Une méthode d'extension cGMP applicable pour les agrégats de neurones humains des cellules souches et progénitrices dérivées de cellules souches pluripotentes ou fœtale tissu cérébral
15 juin 2014
Ce protocole décrit un procédé de découpage mécanique nouvelle qui permet l'expansion de souches et de cellules progénitrices neurales agrégats sphériques sans dissociation d'une suspension cellulaire unique. Maintenir le contact cellule / cellule permet une croissance rapide et stable depuis plus de 40 passages.
L’objectif global de l’expérience suivante est de faire passer efficacement les neurosphères afin que le contact de cellule à cellule soit maintenu tout au long de la durée de vie des cellules cultivées. Cette technique crée les conditions d’expansion nécessaires aux cellules progénitrices neurales humaines. Ceci est réalisé en combinant jusqu’à deux flacons T 1 75 des mêmes cellules, et en les transférant dans un tube conique, permettant le transfert des sphères dans une boîte de Pétri comme une deuxième étape condensée en neurosphères suspendues en une masse gérable sur la boîte de Pétri, ce qui permet à la lame de couper les NPC H en petits groupes.
Ensuite, les neurosphères passées ou hachées sont remises en suspension afin de retirer les cellules de la boîte de Pétri et de les mettre dans les nouveaux flacons. Les résultats obtenus montrent que la technique de hachage fournit une stratégie de croissance à long terme basée sur les courbes d’expansion, démontrant des taux de croissance logarithmiques à long terme par rapport aux cellules passées via l’approche enzymatique standard. La démonstration visuelle de cette technique est essentielle en tant que sphère.
Les étapes de condensation sont difficiles à décrire par écrit. Il existe également plusieurs astuces pour vous aider dans le processus. Si l’excès de média n’est pas complètement retiré de la boîte de Pétri, les sphères seront simplement déplacées dans le milieu au lieu d’être divisées en grappes plus petites.
Commencez cette procédure en abordant la couleur du support du flacon des PNJ H. Parcourez le flacon au microscope pour observer les cellules. Si possible, utilisez un radical pour examiner la taille de plusieurs sphères.
Si de nombreuses sphères ont un diamètre de 300 micromètres ou plus, procédez au processus de hachage et hachez les cellules tous les sept à 10 jours. Remettez ensuite le flacon dans l’incubateur et installez le hachoir. Allumez l’interrupteur d’alimentation de l’hélicoptère.
Dans le BSC, réglez l’épaisseur de hachage à 200 micromètres et la force de la lame à 180 degrés ou à neuf heures. Ensuite, vérifiez que le bouton de vitesse automatique est tourné aussi loin que possible dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Déplacez ensuite le bouton de déverrouillage de la table aussi loin que possible vers la droite et vérifiez que le support de plaque est stable.
Tournez le manipulateur manuel dans le sens des aiguilles d’une montre pour lever le bras à son niveau maximum. Ensuite, transférez de manière aseptique une lame de hachage stérile à double tranchant sur le boulon du bras du hachoir. À l’aide d’une paire de pinces, placez le fermoir sur la lame à l’aide de la pince.
La partie incurvée du fermoir doit être sur le bord supérieur du bras. Ensuite, tenez le fermoir sur le bras et fixez l’écrou sur le boulon. Avec la clé à douille stérile, laissez l’écrou desserré d’un quart de tour.
Dans cette procédure, transférez la quantité recommandée de milieu d’entretien dans le nouveau flacon. Ensuite, transférez aseptiquement les cellules de l’incubateur vers l’ESB. Étalez le ballon sur une grille tubulaire et laissez les sphères se déposer dans le ballon.
L’un d’eux s’est installé. Aspire jusqu’à 12 millilitres de surnageant. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, rincer toutes les sphères légèrement adhérentes de la surface du flacon.
Répétez l’opération si nécessaire et laissez les sphères se déposer entre Rens. Ensuite, transférez le volume suggéré de milieu conditionné dans le nouveau flacon. Transférez ensuite tous les fluides et sphères conditionnés restants dans un nouveau tube conique de 15 millilitres.
Laissez les sphères se déposer et jetez la fiole usagée. Après cela, transférez lentement les cellules du tube conique de 15 millilitres sur la boîte de Pétri de 60 millimètres ou le disque de cale dans le volume le plus bas possible. Conservez le reste du milieu conditionné car il sera utilisé pour rincer les cellules du plat après le hachage.
Essayez de minimiser la surface couverte par les médias et les sphères sur le plat. Ensuite, commencez à condenser le bassin sphérique en transférant le super natin dans le tube conique de 15 millilitres. Retirez autant de support que possible du haut de la piscine de cellules de média à l’aide d’un micro-pipeteur à pointe anti-aérosol.
Jusqu’à ce qu’il ne soit plus possible de retirer les supports sans sphères, puis étalez la piscine. En utilisant le côté de la pointe de la pipette pour augmenter la surface, inclinez légèrement la boîte de Pétri et utilisez le côté de la pointe de la pipette pour faire glisser doucement toutes les sphères d’un côté de la piscine. Une fois que toutes les cellules ont été déplacées, inclinez lentement la boîte de Pétri dans la direction opposée pour permettre au milieu de se séparer des sphères.
Ensuite, transférez le média nettoyé dans le tube conique de 15 millilitres. Utilisez le côté de la pointe de la pipette pour faire glisser doucement toutes les sphères vers le centre de la boîte de Pétri. Ainsi, la piscine a un diamètre de 0,5 à 2,4 centimètres.
Il est important de garder la profondeur de la piscine sphérique peu profonde. Si la piscine est trop profonde, les sphères seront écartées lors du hachage. Maintenant, transférez la boîte de Pétri sur le support de plaque et fixez-la sous les crochets du porte-plaque.
Utilisez le bouton de déverrouillage de la table pour faire glisser le support de plaque vers la gauche afin que la lame soit dégagée des sphères et verrouillée dans l’engrenage. Ensuite, abaissez le bras du hachoir en tournant le bouton du manipulateur manuel dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que la lame s’enclenche à plat sur la boîte de Pétri. Appuyez sur le support du bras tout en serrant l’écrou.
Appuyez ensuite sur le bouton de réinitialisation. Une fois fixez la boîte de Pétri d’une main tout en tournant le bouton du manipulateur automatique du bras dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à la position 90 degrés ou 12 heures et commencez à hacher lorsque toutes les sphères ont été hachées. Faites pivoter le support de plaque de 90 degrés.
Desserrez ensuite le boulon, abaissez le bras et resserrez l’écrou. Répétez la procédure de hachage. Ensuite, de manière aseptique, transférez la boîte de Pétri du support de plaque sur un espace de travail dans le BSC.
Transférez un millilitre de média conditionné sur les sphères hachées. Ensuite, remettez doucement en suspension et transférez les sphères hachées dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Essayez d’éviter de former des bulles et répétez autant de fois que nécessaire pour collecter les sphères hachées.
Mesurez le volume du milieu conditionné et des sphères hachées. Ajoutez la quantité appropriée de support d’entretien pour atteindre le volume suggéré dans la deuxième colonne du tableau E.Après cela, Eloqua la suspension de la sphère dans chaque nouveau flacon ne transfère la suspension de la sphère que dans un seul ballon à la fois et remet les sphères en suspension entre les transferts. Le volume final de chaque flacon doit être égal au volume suggéré dans le tableau deux Colonne F.Placez les PNJ h hachés dans l’incubateur.
Cette figure montre le nombre projeté de cellules de NPC H congelés au passage 19, puis décongelés et expansés en tant que monocouche adhérente par dissociation enzymatique par rapport aux neurosphères traversées par la méthode de hachage. Voici les images représentatives de sphères pré-découpées et post-coupées à un grossissement de 10 x. Cette image montre le passage de décongélation des 29 PNC H qui ont été plaqués pendant une journée et colorés pour le nid et l’expression, tandis que cette image montre le passage de décongélation des 29 PNC H qui ont été plaqués pendant sept jours en l’absence de facteurs de croissance et colorés pour le GFAP et la tubuline bêta-trois.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la technique de hachage automatisé pour faire passer les HBC, qui maintient le contact de cellule à cellule tout au long de la vie des cellules et de la culture. Cette procédure peut être adaptée à une multitude de types de cellules, telles que les cellules souches neurologiques dérivées de cellules pluripotentes ou les cardiosphères.
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Aperçu
Ce protocole décrit une nouvelle méthode mécanique de hachage permettant l'expansion d'agrégats sphériques de cellules souches et progénitrices neuronales sans dissociation en une suspension monocellulaire. Le maintien du contact cellule/cellule permet une croissance rapide et stable pendant plus de 40 passages.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Recherche sur les cellules souches
Contexte
- Le passage efficace des neurosphères est essentiel pour maintenir la viabilité cellulaire.
- Les méthodes traditionnelles perturbent souvent les contacts entre cellules.
- La présente étude explore une technique de découpage mécanique afin d'améliorer la croissance.
- Des stratégies de croissance à long terme sont indispensables pour les cellules souches neurales humaines.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode permettant de maintenir les contacts entre cellules lors du passage.
- Comparer les taux de croissance des neurosphères hachées et des méthodes enzymatiques standard.
- Fournir une démonstration visuelle de la technique de hachage.
Méthodes utilisées
- Combiner jusqu'à deux flacons T 1 75 contenant les mêmes cellules.
- Transférer les cellules dans un tube conique pour un traitement ultérieur.
- Couper les agrégats en petits amas à l’aide d’une lame.
- Resuspendre les neurosphères hachées pour les transférer dans de nouveaux flacons.
Résultats principaux
- La technique de hachage permet des taux de croissance logarithmiques à long terme.
- Les résultats indiquent une amélioration de la croissance par rapport aux méthodes traditionnelles.
- Des démonstrations visuelles mettent en évidence l'efficacité de la technique.
- Les neurosphères hachées ont conservé une meilleure viabilité cellulaire au fil du temps.
Conclusions
- La méthode mécanique de hachage est efficace pour l'expansion des cellules progénitrices neuronales.
- Le maintien du contact entre cellules est essentiel pour une croissance optimale.
- Cette technique offre une alternative prometteuse au passage enzymatique.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode de hachage mécanique permet une expansion évolutive d'agrégats de cellules souches et progénitrices neuronales humaines tout en préservant les contacts critiques entre cellules, résolvant ainsi un goulot d'étranglement majeur dans la production de cellules souches pour des applications tant de recherche que cliniques. En évitant la dissociation enzymatique, cette technique réduit la pression de différenciation et le risque de sénescence, favorisant ainsi une production constante de produits cellulaires neuronaux pertinents sur le plan clinique dans des conditions de bonnes pratiques de fabrication (cGMP). Cette méthode s'impose donc comme un outil précieux pour réduire les risques lors de la validation précoce de cibles neuronales et permettre la génération reproductible de modèles précliniques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Préserve les interactions physiologiques entre cellules dans les cultures de progéniteurs neuronaux, favorisant des études d'engagement des cibles plus biologiquement pertinentes.
- Valeur opérationnelle : Permet une expansion à long terme sur plus de 40 passages, assurant un approvisionnement cellulaire durable pour des campagnes itératives de validation des cibles.
Tests et développement de dosages
- Valeur scientifique : Produit des cultures de sphéroïdes homogènes, adaptées aux formats d'essai standardisés nécessitant une architecture cellulaire tridimensionnelle.
- Valeur opérationnelle : Génère des rendements élevés (>50 millions de cellules par flacon T175) par rapport aux cultures adhérentes, améliorant ainsi le débit de criblage et l'efficacité des réactifs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet la modélisation pertinente des maladies en permettant l'expansion de cellules dérivées de cellules souches pluripotentes ou de tissus fœtaux sans dérive phénotypique.
- Valeur opérationnelle : Compatible avec la fabrication conforme aux BPF, facilitant la transition fluide de la découverte à la production à échelle clinique.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode de découpage s'inscrit dans la continuité découverte-préclinique en permettant une expansion fiable des cellules progénitrices neuronales pour la validation de cibles, le développement de tests et l'atténuation des risques mécanistiques avant l'identification de composés leaders.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses grâce à la culture prolongée d'agrégats neuronaux physiologiquement pertinents.
- Triage : Fournit des résultats reproductibles avec un grand nombre de cellules, essentiels à la normalisation des tests et aux campagnes de criblage de composés.
- Analytique : Permet la quantification des cinétiques d'expansion et des paramètres de viabilité afin d'éclairer les décisions de poursuite ou d'abandon.
- Recherche translationnelle : Préserve la fidélité cellulaire du stade de découverte à la validation préclinique, réduisant ainsi la variabilité biologique.
- Réutilisation en milieu industriel : Met en place une plateforme de repiquage automatisée et évolutive, applicable à plusieurs sources de cellules souches neurales.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive grâce au maintien des contacts cellulaires natifs et à la réduction des artefacts induits par la culture.
- Valeur opérationnelle : Le passage mécanique standardisé minimise la variabilité entre utilisateurs et permet des procédés reproductibles et évolutifs.
- Valeur stratégique : Réduit les risques biologiques dans les programmes ciblant le système nerveux en assurant une qualité cellulaire constante au fil des passages.
- Impact sur le portefeuille : Permet des décisions d'avancement ajustées au risque grâce à un approvisionnement fiable en cellules conforme aux BPF pour les études précliniques et cliniques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une formation à la technique aseptique et à l'utilisation du hachoir mécanique.
- Suppose l'accès à des lames stériles, des tubes coniques, des boîtes de Pétri et des incubateurs.
- Exige des étapes standardisées de condensation et de resuspension afin d'assurer une distribution uniforme de la taille des sphères.
- L'adaptation à différents systèmes modèles peut nécessiter une optimisation de l'épaisseur de hachage et de la force appliquée à la lame.
- Les limitations pratiques incluent la nécessité d'étapes manuelles de retrait du milieu lors de la condensation, ce qui peut affecter le débit si ces étapes ne sont pas optimisées.
