Name: Lapproche ChroP Combine puce et la spectrométrie de masse à Disséquer protéomiques paysages Locus spécifiques de la chromatine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-11T21:00:00.000+00:00
Duration: 24 min 2 s
Description: Découvrez l'approche ChroP pour analyser la composition protéomique des domaines chromatiniens spécifiques. Cette méthode combine immunoprécipitation et spectrométrie de masse haute résolution.

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Cette recherche a été publié à l&#39;origine dans Mol Cell Proteomics. Soldi M. et T. Bonaldi La protéomique enquête de la chromatine domaines fonctionnels Révèle nouveaux Synergismes entre Distinct hétérochromatine Composants MCP. 2013; 12: 64-80. © l&#39;American Society for Biochemistry and Molecular Biology. Nous remercions Roberta Noberini (Institut Italien de Technologie et l&#39;IEO, Italie) pour la lecture critique du manuscrit. travail de la tuberculose est soutenu par des subventions du-Armenise Harvard Programme Giovanni Fondation de développement de carrière, l&#39;Association italienne pour la recherche du cancer et le ministère italien de la Santé. Travail MS a été soutenue par une bourse FIRC.

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous avons récemment décrit ChroP, une stratégie pour la caractérisation quantitative à grande échelle des composants protéiques de la chromatine. ChroP combine deux approches complémentaires utilisés dans le domaine de l&#39;épigénétique, la puce et MS, profitant de leurs points forts et de surmonter leurs limitations respectives. ChIP couplé à un séquençage profond (ChIP-Seq) permet la cartographie du génome de modifications des histones à la résolution de quelques nucléosomes 35. Bien avantageux pour leur ...

La chromatine est un complexe nucléoprotéine très dynamique qui est impliqué en tant que modèle primaire pour tous les processus médiés par ADN. Le nucléosome est l&#39;unité répétée de base de la chromatine et est constitué d&#39;un noyau protéique octamère contenant deux molécules de chaque histone H2A canonique, H2B, H3 et H4, autour de laquelle 147 pb d&#39;ADN sont enroulées 1,2. Tous les histones sont structurées comme un domaine globulaire et une &quot;queue&quot; N-terminal flexible qui fait saillie à l&#39;extérieur du nucléosome. L&#39;un des principaux mécanismes de régulation de la structure de la chromatine et la dynamique est basé sur covalentes modifications post-traductionnelles (PTM), qui se produisent principalement sur ​​l&#39;extrémité N-terminales des histones 3,4. modifications des histones peuvent fonctionner soit en modifiant la structure de la chromatine afin supérieur, en changeant les contacts entre les histones-ADN ou entre nucléosomes, et de contrôler ainsi l&#39;accessibilité des protéines de liaison à l&#39;ADN (mécanismes cis), ou en agissant comme DockInsites g de protéines de régulation, soit comme des unités simples ou intégrés dans des complexes multimériques. De telles protéines de régulation peuvent exercer leur fonction de différentes façons: en modulant directement l&#39;expression du gène (à savoir les protéines TAF), ou en modifiant le positionnement des nucléosomes (c&#39;est à dire le remodelage de la chromatine des complexes) ou en modifiant d&#39;autres résidus d&#39;histones (par exemple des protéines avec des méthyl-transférase ou l&#39;acétyl- transférase) (mécanismes trans) 5. L&#39;observation que distincte grappe des modèles PTM à la chromatine locus spécifique conduit à l&#39;élaboration de l&#39;hypothèse que les différentes modifications dans des sites distincts en synergie pour générer un code moléculaire médiation de l&#39;état fonctionnel de l&#39;ADN sous-jacente. Le &quot;code histone hypothèse&quot; a acquis un large consensus dans les années, mais sa vérification expérimentale a été freinée par des contraintes techniques 6,7. Protéomique à base de spectrométrie de masse (MS) a émergé comme unoutil puissant pour cartographier la distribution de modification des histones et de caractériser les protéines de la chromatine liaison 8. MS détecte une modification comme une Δmass spécifique entre la masse expérimentale et théorique d&#39;un peptide. Au niveau des histones individuelles, MS fournit une méthode objective et globale de la carte MEA, permettant la détection de nouvelles modifications s&#39;enchaînant révélateurs parmi eux 9-14. Au cours des dernières années, un certain nombre de stratégies ont été développées pour disséquer la composition de la chromatine protéomique, y compris la caractérisation de chromosomes intacts mitotiques, 15 l&#39;identification de protéines solubles de liaison à Hptm 16-18 et l&#39;isolement et l&#39;analyse des régions spécifiques de la chromatine (par exemple télomères) 19,20. Toutefois, l&#39;enquête des synergies spécifiques de locus entre MEA histones, les variants et les protéines de la chromatine associée est encore incomplète. Ici, nous décrivons une nouvelle approche, appelée ChroP (Chro roteomics matin P) 21, que nous avons développés pour caractériser efficacement les domaines de la chromatine fonctionnellement distinctes. Cette approche s&#39;adapte immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), un protocole bien établi, utilisé dans la recherche en épigénétique, pour l&#39;analyse protéomique MS efficace de l&#39;échantillon enrichi. Nous avons mis au point deux protocoles différents, en fonction du type de la chromatine utilisée comme entrée et l&#39;interrogation adressée par MS; en particulier: 1) morceau de la chromatine native non fixée digéré avec MNase est utilisé pour purifier mono-nucléosomes et à disséquer les hPTMs co-associant (N-ChroP); 2) à puce de la chromatine réticulée fragmenté par ultrasons est utilisé en combinaison avec un interactomique stratégie basée sur SILAC à caractériser toutes les protéines (X-ChroP) contraignant la chromatine co-enrichissement. Nous illustrons ici la combinaison de N-et X-ChroP pour enrichir et d&#39;étudier l&#39;hétérochromatine, en utilisant H3K9me3 comme appât pour les étapes d&#39;immunoprécipitation. L&#39;utilisation de ChroP peut être étendud&#39;étudier soit des régions distinctes sur la chromatine, ou des changements dans la composition de la chromatine dans la même région au cours de la transition à un état fonctionnel différent, ouvrant ainsi la voie à de nombreuses applications dans l&#39;épigénétique.

<table><tbody><tr><td>DMEM&nbsp ;</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>SILAC DMEM</td><td>M-Medical</td><td>FA30E15086</td><td></td></tr><tr><td>Dialysé FBS</td><td>Invitrogen</td><td>26400-044</td><td></td></tr><tr><td>Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8662</td><td></td></tr><tr><td>Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6969</td><td></td></tr><tr><td>Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68041</td><td></td></tr><tr><td>Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Nucléase micrococcique</td><td>Roche</td><td>10 107 921 001</td><td></td></tr><tr><td>Comprimés cocktail d’inhibiteur de protéase complets et sans EDTA</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de dialyse Spectra/Por 3, 3,5K MWCO, largeur plate de 18 mm, longueur</td> <td>de 50 piedsSpectrumlabs</td><td>132720</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR</td><td>kit de purification QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histone H3 tri-méthylé K9-ChIP grade</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>Histone H3 peptide tri-méthyl K9&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab1773</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protéine G</td><td>Invitrogen</td><td>100.04D</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12 %&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Bis-Tris Gel&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloration au bleu colloïdal</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>LDS Sample Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Formaldheyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Aceti anhydride-d6</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175641-1G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94318-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacétamide &ge ; 99 % (HPLC), cristallin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine modifiée de qualité séquençage, congelé 100 &mu ; g (5 &times ; 20 &mu ; g)</td> <td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>Nanospray OD 360&mu ; m x ID 75&mu ; m, pointes ID 8 &mu ; m non revêtu Pk 5</td><td>Microcolumn Srl</td><td>FS360-75-8-N-5-C15</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 &micro ; m&nbsp ; &nbsp ; 15 % C</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r13.aq.</td><td></td></tr><tr><td>Disque d’extraction de carbone, 47 mm</td><td>Agilent Technologies</td><td>12145040</td><td></td></tr><tr><td>Disque d’extraction de cations</td><td>Agilent Technologies</td><td>66889-U</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;approche chrop combine puce et la spectrométrie de masse à disséquer protéomiques paysages locus spécifiques de la chromatine

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

La chromatine est un complexe de nucléoprotéine hautement dynamique faite de l&#39;ADN et des protéines qui contrôle divers procédés d&#39;ADN-dépendante. la structure de la chromatine et de la fonction à des régions spécifiques est régie par l&#39;enrichissement local du histones modifications post-traductionnelles (hPTMs) et variantes, les protéines de la chromatine de liaison, y compris les facteurs de transcription, et méthylation de l&#39;ADN. La caractérisation protéomique de la composition de la chromatine au niveau des régions fonctionnelles distinctes a été jusqu&#39;ici entravé par le manque de protocoles efficaces pour enrichir ces domaines à la pureté et la quantité appropriée pour l&#39;analyse en profondeur ultérieure par spectrométrie de masse (MS). Nous décrivons ici une stratégie de protéomique de la chromatine nouvellement conçu, nommé ChroP (Chro matin P roteomics), dans lequel une immunoprécipitation de la chromatine préparative est utilisée pour isoler les régions de la chromatine distincts dont les caractéristiques, en termes de hPTMs, variantes et co-associés protéines non histoniques, sont analysés par MS. Nous illustrons ilre la mise en place de ChroP pour l&#39;enrichissement et l&#39;analyse des régions d&#39;hétérochromatine transcriptionnellement silencieux, marqué par la présence de tri-méthylation de la lysine 9 sur l&#39;histone H3. Les résultats obtenus démontrent le potentiel de ChroP pour caractériser complètement le protéome de l&#39;hétérochromatine et prouver comme une stratégie analytique puissant pour comprendre comment les déterminants de protéines distinctes de la chromatine et interagissent en synergie pour établir les configurations structurelles et fonctionnelles spécifiques de locus.

Immunoprécipitation de la chromatine est une technique puissante utilisée pour le profil de la localisation d&#39;une protéine ou d&#39;une modification d&#39;histone long du génome. Dans un protéomique équivalent, Chip est suivie par la protéomique MS pour identifier qualitativement et quantitativement les hPTMs, variants d&#39;histones et des protéines de la chromatine de liaison qui sont immunoprécipités avec la modification ou de la protéine d&#39;intérêt, utilisées comme «appât». Dans l&#39;approche N-ChroP, présen...

En combinant natif et réticulation immunoprécipitation de la chromatine à haute résolution de spectrométrie de masse, l&#39;approche ChroP permet de disséquer l&#39;architecture protéomique composite de modifications des histones, des variantes et des protéines non-histoniques synergie au domaines de la chromatine fonctionnellement distinctes.

L&#39;approche ChroP Combine puce et la spectrométrie de masse à Disséquer protéomiques paysages Locus spécifiques de la chromatine

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

L'objectif général de cette procédure est de caractériser la composition protéomique de domaines chromatiniens fonctionnellement distincts afin de comprendre comment les différents éléments agissent de manière synergique pour déterminer l'état transcriptionnel. Cela est réalisé en premier lieu en préparant des noyaux à partir de cellules en culture et en digérant la chromatine en fragments de longueur optimale par des moyens enzymatiques ou mécaniques. La deuxième étape consiste à purifier un domaine fonctionnel distinct à partir de la chromatine globale par immunoprécipitation en utilisant des anticorps cibles dirigés contre une modification post-traductionnelle d'histone ou contre une protéine connue pour marquer spécifiquement la région d'intérêt.Ensuite, les protéines de chromatine immunopurifiées sont séparées par électrophorèse SDS-PAGE et digérées in-gel avant la spectrométrie de masse. L'étape suivante consiste en une analyse par spectrométrie de masse en chromatographie liquide sur un instrument à haute résolution. Enfin, les données brutes de spectrométrie de masse sont analysées à l'aide d'un logiciel dédié, suivie d'un examen manuel des spectres afin d'identifier et de

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Analyse de l'interaction de la chromatine par Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) est une méthode...

Analyse de l&#39;interaction avec la chromatine Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) pour la cartographie des interactions Chromatine et transcription Comprendre le règlement

Les progrès de la spectrométrie de masse ont permis l'analyse à haut débit de l'expression protéique et la modification dans une multitude de tissus. Combiné avec fractionnement subcellulaire et modèles de maladies, spectrométrie de masse quantitative et de la bioinformatique peut révéler de nouvelles propriétés dans les systèmes biologiques. Le procédé décrit ici analyse des protéines associées à la chromatine dans le cadre d'une maladie cardiaque et est facilement applicable à...

Analyse quantitative des Protéomes chromatine dans la maladie

L’identification de molécules associées à des régions génomiques spécifiques d’intérêt est nécessaire pour comprendre les mécanismes de régulation des fonctions de ces régions. Ce protocole décrit les procédures d’imunopréciprécipitation de la chromatine médiée par des molécules de liaison à l’ADN (enChIP) pour l’identification de protéines et d’ARN associés à une région génomique spécifique.

Isolement des régions génomiques spécifiques et l&#39;identification des molécules associées par enChIP

Nous décrivons ici un protocole de puce-séquençage haut débit optimisé et pipeline analyses calcul pour la détermination de modèles État pangénomique chromatine de lignées de cellules et tissus tumoraux congelés.

Une plate-forme intégrée pour la cartographie de la Genome-wide, des États de la chromatine, à l’aide de la puce séquençage haut-débit dans les tissus de la tumeur

Il s’agit d’une méthode pour identifier de nouvelles protéines interagissant avec ADN loci cible spécifique, en s’appuyant sur la capture de séquences spécifiques de chromatine réticulée pour analyses protéomiques ultérieures. Aucune connaissance préalable de protéines de liaison potentielle, ni modifications cellulaires ne sont nécessaires. Initialement développé pour la levure, la technologie a été adaptée pour les cellules mammifères.

Adaptation de l’hybridation prise de protéines associées à la chromatine pour la protéomique pour les cellules de mammifères

Les auteurs décrivent un protocole étape par étape pour la chromatine tandem immunoprécipitation séquençage (tChIP-Seq) qui permet l’analyse de la modification d’histone génome cellule-spécifiques au type.

TChIP-Seq : Type-spécifiques des cellules épigénome profilage

CUT&amp;RUN et ses variantes peuvent être utilisés pour déterminer l’occupation des protéines sur la chromatine. Ce protocole décrit comment déterminer la localisation des protéines sur la chromatine à l’aide d’uliCUT&amp;RUN unicellulaire.

Localisation du facteur unicellulaire sur la chromatine à l’aide d’un clivage d’entrée ultra-faible sous les cibles et libération à l’aide de la nucléase

Ce protocole décrit la méthode Capture Hi-C utilisée pour caractériser l’organisation 3D de régions génomiques ciblées de taille mégamétrique à haute résolution, y compris les limites des domaines topologiquement associés (TAD) et les interactions chromatines à longue distance entre les éléments de séquence d’ADN régulateurs et autres.

Déchiffrer l’organisation de la chromatine 3D haute résolution via Capture Hi-C

L’expression des gènes est régulée par les interactions des promoteurs de gènes avec les éléments régulateurs distaux. Ici, nous décrivons comment la capture Hi-C à faible entrée (liCHi-C) permet l’identification de ces interactions dans des types de cellules rares, qui étaient auparavant non mesurables.

Un flux de travail intégré pour étudier l’architecture spatio-temporelle du génome centrée sur le promoteur dans des populations cellulaires rares

Nous présentons un protocole tricolore de microscopie de localisation de la chromatine à molécule unique (SMLM) qui permet une cartographie reproductible de l’euchromatine, de l’hétérochromatine et du RNAP II pour une analyse spatiale. Ce protocole permet un marquage multicolore efficace dans des environnements nucléaires denses, y compris des cibles associées à la chromatine, permettant une détection simultanée fiable.

Un protocole de microscopie de localisation multi-marquage à molécule unique pour l’étude de la chromatine dans un environnement nucléaire dense

Découvrez l'approche ChroP pour analyser la composition protéomique des domaines chromatiniens spécifiques. Cette méthode combine immunoprécipitation et spectrométrie de masse haute résolution.

L'approche ChroP Combine puce et la spectrométrie de masse à Disséquer protéomiques paysages Locus spécifiques de la chromatine

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