Name: Criblage à haut débit pour à large spectre inhibiteurs chimiques de lARN virus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-05T16:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Découvrez un criblage à haut débit pour isoler des antiviraux à large spectre à partir de bibliothèques chimiques. Cette méthode utilise des virus recombinants exprimant la luciférase pour mesurer la réplication virale et évaluer la toxicité cellulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions le Dr Yves L. Janin pour ses commentaires et suggestions fructueuses. Nous tenons à remercier HH Gad pour CHIK / Ren et C. Combredet pour son soutien technique. Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut Pasteur, le Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), l&#39;Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM), l&#39;Institut Carnot - Pasteur Maladies Infectieuses (Programme STING à POV et HM- L), l&#39;Agence Nationale pour la Recherche (ANR-DGITRN, Programme STING 2.0 pour POV), et le &quot;Conseil Régional d&#39;Ile-de-France&quot; (projet de bibliothèque chimique, les subventions n ° 06-222 je / R et I 09-1739 / R pour HM-L.). Le travail sur CHIKV / Ren a été soutenue par les ArbOAS de projets (ANR subvention 2010-INTB-1601-02).

1. Préparation de 96 puits fille plaques avec les composés <ol><li> Déplacer plaques mères à 96 puits contenant 10 mM de solutions de composés chimiques dans le DMSO à partir de -20 ° C à la température ambiante. Diluer composés 5x dans le DMSO pour obtenir des plaques de dilution 96 puits intermédiaires à 2 mM. La dilution est réalisée par pipetage de 5 ul dans 20 ul de DMSO et de mélange. </li><li> 1 ul de plaques de dilution dans les puits sec de blanc, de culture de tissu à code à barres des plaques 96 puits. Ce premier ensemble de plaques-filles (D1) seront utilisées pour évaluer la toxicité des composés à une concentration finale de 20 uM. Magasin fille plaques à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Diluer composés encore 1h10 par pipetage 4 pi à partir de plaques de dilution dans 36 ul de DMSO et le mixage. 1 ul dans les puits à sec de blanc, à fond plat, la culture de tissus code à barres 96 puits plaques. Ce second ensemble de plaques-filles (D2) sera utilisé pour évaluer l&#39;inhibition de la MV replication par les composés à une concentration finale de 2 pM. Magasin fille plaques à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 2. Préparation de cultures cellulaires pour déterminer la toxicité de composés <ol><li> Cultiver des cellules HEK-293T à 37 ° C et 5% de CO2 dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec stabilisation de L-glutamine et supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (FCS), de la streptomycine (100 ug / ml) et de la pénicilline (100 UI / ml). Les cellules sont repiquées par traitement à la trypsine tous les 4-5 jours, et dilués 01h10 dans un nouveau flacon. Les cellules doivent être en phase de journal pour des expériences. </li><li> Le jour de l&#39;expérience, de récupérer les cellules par traitement à la trypsine et d&#39;effectuer le comptage des cellules. Pellet cellules par centrifugation et les remettre en suspension à 3 x 10 5 cellules / ml dans du milieu de culture. Considèrent que 12,5 ml de suspension de cellules sont nécessaires pour chaque plaque de blindage. </li><li> cellules de transfert à un creux, et distribuer 100 pi de suspension cellulaire dans des plaques contenant D1 pointes compo chimiqueonds. Suspension cellulaire à l&#39;intérieur de l&#39;auge est régulièrement agité pour éviter la sédimentation. </li><li> De Spike contrôle puits A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 et G12 avec 1 ul de DMSO. Puits correspondants seront utilisés comme référence pour les cellules vivantes (pas de toxicité). Spike contrôle puits B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 et H12 avec 1 ul de DMSO et 2,5 ul d&#39;une solution d&#39;IGEPAL à 0,5% pour tuer les cellules. Puits correspondants seront utilisés comme référence pour les cellules mortes (forte toxicité). </li><li> Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> 3. Préparation de cultures de cellules infectées par rMV2/Luc <ol><li> Développer et récupérer les cellules comme décrit dans 2.1 et 2.2. Encore une fois, remettre les cellules à 3 x 10 5 cellules / ml dans du milieu de culture. Considèrent que 12,5 ml de suspension de cellules sont nécessaires pour chaque plaque de blindage. </li><li> En option: supplément de milieu de culture avec l&#39;uridine à 20 pg / ml. Remarque: Lors de criblage de banques chimiques pour replicatio viralen inhibiteurs, il semble que les composés ciblant les étapes précoces de la voie de biosynthèse de la pyrimidine sont fréquemment isolés 13,16,27,28. L&#39;ajout d&#39;uridine au milieu de culture est utilisé pour filtrer de telles molécules antivirales. En effet, cette restaure efficacement la réplication virale lors enzymes amont de voie de biosynthèse de la pyrimidine sont bloqués. </li><li> Enregistrer 1:10 de suspension de cellules dans les puits de contrôle avec des cellules non infectées, et procéder à l&#39;infection par le volume restant. </li><li> Décongeler le volume approprié de rMV2/Luc solution stock. Solutions mères MT sont généralement à 10 6 -10 8 particules infectieuses par ml. La culture doit être infectée par des particules infectieuses de 0,1 rMV2/Luc par des cellules cibles, ce qui correspond à 0,1 multiplicité d&#39;infection (MOI). Remarque: rMV2/Luc est dérivé du vaccin MV (souche Schwarz) et est manipulé dans un environnement de BSL2. </li><li> Ajouter le virus de la suspension cellulaire et mélanger doucement. Transférer les cellules infectées à un creux, et verser 100pl de suspension cellulaire infectée dans les colonnes 2 à 11 de D2 plaques contenant des composés chimiques dopés. La suspension cellulaire dans l&#39;auge est régulièrement mélangé doucement. </li><li> Dans les colonnes 1 et 12, passer de 100 pi de cellules non infectées et un sur deux. Les cellules infectées sont distribués dans les autres puits. </li><li> Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> 4. Mesures d&#39;activité de la luciférase et l&#39;analyse des données <ol><li> Retirer les plaques de l&#39;incubateur D1, et déterminer la viabilité cellulaire en ajoutant 50 ul de réactif à base de luciférase-viabilité directement à des puits de culture. Mélanger et incuber pendant 10 min à température ambiante. Lire les plaques d&#39;un luminomètre. Le temps d&#39;intégration est fixé à 100 ms par puits. </li><li> Retirer les plaques de l&#39;incubateur D2, et déterminer l&#39;activité de la luciférase en ajoutant 50 pl de substrat de la luciférase directement aux puits de culture. Incuber pendant 6 min à température ambiante, et lire les plaques avec un luminomètre que descriLit ci-dessus. </li><li> Calculer un facteur Z&#39;-D1 pour chaque plaque de l&#39;essai de toxicité pour justifier la qualité de l&#39;écran 29. Z &#39;= 1-3 * (σ + + σ-) / (μ + - μ-), où μ + et σ + correspondent à des moyens de luminescence et écarts-types pour les cellules HEK-293T avec DMSO seul (pas de toxicité), et μ et σ-sont des moyens de luminescence et écarts-types pour les puits de culture traités avec IGEPAL pour tuer les cellules. Z &#39;est prévu au-dessus de 0,5, ou la plaque correspondante est éliminée. </li><li> Régler le seuil de toxicité à μ + / 2. Jeter composés avec des valeurs de luminescence en dessous de ce seuil (figure 3A). </li><li> Calculer un facteur Z &#39;pour chaque plaque D2 de l&#39;analyse antivirale. Ici, μ + et σ + correspondent à des moyens de luminescence et écarts-types pour les cellules infectées en culture avec du DMSO seul, et μ et σ-sont des moyens de luminescence et écarts-types pour les cellules non infectées. Encore une fois, avec plaques Z &amp; #39; des valeurs inférieures à 0,5 sont éliminés. </li><li> Calcul de l&#39;inhibition de la réplication virale de la manière suivante: pourcentage d&#39;inhibition = (μ + - activité de la luciférase pour le composé X) / (μ + - μ-) * 100. Régler le seuil d&#39;inhibition à 75%, et sélectionner des composés qui à la fois réduisent les valeurs de luminescence en dessous de ce seuil (figure 3B) et ne sont pas toxiques, selon les critères décrits dans la section 4.4. </li></ol> 5. L&#39;écran secondaire de la toxicité et à large spectre d&#39;activité antivirale <ol><li> Assurez-01h02 dilutions en série pour chaque frappé composé dans le DMSO, à partir de 500 um à 4 um (8 dilutions). Remplir blancs, des plaques de culture tissulaire à code à barres avec 50 ul de milieu de culture. Ajouter 1 pi de chaque dilution de composé dans des puits de culture. Répéter deux fois pour avoir 3 plaques de culture avec des dilutions en série en double pour chaque composé de succès. </li><li> Préparer 37,5 ml d&#39;une suspension de cellules HEK-293T à 6 x 10 5 cellules / ml dans un milieu de culture tel que décrit ci-dessus (en 2.1 et 20,2). Distribuer 2x 12,5 ml dans des tubes Falcon et infecter les cellules avec soit rMV2/Luc à MOI = 0,1 ou CHIKV recombinant exprimant la luciférase de Renilla (CHIKV / s) à une MOI = 0,2. Mélanger par inversion. Remarque: CHIKV / Ren est dérivé d&#39;une souche sauvage de CHIKV et doit donc être manipulé dans un environnement BSL3. Les plaques peuvent être déplacés d&#39;BSL3 à BSL1 fois substrat Renilla a été ajouté au puits de culture (voir ci-dessous). </li><li> Distribuer 50 ul de cellules non infectées, rMV2/Luc-infected, ou CHIKV / Ren-infectés dans des plaques de culture contenant des dilutions en série de composés de vie. Incuber 24 heures à 37 ° C. </li><li> Ajouter 50 ul de substrat de la luciférase de luciole pour déterminer l&#39;activité luciférase de luciole dans des puits rMV2/Luc-infected. Ajouter 50 ul de substrat de la luciférase de Renilla pour déterminer l&#39;activité de la luciférase de Renilla dans CHIKV / puits Ren-infectées. Enfin, ajouter 50 ul de réactif de dosage de la viabilité en fonction de la luciférase de cellules non infectées, pour déterminer la viabilité cellulaire. </li><li> Tracer les données (Figure 4) et déterminer les concentrations de composés qui inhibent touchés MV et la réplication de CHIKV de 50%. Ne tenez pas compte composé présentant une certaine toxicité dans cet essai. </li></ol>

<ol><li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+drugs+in+current+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Antiviral drugs in current clinical use.</a> J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).</li>
<li>Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervention+strategies+for+emerging+viruses%3A+use+of+antivirals%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals.</a> Curr Opin Virol. , (2013).</li>
<li>Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+strategies+to+inhibit+the+replication+of+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses.</a> Antiviral Res. 78, 9-25 (2008).</li>
<li>Leyssen, P., Balzarini, J., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+predominant+mechanism+by+which+ribavirin+exerts+its+antiviral+activity+in+vitro+against+flaviviruses+and+paramyxoviruses+is+mediated+by+inhibition+of+IMP+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramyxoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase.</a> J Virol. 79, 1943-1947 (2005).</li>
<li>Wang, B. X., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin+and+yang+of+viruses+and+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The yin and yang of viruses and interferons.</a> Trends Immunol. 33, 190-197 (2012).</li>
<li>Empey, K. M., Peebles, R. S., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+advances+in+the+treatment+and+prevention+of+respiratory+syncytial+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus.</a> Clin Infect Dis. 50, 1258-1267 (2010).</li>
<li>Tan, S. L., Ganji, G., Paeper, B., Proll, S., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+and+the+host+response+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systems biology and the host response to viral infection.</a> Nat Biotechnol. 25, 1383-1389 (2007).</li>
<li>Prussia, A., Thepchatri, P., Snyder, J. P., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Approaches+towards+the+Development+of+Host-Directed+Antiviral+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Systematic Approaches towards the Development of Host-Directed Antiviral Therapeutics.</a> Int J Mol Sci. 12, 4027-4052 (2011).</li>
<li>Connolly, D. J., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+Toll-like+receptor+targeted+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">New developments in Toll-like receptor targeted therapeutics.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2012).</li>
<li>Thakur, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+activators+of+RNase+L+with+broad-spectrum+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Small-molecule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9585-9590 (2007).</li>
<li>Shoji-Kawata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+candidate+therapeutic+autophagy-inducing+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide.</a> Nature. 494, 201-206 (2013).</li>
<li>Hoffman, E. S., Smith, R. E., Renaud, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+analyst%27s+couch%3A+TLR-targeted+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 4, 879-880 (2005).</li>
<li>Bonavia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+broad-spectrum+antiviral+compounds+and+assessment+of+the+druggability+of+their+target+for+efficacy+against+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of broad-spectrum antiviral compounds and assessment of the druggability of their target for efficacy against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6739-6744 (2011).</li>
<li>Rider, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antiviral+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antiviral therapeutics.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Krumm, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+host-directed+small-molecule+inhibitors+of+myxovirus+RNA-dependent+RNA-polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Potent host-directed small-molecule inhibitors of myxovirus RNA-dependent RNA-polymerases.</a> PLoS One. , (2011).</li>
<li>Hoffmann, H. H., Kunz, A., Simon, V. A., Palese, P., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antiviral+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antiviral that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5777-5782 (2011).</li>
<li>Harvey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK983%3A+a+novel+compound+with+broad-spectrum+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">GSK983: a novel compound with broad-spectrum antiviral activity.</a> Antiviral Res. 82, 1-11 (2009).</li>
<li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+were+new+medicines+discovered%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">How were new medicines discovered.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 507-519 (2011).</li>
<li>Jochmans, D., Leyssen, P., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+high-throughput+screening+to+quantify+antiviral+activity+against+viruses+that+induce+limited+CPE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for high-throughput screening to quantify antiviral activity against viruses that induce limited CPE.</a> J Virol Methods. 183, 176-179 (2012).</li>
<li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon%2C+virus-like+particles%2C+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 4980-4988 (2005).</li>
<li>Panchal, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+high-content+imaging+assays+for+lethal+viral+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Development of high-content imaging assays for lethal viral pathogens.</a> J Biomol Screen. 15, 755-765 (2010).</li>
<li>Pohjala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+alphavirus+entry+and+replication+identified+with+a+stable+Chikungunya+replicon+cell+line+and+virus-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of alphavirus entry and replication identified with a stable Chikungunya replicon cell line and virus-based assays.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+stable+luciferase+dengue+virus+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening.</a> Antiviral Res. 91, 11-19 (2011).</li>
<li>Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+insights+into+firefly+luciferase+and+other+bioluminescent+reporters+used+in+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology.</a> Chem Biol. 17, 646-657 (2010).</li>
<li>Komarova, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+virus-host+interactions+in+an+infectious+context+using+recombinant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of virus-host interactions in an infectious context using recombinant viruses.</a> Mol Cell Proteomics. , (2011).</li>
<li>Henrik Gad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E2-E166K+substitution+restores+Chikungunya+virus+growth+in+OAS3+expressing+cells+by+acting+on+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The E2-E166K substitution restores Chikungunya virus growth in OAS3 expressing cells by acting on viral entry.</a> Virology. 434, 27-37 (2012).</li>
<li>Wang, Q. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+dengue+virus+through+suppression+of+host+pyrimidine+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of dengue virus through suppression of host pyrimidine biosynthesis.</a> J Virol. 85, 6548-6556 (2011).</li>
<li>Smee, D. F., Hurst, B. L., Day, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D282%2C+a+non-nucleoside+inhibitor+of+influenza+virus+infection+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir+Chem+Chemother%22%5BJournal%5D)">D282, a non-nucleoside inhibitor of influenza virus infection that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Antivir Chem Chemother. 22, 263-272 (2012).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Qing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+dengue+virus+resistance+to+brequinar+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Characterization of dengue virus resistance to brequinar in cell culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 3686-3695 (2010).</li>
<li>Munier-Lehmann, H., Vidalain, P. O., Tangy, F., Janin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+dihydroorotate+dehydrogenases+and+their+inhibitors+and+uses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">On dihydroorotate dehydrogenases and their inhibitors and uses.</a> J Med Chem. 56, 3148-3167 (2013).</li>
<li>Yoon, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening-based+identification+of+paramyxovirus+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening-based identification of paramyxovirus inhibitors.</a> J Biomol Screen. 13, 591-608 (2008).</li>
<li>Maréchal, E., Roy, S., Lafanechère, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMar%C3%A9chal%2C+E+%22Chemogenomics+and+Chemical+Genetics%3A+A+User%27s+Introduction+for+Biologists%2C+Chemists+and+Informaticians%22">Chemogenomics and Chemical Genetics: A User's Introduction for Biologists, Chemists and Informaticians</a>. , Springer. (2011).</li>
<li>Gentzsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+complete+life+cycle+screen+for+identification+of+small+molecules+with+pro-+or+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus complete life cycle screen for identification of small molecules with pro- or antiviral activity.</a> Antiviral Res. 89, 136-148 (2011).</li>
<li>Caignard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V+protein+of+Tioman+virus+is+incapable+of+blocking+type+I+interferon+signaling+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The V protein of Tioman virus is incapable of blocking type I interferon signaling in human cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Le pipeline de criblage décrit ici vise à sélectionner des composés avec un profil adapté comme inhibiteurs à large spectre de virus à ARN. Quand une bibliothèque de 10 000 composés a été criblée avec ce protocole et les critères de filtrage ci-dessus ont été appliquées, à savoir l&#39;inhibition de la réplication MV supérieur à 75%, 40 composés (0,4%) a reçu positif. En outre, environ la moitié d&#39;entre eux ont montré une toxicité sur dans le test de la viabilité en fonction de la luciférase, et ont été pri...

virus à ARN sont responsables d&#39;une grande variété d&#39;infections humaines, et avoir un impact énorme sur les populations à travers le monde à la fois en termes de santé publique et de coût économique. Vaccins efficaces ont été mis au point contre plusieurs virus à ARN humain, et sont largement utilisés comme traitements prophylactiques. Cependant, il ya encore un manque crucial de médicaments thérapeutiques contre les infections de virus à ARN. En effet, les vaccins efficaces ne sont pas disponibles par rapport aux principales agents pathogènes humains tels que le virus de la dengue, virus de l&#39;hépatite C ou le virus respiratoire syncytial humain (hRSV). En outre, des virus à ARN sont responsables de la majorité des maladies émergentes, qui ont augmenté en fréquence en raison des échanges mondiaux et l&#39;impact humain sur les systèmes écologiques. Contre cette menace que représentent les virus à ARN, notre arsenal thérapeutique est très limitée et relativement inefficace 1-3. Les traitements actuels sont essentiellement basés sur le type recombinant des interférons (IFN-α / β) pour stimuler l&#39;immunité innée,ou l&#39;administration de la ribavirine. Bien que le mode d&#39;action de cette ribonucléoside analogique est controversée et s&#39;appuie sur divers mécanismes probablement, l&#39;inhibition de l&#39;IMPDH cellulaire (inosine monophosphate déshydrogénase), qui épuise les pools intracellulaires de GTP, 4 est évidemment essentiel. La ribavirine, en combinaison avec PEG-IFN-α, est le principal traitement contre le virus de l&#39;hépatite C. Cependant, les traitements IFN-α / β et ribavirine sont relativement pauvres efficacité in vivo contre la plupart des virus à ARN comme ils efficacement émoussé IFN-α / β de signalisation à travers l&#39;expression de facteurs de virulence 5 et échappent souvent à la ribavirine 3. Ceci ajouté au fait que le traitement de la ribavirine soulève des questions de toxicité importants, mais il a récemment été approuvé contre la maladie de hRSV sévère avec avantages controversés 6. Plus récemment, certains traitements spécifiques du virus ont été commercialisés, en particulier contre le virus de la grippe avec le développement odes inhibiteurs de la neuraminidase f 3. Cependant, la grande diversité et l&#39;émergence permanente de virus à ARN empêche le développement de traitements spécifiques contre chacun d&#39;eux dans un avenir relativement proche. Au total, ce insiste sur la nécessité de stratégies efficaces pour identifier et développer des molécules antivirales puissantes dans un proche avenir. Il est trivial de dire que un inhibiteur à large spectre actif contre un large panel de virus à ARN permettrait de résoudre ce problème. Même si une telle molécule est toujours le rêve d&#39;un virologue, notre meilleure compréhension des mécanismes de défense cellulaire et le système immunitaire inné suggèrent que des possibilités existent 7,8. Plusieurs laboratoires académiques et industriels cherchent maintenant des molécules qui stimulent des aspects spécifiques des mécanismes de défense cellulaire ou des voies métaboliques à émousser la réplication virale. Bien que ces composés seront probablement montrer des effets secondaires importants, les traitements contre les infections virales aiguës seront administrered pour un temps relativement court, ce qui les rend acceptable malgré une certaine toxicité potentielle sur le long terme. Diverses stratégies ont été développées pour identifier ces large spectre des molécules antivirales. Certains programmes de recherche visent à trouver des molécules qui ciblent les voies spécifiques de la défense ou métaboliques. Cela comprend, par exemple, récepteurs de reconnaissance de l&#39;agent pathogène à susciter l&#39;expression des gènes antiviraux 9 et activer des facteurs antiviraux tels que RNaseL 10, les machines de autophagy pour promouvoir la dégradation des virus 11, à la synthèse de nucléoside parcours d&#39;accompagnement 12,13, ou cascades apoptotiques pour précipiter la mort de cellules infectées par des virus 14. D&#39;autres groupes ont développé des écrans phénotypiques qui ne sont pas fondées, cibler 13,15-17. Dans ce cas, des molécules antivirales sont simplement identifiés par leur capacité à bloquer la replication virale dans un système cellulaire donné. L&#39;hypothèse générale est que un composé inhibant 2-3 virus à ARN indépendants aurait un profil adapté pour un large spectrum molécule antivirale. Le mode d&#39;action des composés de vie choisis avec une telle approche empirique n&#39;est déterminé dans un second temps et finalement, peut conduire à l&#39;identification de cibles cellulaires nouvelles d&#39;antiviraux. Fait intéressant, une analyse rétrospective des nouveaux médicaments approuvés par la US Food and Drug Administration entre 1999 et 2008 a montré que, en général, ces projections phénotypiques ont tendance à mieux performer que les approches fondées sur des objectifs à découvrir des médicaments à petites molécules de première en classe 18 . La réplication virale dans les tests cellulaires à haut débit est généralement déterminée à partir de virus effets cytopathiques. Les cellules sont infectées et cultivées dans des 96 - ou des plaques à 384 puits en présence des composés testés. Après quelques jours, les couches cellulaires sont fixées et colorées avec des colorants tels que le violet de cristal. Enfin, l&#39;absorbance est mesurée avec un lecteur de plaques et de composés inhibiteurs de la replication virale sont identifiés par leur capacité à conserver des couches cellulaires from induite par le virus effet cytopathique. Alternativement, un effet cytopathogène viral-médiation sont évalués en utilisant des analyses de viabilité standard telles que la réduction MTS. De tels dosages sont très maniable et rentable, mais souffrent de trois limites majeures. D&#39;abord, ils exigent une combinaison virus-cellule, la réplication virale est cytopathique en seulement quelques jours, mais ce n&#39;est pas toujours possible, appelant ainsi à 19 autres approches. Deuxièmement, ils sont mal quantitative car elles sont fondées sur une mesure indirecte de la réplication virale. Enfin, les composés toxiques peuvent être marqués comme résultats positifs, et doivent donc être éliminées avec un écran de mesure contre la viabilité cellulaire. Pour surmonter certains de ces obstacles, des virus ou des réplicons recombinants ont été conçus par génétique inverse pour exprimer des protéines rapporteurs, tels que la EGFP ou la luciférase, à partir d&#39;une unité de transcription supplémentaire ou dans le cadre avec des gènes de protéines virales (quelques exemples 20-23). Lorsque ces virus se répliquent, journaliste proteins sont produites conjointement avec des protéines virales eux-mêmes. Ceci permet d&#39;obtenir un dosage très quantitative pour mesurer la replication virale et à évaluer l&#39;activité inhibitrice des molécules candidates. Cela est particulièrement vrai pour les virus recombinants exprimant la luciférase (ou d&#39;autres enzymes capables de bioluminescence) puisque ce système rapporteur présente une large gamme dynamique avec une haute sensibilité et pratiquement pas de fond. En outre, il n&#39;y a pas de source de lumière d&#39;excitation, empêchant ainsi l&#39;interférence avec le composé 24 fluorescence. Ici, nous détaillons un protocole haut débit pour cribler des bibliothèques chimiques pour les inhibiteurs à large spectre de virus à ARN. Les composés sont testés en premier sur les cellules humaines infectées par un virus recombinant de la rougeole (MV) exprimant la luciférase de luciole 25 (rMV2/Luc, figure 1, l&#39;écran primaire). MV appartient à Mononegavirales ordre, et est souvent considéré comme un membre prototypique de virus à ARN négatifes. En tant que tel, génome MV est utilisée comme matrice par la polymerase virale de synthétiser des molécules d&#39;ARNm codant pour les protéines virales. Dans la souche MV recombinant appelé rMV2/Luc, expression de la luciférase est exprimée à partir d&#39;une unité de transcription additionnelle insérée entre les gènes P et M (figure 2A). En parallèle, les composés sont testés pour leur toxicité sur des cellules humaines en utilisant un réactif à base de luciférase-commercial qui évalue, par quantification de l&#39;ATP, le nombre de cellules métaboliquement actives en culture (figure 1, l&#39;écran primaire). Bibliothèques chimiques entiers peuvent être facilement sélectionnés avec ces deux tests afin de sélectionner des composés qui ne sont pas toxiques et qui bloquent efficacement la réplication MV. Ensuite, les coups sont à nouveau testés pour l&#39;inhibition dose-réponse de la réplication MV, l&#39;absence de toxicité ainsi que pour leur capacité à nuire à virus chikungunya (CHIKV) réplication (figure 1, l&#39;écran secondaire). CHIKV est un membre de la famille des Togaviridae, et son génome est apositive molécule d&#39;ARN simple brin. En tant que tel, il est complètement étranger à la rougeole et des composés inhibant la fois MV et CHIKV une grande chance pour inhiber un large panel de virus à ARN. Les protéines non structurales CHIKV sont directement traduits à partir du génome viral, alors que les protéines structurales sont codées par transcription et traduction d&#39;une molécule d&#39;ARNm sub-génomique. Notre test in vitro de la réplication de CHIKV est basé sur une souche recombinante appelée CHIKV / Ren, qui exprime la luciférase de Renilla enzyme comme une partie séparée par clivage de la polyprotéine non structurale par le biais d&#39;une insertion du gène rapporteur entre nsP3 et séquences nsP4 26 (figure 2B). La mesure de l&#39;activité de la luciférase de Renilla permet le contrôle de la réplication virale, au stade précoce du cycle de vie CHIKV. Ce protocole à haut débit a été utilisé pour identifier rapidement des composés avec un profil adapté pour antiviraux à large spectre dans une bibliothèque commerciale de 10 000 molecdules enrichie de la diversité chimique. Les composés ont été essentiellement suivent la règle de Lipinski de cinq ans, avec des poids moléculaires allant de 250 à 600 daltons, et valeurs du log D en dessous de 5. Plupart de ces molécules sont de nouvelles entités chimiques ne sont pas disponibles dans d&#39;autres bibliothèques commerciales.

<table><tbody><tr><td>Plateforme EVO Freedom</td><td>Plateforme robotique</td><td>Polycarbonate</td><td></td></tr><tr><td>96 puits de culture cellulaire en polystyrène, blanc</td><td>Greiner Bio One</td><td>655083</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Essai de viabilité cellulaire luminescente</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td>Essai de viabilité basé sur la luciférase</td></tr><tr><td>Système d’essai de luciférase Bright-Glo Promega</td><td></td><td>E2610</td><td>Réactif contenant de la luciférase de luciférase substrat</td></tr><tr><td>Système d’essai de luciférase Renilla-Glo</td><td>Promega</td><td>E2710</td><td>Réactif contenant un substrat de Renilla luciférase</td></tr><tr><td>Britelite plus Gene Reporter Système d’essai</td><td>Perkin-Elmer</td><td>6016761</td><td>Réactif contenant un substrat de luciférase de luciole. Peut être utilisé comme alternative au réactif Brigh-Glo pour déterminer l’activité de la luciférase.</td></tr></tbody></table>

criblage à haut débit pour à large spectre inhibiteurs chimiques de l&#39;arn virus

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

virus à ARN sont responsables de maladies humaines majeures telles que la grippe, la bronchite, la dengue, l&#39;hépatite C ou la rougeole. Ils représentent aussi une menace émergente en raison de l&#39;augmentation des échanges à travers le monde et les populations humaines pénétrant écosystèmes de plus en plus naturelles. Un bon exemple d&#39;une telle situation émergente est épidémies de virus du chikungunya de 2005-2006 dans l&#39;océan Indien. Les progrès récents dans notre compréhension des voies cellulaires contrôlant la réplication virale suggèrent que des composés ciblant les fonctions de la cellule hôte, plutôt que le virus lui-même, pourraient inhiber un large panel de virus à ARN. Certains composés antiviraux à large spectre ont été identifiés avec accueil tests et ciblées. Toutefois, la mesure de l&#39;inhibition de la réplication virale dans des cultures de cellules en utilisant la réduction de l&#39;effet cytopathogène comme une visualisation représente encore une stratégie de dépistage primordiale. Ces écrans fonctionnels ont été grandement améliorées par le développement des virus recombinants exprimant journaliste enzymes capable de bioluminescence tel que la luciférase. Dans le présent rapport, nous détaillons un pipeline de criblage à haut débit, qui combine recombinant de la rougeole et les virus de chikungunya avec des tests de viabilité cellulaire, pour identifier des composés avec un profil antivirale à large spectre.

Ce pipeline de dépistage repose d&#39;abord sur la sélection de composés qui inhibent la réplication MV et ne présentent pas de toxicité cellulaire significative (figure 1, l&#39;écran principal). Il tire parti des dosages à base de luciférase pour déterminer la toxicité cellulaire et l&#39;inhibition de la réplication virale. Toutes les étapes de pipetage et d&#39;acquisition des données peut être effectué dans un cadre de haut-débit avec une plate-forme robotique. La toxic...

Les essais in vitro pour mesurer la réplication du virus a été grandement améliorée par la mise au point de virus à ARN recombinants exprimant la luciférase ou d&#39;autres enzymes capables de bioluminescence. Ici, nous détaillons un pipeline de criblage à haut débit qui combine ces souches recombinantes de la rougeole et les virus de chikungunya à isoler antiviraux à large spectre de bibliothèques chimiques.

Criblage à haut débit pour à large spectre inhibiteurs chimiques de l&#39;ARN virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des antiviraux à large spectre à partir de bibliothèques chimiques en utilisant une combinaison de tests cellulaires in vitro. Cela est réalisé en sélectionnant d'abord des composés capables d'inhiber la réplication in vitro d'une souche recombinante du virus de la rougeole exprimant la luciférase comme marqueur rapporteur. Parallèlement, la toxicité du composé est évaluée à l'aide d'un test de viabilité fondé sur la luciférase.Les données phénotypiques combinées provenant des deux tests sont utilisées pour isoler les molécules actives (HIT). Les étapes finales consistent à tester à nouveau les composés actifs afin de reproduire la réponse dose-dépendante d'inhibition du virus de la rougeole et du virus chikungunya, et à mesurer plus précisément la toxicité in vitro. En définitive, des composés antiviraux à large spectre sont identifiés et validés par le criblage.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les dosages standards de réplication virale basés sur les effets cytopathogènes, est qu'elle utilise la luminescence comme signal de détection et combine deux virus très divergents exprimant la luciférase comme rapporteur. La procédure sera démontrée par Olivier Helynck, technicien de l'équipe d'Helene Munier-Lehmann, et Marianne Lucas-Hourani, ingénieure travaillant avec moi au sein de l'unité de recherche de Frédéric Tangy.Commencez par porter à température ambiante les plaques mères de 96 puits contenant des solutions mères de composés chimiques à 10 millimolaire dans du DMSO. Transférez 5 µL de chaque composé vers de nouvelles plaques de 96 puits préalablement contenant 20 µL de DMSO dans chaque puits, afin de créer des plaques de dilution intermédiaire. Prélèvez ensuite à la pipette 1 µL de ces plaques de dilution et déposez-le dans des puits secs de plaques de culture tissulaire blanches de 96 puits munies de codes-barres.Il s'agit des plaques D une et elles sont utilisées pour évaluer la toxicité de composés à 20 micromolaire. Conservez-les à moins 20 degrés Celsius. Préparez maintenant de nouvelles plaques à partir des plaques de dilution intermédiaire qui sont diluées davantage 10 fois.Prélevez quatre microlitres de chaque composé dilué et mélangez-les dans des puits contenant 36 microlitres de DMSO. À partir de ces plaques, transférez un microlitre par échantillon dans des puits secs de plaques de culture tissulaire 96 puits, blanches, à fond plat et codées à barres.Voici les deux plaques D, utilisées pour évaluer l'inhibition de la réplication du MV. Conservez-les également à moins 20 degrés Celsius.Faites croître les cellules HEK-293-T dans du DMEM supplémenté contenant de la L-glutamine stabilisée. Tous les quatre à cinq jours, passez les cellules par trypsine et effectuez une dilution au dixième dans des flacons frais.Pendant leur phase de croissance logarithmique, récoltez et comptez les cellules pour l'expérience. Resuspendez les cellules à raison de 300 000 cellules par millilitre. Une quantité de 12,5 millilitres de cellules à cette dilution est nécessaire pour chaque plaque devant être analysée.Préparez maintenant les plaques. Ajoutez une microlitre de DMSO dans un premier jeu de puits témoins, puis ajoutez une microlitre de DMSO et 2,5 microlitres d'une solution à 0,5 % d'IGEPAL dans un second jeu de puits témoins afin de tuer les cellules. Transférez la suspension cellulaire dans un réservoir et distribuez 100 microlitres dans chaque puit des plaques D-one.Agiter régulièrement la suspension pour éviter la sédimentation. Incuber ensuite les plaques préparées pendant 24 heures.Préparez les cellules pour les plaques comme indiqué dans la section précédente. Le milieu de culture peut être supplémenté en uridine afin d'éliminer les molécules antivirales ciblant les premières étapes de la biosynthèse des pyrimidines, car celles-ci sont assez fréquentes. Conservez un dixième de la suspension cellulaire pour les puits témoins contenant des cellules non infectées, et infectez le volume restant. Décongelez une quantité suffisante de solution stock de rMV2-luc pour infecter la culture avec 0,1 particule infectieuse par cellule cible, correspondant à une multiplicité d'infection de 0,1. Ajoutez le volume calculé de virus à la suspension cellulaire et mélangez délicatement. Transférez les cellules infectées dans un réservoir et distribuez 100 microlitres de cellules infectées dans les plaques D-two. Ciblez les colonnes deux à onze, qui contiennent les composés chimiques ajoutés, ainsi que les puits de contrôle positif situés dans les colonnes un et douze. Mélangez régulièrement et délicatement les cellules dans le réservoir. Dans les rangées alternées des colonnes un et douze, distribuez 100 microlitres de cellules non infectées. Incubez ensuite les plaques pendant 24 heures.Après le temps d'incubation, déterminez la viabilité des cellules de la plaque D-one. Mélangez 50 microlitres de réactif de viabilité à base de luciférase dans chaque puits et attendez 10 minutes. Ensuite, lisez les plaques à l'aide d'un luminomètre. Réglez le temps d'intégration à 100 millisecondes par puits.Ensuite, déterminez la réplication du MV dans les plaques D-deux en mélangeant 50 microlitres de substrat de luciférase de luciole dans chaque puits et en attendant six minutes à température ambiante. Puis, consultez un facteur Z pour chaque plaque D-un et D-deux du test de toxicité.Continuez en calculant l'inhibition de la réplication virale. Les composés HIT sont ceux qui réduisent la réplication virale en dessous de la valeur seuil appliquée et qui ne sont pas toxiques.Pour chaque composé HIT, préparez des dilutions sériées dans le DMSO en partant de 500 micromolaires et en divisant par deux jusqu'à atteindre quatre micromolaires, le long d'une colonne d'une plaque 96 puits. Ajoutez un microlitre de la plaque de dilution du composé dans la plaque de culture tissulaire blanche dotée de codes-barres. Répétez ce processus deux fois afin de créer un jeu triplicat de plaques d'essai. Ensuite, complétez les plaques de culture tissulaire avec 50 microlitres de milieu de culture. Préparez maintenant 37,5 millilitres de cellules HEK-293T, en suspension dans du DMEM supplémenté à raison de 600 000 cellules par millilitre.Chargez deux tubes de 15 millilitres avec 12,5 millilitres de la suspension cellulaire chacun. Infectez un tube de cellules avec le rMV2/luc à une multiplicité d'infection de 0,1. Infectez le second tube de cellules avec un chikV recombinant exprimant la luciférase renilla. Utilisez une multiplicité d'infection de 0,2. Mélangez les deux tubes de cellules infectées par inversion. Cette manipulation doit être effectuée dans un laboratoire de niveau de biosécurité 3 en raison de la pathogénicité du chikV. Chargez maintenant les cellules non infectées et les séries de cellules infectées dans leurs propres plaques composés HIT.Distribuez 50 microlitres de cellules par puits et incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le jour suivant, ajoutez 50 microlitres de luciférase de luciole dans chaque puits de cellules infectées par rMV2/luc. De même, ajoutez 50 microlitres de substrat de Lucifer de renille dans les cellules infectées par ChikV-Ren. Aux cellules témoins non infectées, ajoutez 50 microlitres de réactif de viabilité à base de luciférase. Procédez ensuite à la détermination des concentrations du composé HIT qui inhibent la réplication du MV et du ChikV de 50 %. En outre, écartez les composés présentant une toxicité cellulaire. Ce protocole de criblage repose sur la sélection de composés qui ne présentent aucune toxicité cellulaire significative et qui inhibent la réplication du MV et du ChikV, comme déterminé respectivement lors des criblages primaire et secondaire. Il tire parti de virus recombinants exprimant la luciférase de luciole ou de *Renilla* comme marqueur rapporteur.La toxicité des composés est évaluée à l'aide d'un test commercial basé sur la luciférase, dans lequel la luminescence est corrélée au nombre de cellules vivantes. Sur cette plaque, 21 composés ont été classés comme toxiques selon un seuil défini par les puits témoins positifs.L'activité antivirale a d'abord été mesurée à l'aide de rMV2/luc. La luminescence a été comparée à la limite fixée par les puits témoins. Ici, quatre composés se sont révélés capables d'inhiber la réplication virale de plus de 75 %. Dans un autre test, deux de ces composés se sont avérés toxiques. Pour tous les composés actifs, la concentration inhibitrice maximale demi-maximale a été déterminée sur les deux virus à ARN MV et ChikV exprimant la luciférase. Ces deux virus sont non apparentés et rendent ainsi le criblage plus robuste. Parallèlement, l'absence de toxicité cellulaire de certains composés sélectionnés a été confirmée lors d'une expérience de réponse dose-dépendante.Dans l'ensemble, 13 composés non toxiques ont été identifiés à partir d'une bibliothèque chimique de 10 000 molécules. Ces composés étaient nouveaux en ce qui concerne à la fois la structure chimique et l'activité biologique. Sur la base de similitudes structurales, les composés se répartissaient en trois familles chimiques. À titre de référence, les valeurs de concentration inhibitrice maximale à 50 % ont été obtenues avec la Brequinar, une substance possédant une activité antivirale puissante. En examinant ces valeurs, moins d'un ordre de grandeur séparait la molécule de référence des composés actifs les plus efficaces (HITs) identifiés lors du criblage. Cela démontre l'activité antivirale relativement forte des composés sélectionnés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour cribler de grandes bibliothèques chimiques dans un contexte à haut débit et sélectionner des ensembles de petites molécules enrichies en antiviraux à large spectre.

high-throughput-screening-for-broad-spectrum-chemical-inhibitors-rna

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Facteurs de l'hôte roman impliqués dans l'infection virale peuvent être identifiés par la cellule basée échelle du génome perte de fonction ARNi dépistage.

Dépistage ARNi pour les facteurs de l&#39;hôte impliqués dans Vaccine</emVirus Infection> aide Drosophile Cellules

Trois essais, y compris l'effet cytopathique (CPE) à base de test, essai dose-réponse et (TOA) test à temps de Addition ont été développés, optimisés, validés et utilisés pour identifier de nouveaux antiviraux contre le virus de la fièvre catarrhale (BTV), ainsi à déterminer le Mécanisme d'action-de-possible (MOA) pour antiviraux nouvellement identifiés.

Les tests pour l&#39;identification de nouveaux antiviraux contre la fièvre catarrhale Virus

Nous décrivons ici la cytotoxicité cellulaire et simples essais d'infectivité rondes qui permettent la sélection rapide et précise des composés de déterminer leur cytotoxicité cellulaire (CC 50) et les valeurs IC50 contre WT et VIH-1 résistant médicament.

Dépistage rapide du VIH de la transcriptase inverse et inhibiteurs de l&#39;intégrase

Ici, nous présentons un protocole qui examine des étapes spécifiques de l’entrée virale afin d’identifier et d’évaluer de nouveaux agents antiviraux.

Early Viral entrée dosages pour l&#39;identification et l&#39;évaluation des composés antiviraux

Des méthodes d’évaluation de l’efficacité et de la toxicité des molécules d’ARN ciblant les étapes post-intégration du cycle de réplication du VIH-1 sont décrites. Ces méthodes sont utiles pour cribler de nouvelles molécules et optimiser le format des molécules existantes.

Évaluation de l&#39;efficacité et la toxicité des ARNs Ciblage VIH-1 Production pour utilisation en thérapie génique ou des médicaments

Nous décrivons ici un protocole pour l’emploi des Arni criblage à haut débit pour découvrir des cibles de l’hôte qui peuvent être manipulés pour améliorer virales oncolytiques, traitement de virus rhabodvirus et Vaccine spécifiquement, mais il peut être facilement adaptée aux autres oncolytiques plates-formes de virus ou pour découvrir les gènes hôtes qui modulent la réplication du virus en général.

Genome-wide Arni dépistage pour identifier les facteurs de l’hôte qui modulent les Virus ONCOLYTIQUE thérapie

Nous décrivons un essai pour signaler sur la fusion VIH-1 par l’expression de la protéine fluorescente verte détectable par microscopie à écoulement cytometry ou fluorescence cellulaire. Il peut être utilisé pour tester les inhibiteurs d’entrée virale (plus précisément à l’étape de fusion) dans les systèmes de l’infection sans cellule et cellule-cellule.

Un haut débit Cre-Lox activé Membrane virale Fusion test afin d’identifier les inhibiteurs de la Fusion membranaire virale du VIH-1

Nous présentons ici les protocoles afin d’identifier les immunomodulateurs 1) virus codé qui favorisent la réplication arbovirus et facteurs de l’hôte 2) eucaryotes que restreignent la réplication des arbovirus. Ces méthodes à base de fluorescence et de luminescence aux chercheurs d’obtenir rapidement des afficheurs quantitatives de réplication arbovirus dans les essais simplistes avec des rapports signal sur bruit faibles.

Arbovirus Infections comme outils de dépistage pour l’Identification des virales facteurs antiviraux immunomodulateurs et hôte

Dans ce travail, nous décrivons les protocoles utilisés dans les tests à base de réplicon et à base d’enzymes virales pour dépister les inhibiteurs de la réplication du virus Zika dans un format de dépistage à haut débit.

Tests antiviraux à haut débit pour dépister les inhibiteurs de la réplication du virus Zika

Nous décrivons une cellule unique à haut débit essai pour mesurer la cytotoxicité des lymphocytes T lorsqu'ils sont incubés avec les cellules cibles tumorales. Ce procédé utilise une matrice élastomère dense, de puits sous-nanolitres (~ 100.000 puits / matrice) à l'espace confiner les cellules T et les cellules cibles à des rapports définis et est couplée à la microscopie par fluorescence pour surveiller effecteur-cible conjugaison et l'apoptose subséquente.

Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

Découvrez un criblage à haut débit pour isoler des antiviraux à large spectre à partir de bibliothèques chimiques. Cette méthode utilise des virus recombinants exprimant la luciférase pour mesurer la réplication virale et évaluer la toxicité cellulaire.

Criblage à haut débit pour à large spectre inhibiteurs chimiques de l'ARN virus

Explorer plus de vidéos