boîte de Pétri, puis en passant une lame tranchante, stérile à travers les cellules automatiser efficacement le processus fastidieux de la main dissocier mécaniquement chaque sphère. Mise en suspension des cellules en culture fournit une surface rapport favorable surface sur volume; que plus de 500 000 cellules peuvent être cultivées dans un seul neurosphères de moins de 0,5 mm de diamètre. Dans un flacon T175, plus de 50 millions de cellules peuvent se développer dans des cultures en suspension contre seulement 15 millions en cultures adhérentes. Surtout, la procédure de hachage a été utilisé dans les bonnes pratiques de fabrication (cGMP), permettant la production de la quantité de masse de produits de cellules de qualité clinique.

<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig5highres.jpg" width="500" /> Le nombre de cellules Figure 5. Des données représentatives. A) prévues de hNPCs congelés à p19, puis décongelés et élargis comme monocouche adhérente utilisant dissociation enzymatique par rapport à neurosphères à des passages par la méthode de hachage. Jour 0 représente lorsque les cellules ont été décongelées à p20. B) Des images repr...

Ce protocole décrit un procédé de découpage mécanique nouvelle qui permet l&#39;expansion de souches et de cellules progénitrices neurales agrégats sphériques sans dissociation d&#39;une suspension cellulaire unique. Maintenir le contact cellule / cellule permet une croissance rapide et stable depuis plus de 40 passages.

Une méthode d&#39;extension cGMP applicable pour les agrégats de neurones humains des cellules souches et progénitrices dérivées de cellules souches pluripotentes ou fœtale tissu cérébral

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de repiquer efficacement les neurosphères afin de maintenir le contact cellule-cellule tout au long de la durée de vie des cellules en culture. Cette technique crée les conditions d'expansion nécessaires aux cellules souches neurales humaines. Elle consiste à combiner jusqu'à deux flacons T175 contenant les mêmes cellules, puis à les transférer dans un tube conique, permettant ainsi de transférer les sphères dans une boîte de Pétri. Lors d'une deuxième étape, les neurosphères en suspension sont condensées en une masse facile à manipuler dans la boîte de Pétri, ce qui permet à la lame de découper les H NPCs en petits agrégats.Ensuite, les neurosphères passagées ou hachées sont remises en suspension afin de retirer les cellules de la boîte de Pétri et de les répartir dans de nouveaux flacons. Les résultats obtenus montrent que la technique de hachage constitue une stratégie de croissance à long terme, fondée sur les courbes d'expansion qui démontrent des taux de croissance logarithmique à long terme par rapport aux cellules passagées par l'approche enzymatique standard. La démonstration visuelle de cette technique est essentielle en tan

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