Criblage à haut débit pour à large spectre inhibiteurs chimiques de l'ARN virus

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des antiviraux à large spectre à partir de bibliothèques chimiques à l’aide d’une combinaison d’essais cellulaires in vitro. Pour ce faire, il faut d’abord sélectionner des composés qui inhibent la réplication in vitro d’une souche recombinante du virus de la rougeole qui code pour les lucifers en tant que rapporteur. En parallèle, la toxicité du composé est estimée à l’aide d’un test de viabilité basé sur la luciférase.

Les données phénotypiques combinées des deux tests sont utilisées pour isoler les molécules HIIT. Les dernières étapes consistent à tester à nouveau les composés HIIT pour la réplication dose-réponse, l’inhibition de la rougeole et du virus guna du poulet, et à mesurer la toxicité in vitro avec plus de précision. En fin de compte, les composés antiviraux à large spectre sont identifiés et validés par le criblage.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les tests de réplication virale standard basés sur les effets cytopathiques, est qu’elle utilise la luminescence comme lecture et se combine avec des virus très divergents exprimant la luciférase comme rapporteur. Olivier Ellan, un technicien de l’équipe El Niemans, et Marianne Luca Ori, une ingénieure travaillant avec moi dans l’unité de recherche de Fredrik JI Begin par réchauffement à température ambiante, feront la démonstration de la procédure. Les plaques mères de 96 puits contenant 10 solutions mères millimolaires de composés chimiques dans le DMSO.

Transférez cinq microlitres de chaque composé sur de nouvelles plaques de 96 puits contenant déjà 20 microlitres de DMSO dans chaque puits, créant ainsi des plaques de dilution intermédiaires. Maintenant, injectez un microlitre de ces plaques de dilution dans des puits secs de culture de tissus à code-barres blancs. Plaques à 96 puits.

Il s’agit des plaques D one et sont utilisées pour évaluer la toxicité des composés à 20 micromolaires. Conservez-les à moins 20 degrés Celsius. Fabriquez maintenant de nouvelles plaques à partir des plaques de dilution intermédiaire qui sont encore diluées 10 fois.

Prenez quatre microlitres de chaque composé dilué et mélangez-les dans des puits avec 36 microlitres de DMSO. À partir de ces plaques, transférez un microlitre par échantillon dans des puits secs de culture de tissus blancs à fond plat avec code-barres. Plaques à 96 puits.

Il s’agit des deux plaques D qui sont utilisées pour évaluer l’inhibition de la réplication MV. Conservez-les également à moins 20 degrés Celsius. Cultivez des cellules T HEK 2 93 dans du DMM supplémenté en L-glutamine stabilisée tous les quatre à cinq jours, passez les cellules par la trypsine et faites une dilution sur 10 dans des flacons frais.

Pendant leur phase de croissance logarithmique, collectez et comptez les cellules pour l’expérience. Remettez les cellules en suspension à 300 000 cellules par millilitre. 12,5 millilitres de cellules à cette dilution sont nécessaires pour chaque plaque qui sera tamisée.

Maintenant, préparez les plaques avec un ensemble de puits de contrôle avec un microlitre de DMSO. Piquez un deuxième ensemble de puits de contrôle avec un microlitre de DMSO et 2,5 microlitres d’une solution d’ipol à 0,5 % pour tuer les cellules. Transférez la suspension cellulaire dans une auge et distribuez 100 microlitres dans chaque puits des plaques D.

Agitez régulièrement la suspension pour éviter la sédimentation. Ensuite, incubez les assiettes préparées pendant 24 heures. Préparez les cellules pour les plaques comme fait dans la section précédente.

Le milieu de culture peut être complété par de l’uridine pour filtrer les molécules antivirales qui ciblent les premières étapes de la biosynthèse de la pyrimidine, car celles-ci sont assez courantes. Conservez un dixième de la suspension cellulaire pour les puits de contrôle avec des cellules non infectées et infectez le volume restant. Décongelez suffisamment.

RMV deux solutions mères de luxe pour infecter la culture avec 0,1 particules infectieuses par cellule cible pour une multiplicité d’infection de 0,1. Ajoutez le volume calculé de virus à la suspension cellulaire et mélangez-le délicatement. Transférez les cellules infectées dans une auge et distribuez 100 microlitres de cellules infectées dans les deux plaques D.

Ciblez les colonnes deux à 11, qui contiennent les composés chimiques enrichis et les puits de contrôle positif dans les colonnes un et 12. Mélangez doucement les cellules dans l’auge en rangées alternées de colonnes un et 12, distribuez 100 microlitres de cellules non infectées. Maintenant, incubez les plaques pendant 24 heures.

Après le temps d’incubation, déterminez la viabilité des cellules à plaque D. Mélangez 50 microlitres de réactif de viabilité à base de luciférase dans chaque puits et attendez 10 minutes. Lisez ensuite les planches à l’aide d’un luminomètre.

Réglez le temps d’intégration sur 100 millisecondes par puits. Ensuite, déterminez la réplication MV dans les deux plaques D en mélangeant 50 microlitres de substrat Lucifer Firefly dans chaque puits et en attendant six minutes à température ambiante. Consultez ensuite un facteur Z pour chaque plaque D un et D deux du test de toxicité.

Poursuivez en calculant l’inhibition de la réplication virale. Les composés Hi sont ceux qui réduisent la réplication virale en dessous de la valeur seuil appliquée et ne sont pas toxiques pour chaque composé HI. Faites des dilutions en série dans le DMSO en commençant à 500 micromolaires et en descendant par demi-pas jusqu’à quatre micro-molaires le long d’une colonne d’une plaque à 96 puits, ajoutez un microlitre de la plaque de dilution du composé à la plaque de culture tissulaire à code-barres blanc.

Répétez ce processus deux fois pour créer un ensemble triplé de plaques de test. Remplissez ensuite les plaques de culture tissulaire avec 50 microlitres de milieu de culture. Préparez maintenant 37,5 millilitres de cellules T HEK 2 93, en suspension dans du DM EM supplémenté à 600 000 cellules par millilitre.

Chargez deux tubes de 15 millilitres avec 12,5 millilitres de suspension de cellule. Chacun infecte un tube de cellules avec RMV deux Luke à une multiplicité d’infection de 0,1. Infectez le deuxième tube de cellules avec de la ciboulette recombinante exprimant des lucifers de vanille.

Utilisez une multiplicité d’infection de 0,2. Mélangez les deux tubes de cellules infectées par le virus en utilisant l’inversion. Cela devrait être effectué dans un laboratoire de niveau de biosécurité trois, car en raison de la pathogénicité de la civée, chargez maintenant les cellules non infectées et les ensembles de cellules infectées dans leur propre ensemble de plaques composées HIIT.

Distribuez 50 microlitres de cellules par puits et incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, ajoutez 50 microlitres de luciférase dans chaque puits de cellules infectées par le RMV deux Luke. De même, ajoutez 50 microlitres de substrat de vanille Lucifer aux cellules infectées par Chick V Ren aux cellules de contrôle non infectées et ajoutez 50 microlitres de viabilité de base crucifère.

Le réactif procède en déterminant les concentrations de composés hi qui inhibent la réplication MV et Chick V de 50 %. Ce pipeline de criblage repose sur la sélection de composés qui ne présentent aucune toxicité cellulaire significative et inhibent à la fois la réplication MV et Chick V comme déterminé dans les cribles primaires et secondaires respectivement, il tire parti des virus recombinants exprimant des lucifers de lucifly ou de vanille. En tant que journaliste.

La toxicité des composés est évaluée à l’aide d’un test commercial basé sur les luciférants, où la luminescence est corrélée aux cellules vivantes sur cette plaque. 21 composés ont été jugés toxiques sur la base d’un seuil fixé par les puits de contrôle positif. L’activité antivirale a d’abord été mesurée à l’aide de la RMV deux.

Luke Luminescence a été comparé à la limite fixée par les puits de contrôle. Ici, quatre composés ont été trouvés capables d’inhiber la réplication virale à plus de 75 % dans l’autre test. Deux d’entre eux se sont avérés toxiques pour tous les composés HIIT.

La concentration inhibitrice demi-maximale a été déterminée sur les virus MV et Chick VRNA exprimant la luciférase. Ces deux virus ne sont pas liés et rendent ainsi l’écran plus robuste. En parallèle, l’absence de toxicité cellulaire de certains composés a été confirmée dans une expérience dose-réponse.

Au total, 13 composés non toxiques ont été identifiés à partir d’une bibliothèque chimique de 10 000 molécules. Ces composés étaient nouveaux en termes de structure chimique et d’activité biologique. Sur la base des similitudes structurelles, les composés se répartissaient en trois familles chimiques.

À titre de référence, des valeurs de concentration inhibitrice demi-maximales ont été obtenues avec une substance ayant une activité antivirale puissante. Lorsque l’on examine ces valeurs, moins d’un ordre de grandeur sépare la molécule de référence de la plupart des coups actifs identifiés à travers l’écran. Cela démontre l’activité antivirale relativement forte des composés sélectionnés une fois maîtrisés.

Cette technique peut être utilisée pour cribler de grandes bibliothèques chimiques dans un contexte de débit élevé, sélectionner des ensembles de petites molécules et rechercher des antiviraux à large spectre.