Name: Transient expression des gènes dans le tabac en utilisant Assemblée Gibson et le Gene Gun (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-18T18:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Découvrez l'expression transitoire de gènes dans le tabac pour la biologie végétale en utilisant l'assemblage Gibson et le gene gun. Cette méthode permet de cibler les chloroplastes et les peroxysomes sans enzymes de restriction.

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Les auteurs tiennent à remercier Jen Sheen de l&#39;Hôpital général du Massachusetts pour le généreux don de plants de Nicotiana benthamiana. Jen Bush nous a beaucoup aidé dans le conseil en culture des plantes et la mise en place d&#39;une zone de la chambre de croissance. Tom Ferrante de l&#39;Institut Wyss a offert une aide cruciale à la microscopie confocale. Les auteurs tiennent tout particulièrement à remercier Don Ingber de l&#39;Hôpital pour enfants de Boston et de l&#39;Institut Wyss pour le don généreux d&#39;un pistolet Gene et fournitures associées. Le financement de ce projet était prévu par un accord de coopération avec le ministère de l&#39;Énergie Advanced Research Projects Agency (ARPA-E Award # DE-000079) pour PAS, JCW, et MdM, et par Chimerion Biotechnology, Inc. pour MJV.

1. Conception de séquences d&#39;épissage alternative-pour Multiple Organelle ciblage <ol><li> Déterminer les sites d&#39;expression de la protéine finale. Pour ce travail, l&#39;intérêt est de cibler le chloroplaste, peroxysomes, et cytosol. </li><li> Utilisez la littérature pour identifier les protéines et les séquences d&#39;ADN connues pour cibler des protéines vers les organites d&#39;intérêt. Dans ce cas, une séquence de ciblage du chloroplaste d&#39;Arabidopsis thaliana L-méthyltransférase isoaspartate 6,15, et une séquence de ciblage de peroxysome de Arabidopsis thaliana transthyrétine-S-comme l&#39;allantoïne 16,17 synthase ont été déterminés. </li><li> Identifier un régime alternatif-épissage qui devrait cibler les protéines d&#39;intérêt pour les organites correctes. Pour ce travail, les sites d&#39;épissage comme observé dans un système de Arabidopsis naturel 6. La séquence de l&#39;ARNm a été redessiné en laissant les sites d&#39;épissage naturels, mais les séquences codantes ont été placés peroxis chloroplastiques ouome-balises de ciblage dans les introns épissés alternativement-(Figure 1). </li></ol> 2. Assemblée Gibson des parties ADN Voir aussi la figure 2. Le procédé d&#39;assemblage Gibson dépend de l&#39;action de plusieurs enzymes dans un mélange de pré-mesure pour 1) digérer partiellement les extrémités de l&#39;ADN double brin de faire brins simples et 2) recuire les paires de bases complémentaires de parties de l&#39;ADN voisin. Ceci permet le clonage de fragments d&#39;ADN, sans les limitations des sites de restriction. <ol><li> Choisir une commande pour les éléments dans le produit d&#39;assemblage d&#39;ADN plasmidique. A titre d&#39;exemple TriTag-1 a des éléments de: a) un vecteur plasmidique (pores, contenant une construction de GFP connu pour fonctionner dans les plantes, un marqueur de résistance à la kanamycine, et des origines de replication pour E. coli et Agrobacterium tumefaciens des hôtes), b) un séquence de promoteur, (P ENTCUP2, montré pour être constitutive dans les plantes), C) une séquence de ciblage du chloroplaste (CTS), c) une séquence de ciblage des peroxysomes (PTS), et d) une série de sites d&#39;épissage tel que décrit précédemment 6. </li><li> Concevoir la base de base de construction avec des logiciels de design in silico. ApE est un logiciel gratuit open source utile pour ce travail. Remarque: TriTag-1, a l&#39;ordre: vecteur plasmidique, promoteur, ATG, site donneur d&#39;épissage, séquence cible chloroplastes, site donneur d&#39;épissage, un site neutre, site accepteur d&#39;épissage, séquence cible peroxysomes, site accepteur d&#39;épissage, GFP figurant dans le vecteur plasmidique . <ol><li> Concevoir la construction d&#39;ADN en silico telle qu&#39;il y ait un chevauchement de 50 pb entre chaque pièce lors de la commande des amorces pour PCR. Il est possible d&#39;utiliser le chevauchement de 50 pb comme amorces: 25 paires de bases respectivement. <ol><li> Assurez-vous de garder une trace de l&#39;origine de chacun des morceaux de séquence. Est-il aussi: un plasmide d&#39;être cultivées et miniprepped; une séquence linéaire qui peut être utilisé comme matrice de PCR; ou une séquence qui devra êtresynthétisé dans le commerce? Plusieurs entreprises offrent des services de synthèse d&#39;ADN à faible coût pour les fragments &lt;500 pb. Dans ce cas, la TriTag lui-même est 437 pb si il était avantageux de commander le commerce. </li><li> Les meilleurs résultats sont si tous les fragments sont amplifiés par PCR et purifiés à partir de leur ADN matrice. Le marqueur de résistance est un bon endroit pour partager ce grand ADN en deux modèles plus petits qui sont plus facilement amplifié par PCR. </li><li> Restriction enzyme de restriction Dpnl coupe l&#39;ADN méthylé. Si la matrice de PCR était une miniprep à partir de E. coli, le traitement Dpnl va supprimer la matrice d&#39;ADN contaminant. </li></ol></li></ol></li><li> Purifier toutes les séquences d&#39;ADN et éluer séparément dans l&#39;eau, ou du tampon TE EB. <ol><li> vecteur de pores partie 1, ~ 3000 pb (flèches vertes). PCR amplifié et traité Dpnl. </li><li> vecteur de pores partie 2, ~ 3000 pb (flèches noires). PCR amplifié et traité Dpnl. </li><li> TriTag insert, 437 pb (flèches bleues). Commandé le commerce. Resuspend dans le trou DDH 2 O. </li><li> P ENTCUP promoteur, ~ 750 pb (flèches oranges). PCR-amplifié et traité Dpnl. </li></ol></li><li> Mesurer les concentrations de chacun des morceaux d&#39;ADN. But pour 150 ng / ul des morceaux de vecteur. </li><li> Prélever une partie aliquote de l&#39;ensemble mélange Gibson du congélateur et décongeler sur la glace. C&#39;est disponible dans le commerce, mais aussi simple à faire dans le laboratoire 12-14. <ol><li> Il ya deux étapes à cette recette: un mélange maître de 5x visqueux et 15 pi 1,33 aliquotes réaction de taille. Le mélange maître 5x contient: 3 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 300 ul de 1 M de MgCl2, 600 ul de 10 mM de chaque dNTP, 300 ul de 1 M DTT, 1,5 g de PEG-8000, 20 mg de NAD, et le trou DDH 2 O à 6 ml. Préparer 320 aliquotes (18) et de geler tous mais à -20 ° C. La solution sera très visqueux. Étiqueter ces &quot;tampon isotherme 5X&quot; </li><li> Pour celui qui reste (320 pi), ajouter 1,2 pi T5 Exonuclease, 20 pl Phusion Haute-Fidelity ADN polymérase, 160 pi de Taq ADN ligase et 700 pi ddH 2 O. Préparer 15 aliquotes (~ 80) sur la glace dans des tubes PCR et conserver à -20 ° C. </li></ol></li><li> Déterminer les volumes de quantités équimolaires de chacun des fragments. Il ya quelques calculatrices en ligne, y compris Gibthon.org. Il devrait y avoir un total de 5 ul de tous les morceaux d&#39;ADN. Ajoutez-les à la 15 pi Gibson mélanger aliquote. Si cela nécessite des volumes trop petits à la pipette, diluer les fragments d&#39;ADN et / ou d&#39;utiliser plus d&#39;une aliquote. <ol><li> N&#39;oubliez pas de préparer un contrôle de l&#39;ADN du vecteur seul (par exemple, la partie de l&#39;ADN contenant le marqueur de résistance à un antibiotique) et porter au volume avec de l&#39;eau. </li></ol></li><li> Incuber les tubes dans un cycleur thermique à 50-55 ° C pendant 30-60 minutes. Remplacer sur la glace et se transformer en E. coli via choc thermique cellules chimiquement compétentes. Ne pas utiliser des cellules électrocompétentes. La forte concentration en sel et la concentration d&#39;ADN relativement faiblepeut causer des cellules à l&#39;arc. <ol><li> Appliquer tous les 20 pi à une préparation commerciale de 200 pi du chlorure de calcium E. compétente coli. Incuber sur de la glace 30 min et 60 sec choc thermique à 42 ° C </li><li> Retour à la glace 2 min, appliquer 750 pi SOC ou milieu LB et récupérer secouant dans un tube à centrifuger 30 min à 37 ° C. Plaque du mélange et des dilutions appropriées sur LB + Kan (ou autre antibiotique approprié). Il peut en résulter fond supérieur (et un nombre plus élevé d&#39;événements de recombinaison non-cibles) que le traditionnel clonage basé ligature, mais il est utile de dépister environ 10 colonies. </li></ol></li><li> Confirmez clone par séquence et stocker une aliquote à -80 ° C </li></ol> 3. Biolistic transfection de tabac avec le pistolet à gènes Il s&#39;agit d&#39;une technique qui est établi dans JoVE 18,19. Étapes et les principales différences sont décrites ci-dessous. <ol><li> Cultivez 50-100 ml E. coli 200 ml ou Agrobacterium. Maxi-prep la culture. Une concentration d&#39;environ 1 500 ng / pl est nécessaire pour continuer. </li><li> Préparer gènes balles d&#39;arme à feu tel que décrit précédemment. Chargez-les dans le pistolet à gènes. </li><li> Pour la transfection de Nicotiana benthamiana tabac tissu feuille épidermique, choisissez une grande feuille près de la base d&#39;une usine de 3 mois. Découpez soigneusement et placez-le côté bas en haut sur des serviettes en papier humide dans une boîte de Petri de 15 cm. </li><li> Régler la pression Il pour le pistolet à gènes à 200-250 psi. </li><li> Viser soigneusement le pistolet à gènes entre les nervures sur la face inférieure d&#39;une feuille, environ 3-5 cm au-dessus. Relâcher la sécurité et délivrer les particules à la feuille. Chaque puce peut être utilisée deux fois au même endroit sur la feuille. Si l&#39;explosion de la feuille, jeter et recommencer une feuille-il nouveau, c&#39;est une certaine variation dans la feuille ténacité en raison de conditions de croissance tels que l&#39;âge, l&#39;humidité, etc Pour un 12 cm feuille, s&#39;attendre à tenir environ 6 coups. </li><li> Rangez la feuille, couvert avec le haut d&#39;unBoîte de Pétri pendant 2-3 jours en basse lumière sur le banc. </li><li> Examinez la feuille dans un microscope de dissection équipé fluorescence UV, et la recherche de cellules individuelles exprimant la GFP. Disséquer 5-10 sections mm de feuille. </li><li> Plonger la feuille dans une lame de microscope dans des puits profonds sous ~ 200 ul de 0,1% de Triton X-100. Le détergent permet d&#39;éviter les bulles d&#39;air de se former sur la surface, et la glissière de microscope bien profond permet une plus grande surface d&#39;imagerie des tissus. </li></ol> 4. Microscopie confocale de tissus transfectées Ces instructions varient pour chaque instrument, il est donc essentiel de se bien formés. <ol><li> Pour les expériences de détection par fluorescence, réglez le laser d&#39;excitation à 489 nm, et définir les détecteurs photomultiplicateurs à 500-569 nm pour fluorescence de la GFP et de 630 à 700 nm pour la chlorophylle auto-fluorescence. cellules de l&#39;image en utilisant un objectif 40x immersion dans l&#39;eau. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Dans cette étude, des stratégies simples sont décrits pour la localisation d&#39;une seule protéine transgénique à plusieurs compartiments cellulaires chez les plantes. L&#39;objectif était de concevoir construction qui exprimerait un seul gène dans plus d&#39;un organite dans Nicotiana benthamiana. Les stratégies comprennent la conception rationnelle de constructions à base d&#39;ADN GFP, assemblage Gibson, la livraison des plasmides aux cellules de la feuille avec le pistolet à gènes, et l&#39;observation des...

Ce travail est un projet d&#39;ingénierie / de la biologie synthétique métabolique dans lequel les cellules végétales sont modifiées pour exprimer une protéine rapporteur dans plusieurs organites mais avec une seule construction d&#39;ADN. Une approche pour cibler des protéines à plus d&#39;un emplacement de clonage implique de multiples copies génétiques, chacune contenant un peptide de localisation différente. Chaque copie doit être introduite par retransformation successifs, ou encore, par rétrocroisement transformations simples 1. Il s&#39;agit de clonage supplémentaire, et est limitée par une balise de localisation par terminus. Une autre façon de localiser une protéine à plusieurs endroits à travers l&#39;épissage alternatif 2-5. ARN est transcrit à partir d&#39;un seul gène, mais différentes copies de la transcription sont traitées différemment, souvent dans plus d&#39;un titre par cellule. Cela peut entraîner plus d&#39;un ARN messager dans la cellule transcrit à partir d&#39;un gène unique. Ces différents messengeARN R peut coder pour différentes isoformes de la même protéine, ou dans le cas d&#39;un décalage du cadre, une protéine différente. Bien que l&#39;épissage alternatif ont été décrits dans la littérature depuis de nombreuses années, les mécanismes d&#39;action et de donneur conservée et les sites d&#39;épissage des récepteurs ne sont élucidés, plus récemment, 6. Comme ces sites sont mieux décrites, elles ouvrent des opportunités pour l&#39;ingénierie. ingénieurs métaboliques des plantes sont confrontés à un défi en exprimant une protéine dans plusieurs organites. Pour une protéine qui doit être localisée à plus d&#39;un organite, le mécanicien doit cloner le gène même plusieurs fois, chacune avec une séquence signal séparé le diriger vers l&#39;organite d&#39;intérêt. Pour un gène unique en trois organelles, il s&#39;agit simplement de trois gènes. Mais pour une voie métabolique six gène, cela élargit à 18 gènes, un effort significatif de clonage. Combinaison de plusieurs séquences de localisation en un seul signe de gène, alternativement épisséréduit ificantly cet effort. Par exemple, re-engineering photorespiration 7,8 et la synthèse des isoprénoïdes 9,10 implique à la fois les chloroplastes et les peroxysomes. Dans notre cas, nous avons profité de sites d&#39;épissage comme observé dans un système naturel de Arabidopsis thaliana décrit précédemment 6. Nous rationnelle redessiné la séquence d&#39;ARNm de quitter les sites d&#39;épissage naturels seul, mais placés séquences qui coder chloroplastes ou des balises péroxisome ciblage dans les introns épissés alternativement-(Figure 1). La protéine exprimée peut être ou ne pas avoir une étiquette, selon que le pré-ARNm codé qui a été excisé sous la forme d&#39;un intron (figures 1g et 1h). Pour plus d&#39;informations sur la conception des constructions présentées dans ce travail, s&#39;il vous plaît voir l&#39;article de compagnon 11. Parce que c&#39;est encore un effort significatif de clonage, assemblage Gibson, une nouvelle méthode de clonage des constructions d&#39;ADN, est used dans la construction. Procédé Gibson peut être utilisée pour n&#39;importe quelle séquence, indépendamment de sites de restriction (figure 2) de 12 à 14. La composition précise des enzymes permet en une seule étape, l&#39;assemblage isotherme. Dans ce procédé, plusieurs parties linéaires à double brin d&#39;ADN ont été conçus de telle sorte qu&#39;ils ont des séquences chevauchantes de ~ 50 bp. L&#39;ensemble de mélange d&#39;enzymes Gibson digère partiellement les parties d&#39;ADN linéaires, exposant simples brins de séquences homologues. Ces séquences simple brin partiels sont à nouveau recuit dans le mélange réactionnel, résultant en une seule étape, indépendante de la séquence, la réaction de ligature sous-clonage libre-rapide. Ce travail décrit une) conception rationnelle constructions épissage alternatif pour l&#39;expression dans les chloroplastes des plantes, les peroxysomes, et cytosols, 2) leur clonage en utilisant le nouveau procédé d&#39;assemblage Gibson libre ligature, 3) leur livraison dans les cellules de la feuille de tabac avec le pistolet à gènes, et 4) des résultats montrant ciblage organite, comme observé avec la GFPet microscopie confocale.

<table><tbody><tr><td>Amorces d’oligonucléotides</td><td>IDT</td><td>(personnalisé)</td><td>Conçu spécifiquement pour la construction</td></tr><tr><td>GeneBlocks</td><td>IDT</td><td>(personnalisé)</td><td>Oligonucléotides de 500 pb</td></tr><tr><td>Logiciel ApE</td><td>U Utah</td><td>(télécharger)</td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td></tr> <tr><td>MinElute kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Utilisé pour purifier les produits de PCR</td></tr><tr><td>QIAprep spin miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Utilisé pour préparer des quantités de plasmide appropriées au clonage</td></tr><tr><td>Phusion Master Mix avec tampon GC</td><td>NEB</td><td>M0532S</td><td>Utilisé pour amplifier par PCR le gène d’intérêt Mélange de réaction d’assemblage Gibson</td></tr><tr><td></td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Mélange principal des 9 ingrédients suivants</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH7.5</td><td>Teknova</td><td>T1075</td><td>Gibson mix</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>G Biosiences</td><td>82023-086</td><td>Gibson mélange</td></tr><tr><td>de montage dNTP</td><td>mix Fermentas</td><td>R0192</td><td>Gibson mélange de montage</td></tr><tr><td>1 M DTT</td><td>Fermentas</td><td>R0861</td><td>Gibson mélange de montage</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Affymetrix</td><td>19966</td><td>Gibson mélange de montage</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Applichem</td><td>A1124,0005</td><td>Gibson mélange de montage</td></tr><tr><td>T5 exonucléase</td><td>Epicentre</td><td>T5E4111K</td><td>Mélange d’assemblage Gibson</td></tr><tr><td>Phusion polymérase</td><td>NEB</td><td>F530S</td><td>Gibson mélange d’assemblage</td></tr><tr><td>Taq DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0208L</td><td>Gibson mélange</td></tr><tr><td>d’assemblage Gibthon.org</td><td></td><td></td><td>site Web pour simplifier les calculs</td></tr><tr><td>Plasmide PLUS Maxi kit</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td>Utilisé pour préparer l’ADN pour les balles de pistolet</td></tr><tr><td>à gènes Système de pistolet à gènes</td><td>BioRad</td><td>165-2451</td><td>Comprend toutes les pièces nécessaires</td></tr><tr><td>Nicotania benthamiana</td><td>(n/a)</td><td>(n/a)</td><td>Don de Jen Sheen, MGH</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica</td><td>SP5 X MP</td><td>Imagerie des cellules résultantes Lames de</td></tr><tr><td>puits profonds</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>71561-01</td><td>Utilisé pour l’imagerie confocale</td></tr><tr><td>Un éditeur de plasmides (ApE) </td><td>Université de l’Utah </td><td></td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td></tr><tr><td>Gibthon :Calculatrice</td><td></td><td></td><td>de</td> ligature http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</tr></tbody></table>

transient expression des gènes dans le tabac en utilisant assemblée gibson et le gene gun

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Afin de cibler une seule protéine à plusieurs organites intracellulaires, plantes généralement double emploi avec les gènes pertinents, et d&#39;exprimer chaque gène séparément à l&#39;aide des stratégies de réglementation complexes, y compris les promoteurs de différentiels et / ou des séquences de signaux. Ingénieurs métaboliques et les biologistes synthétiques intéressés à cibler les enzymes à un organite particulier sont confrontés à un défi: Pour une protéine qui doit être localisée à plus d&#39;un organite, l&#39;ingénieur doit cloner le gène même plusieurs fois. Ce travail présente une solution à cette stratégie: exploiter l&#39;épissage alternatif de l&#39;ARNm. Cette technique tire parti du chloroplaste établi et des séquences de ciblage de peroxysome et les combine en un seul ARNm qui est épissé de façon alternative. Certains variants d&#39;épissage sont envoyés vers le chloroplaste, les uns pour le peroxysome, et certains au cytosol. Ici, le système est conçu pour les multiples ciblant un organite de l&#39;épissage alternatif. Dans ce travail, la GFP a été prévu pour être exprEssed dans le chloroplaste, cytosol, et peroxysomes par une série d&#39;conçus rationnellement 5 &#39;de l&#39;ARNm des tags. Ces balises ont le potentiel de réduire la quantité de clonage nécessaire lorsque des gènes hétérologues doivent être exprimés en plusieurs organites intracellulaires. Les constructions ont été conçues dans le travail précédent 11, et ont été clones en utilisant Gibson assemblage, un procédé de clonage indépendant de la ligature qui ne nécessite pas d&#39;enzymes de restriction. Les plasmides résultants ont été introduits dans les cellules épidermiques des feuilles de Nicotiana benthamiana avec un protocole Gene Gun modifié. Enfin, les feuilles transformées ont été observées par microscopie confocale.

L&#39;effort de conception est le résultat d&#39;une planification importante. Roman de ce projet est l&#39;utilisation de l&#39;épissage alternatif de créer un pré-ARNm qui est traduit en protéines exprimées de façon différentielle. Ces protéines sont exprimées dans différents organelles, dans ce cas, le chloroplaste, des peroxysomes et / ou cytosol. Nous avons adapté gène d&#39;Arabidopsis naturel qui est épissage alternatif 6, et placé chloroplaste 6 et 17 peroxysomes connus ...

Ce travail décrit un nouveau procédé pour cibler sélectivement des organelles sous-cellulaires dans les plantes, dosés par la BioRad Gene Gun.

Transient expression des gènes dans le tabac en utilisant Assemblée Gibson et le Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'observer l'expression transitoire d'un gène rapporteur marqué par une GFP dans les cellules épidermiques de feuille de tabac. Cela est réalisé en concevant d'abord un construct d'ADN qui sera exprimé dans les chloroplastes et les peroxysomes. Le construct est ensuite assemblé par amplification en chaîne par polymérase (PCR) et assemblage Gibson.Ensuite, un canon à gènes est utilisé pour délivrer le construct à des cellules épidermiques de feuille de tabac. En fin de compte, l'imagerie de la feuille de tabac par microscopie confocale révèle l'expression de la GFP dans le chloroplaste et le peroxysome. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le clonage classique, est qu'elle ne nécessite pas d'enzymes de restriction, et par conséquent, toute séquence pouvant être amplifiée par PCR peut être clonée.En raison de la souplesse de la conception génétique, les applications de ces techniques s'étendent à une échelle plus grande. L'ingénierie génétique des plantes agricoles commence ce protocole en déterminant les sites au sein de la cellule végétale destinés à l'expression finale de la protéine. Pour ce travail, l'objectif est de cibler l'expression vers le chloroplaste, le peroxysome et le cytosol.Ensuite, concevez le vecteur d'expression. Le vecteur doit contenir un promoteur, un gène détectable et un terminateur au sein d'un seul plasmide. Dans ce cas, le promoteur constitutif P end cup deux contrôle l'expression de la GFP, suivie par le terminateur de synthétase Nolene ou nos t.Notez que dans cette expérience, nous allons tester une série d'étiquettes, les étiquettes trit, une, deux et trois, exprimées en terminaison N-terminale de la GFP pour une expression dans les chloroplastes et les peroxysomes. La méthode d'assemblage Gibson repose sur l'action de plusieurs enzymes présentes dans un mélange préfabriqué, qui digèrent partiellement les extrémités de l'ADN double brin et facilitent l'hybridation des paires de bases complémentaires des séquences d'ADN voisines. Le vecteur final comporte trois éléments qui doivent être amplifiés lors de quatre réactions de PCR avant l'assemblage Gibson.Les première et deuxième réactions amplifient un vecteur plasmidique de 8&nbsp;000 paires de bases, PORE, qui contient GFP NOS T et un marqueur de résistance à la cany. Le marqueur de résistance constitue un bon site pour diviser cet ADN de grande taille en deux modèles plus petits, plus facilement amplifiables par PCR. La troisième réaction amplifie le promoteur P end cup deux, et la quatrième réaction amplifie triag un à l’aide d’un logiciel de conception in silico tel qu’ape design, en assemblant le construct de base en base, de sorte qu’il existe un recouvrement de 50 paires de bases entre chaque fragment.Lors de la commande d'amorces pour la PCR, il est possible d'utiliser le chevauchement de 50 paires de bases comme amorces, avec 25 paires de bases dans chaque direction. Après avoir effectué la PCR pour amplifier chaque composant, purifier séparément les produits de PCR et les diluer dans de l'eau distillée désionisée. Si le modèle d'ADN pour la PCR provenait d'une minipréparation d'E. coli traitée par l'enzyme de restriction DpnI, cela permettra d'éliminer l'ADN du modèle contaminant. Ensuite, mesurer les concentrations de chacun des fragments d'ADN.Ajustez la concentration du vecteur à environ 150 nanogrammes par microlitre pour chaque construit à assembler, y compris un témoin. Prélevez un aliquot de 15 microlitres du mélange Gibson Assembly sorti du congélateur et faites-le dégeler sur de la glace. À l’aide de l’outil en ligne gratuit @gibbon.org, déterminez les volumes correspondant à des quantités équimolaires de chacun des fragments.Ajoutez le volume calculé de chacun des fragments au mélange Gibson de 15 microlitres. Préparez également un témoin constitué uniquement de l'ADN vecteur. Le volume total de chaque réaction doit être de 20 microlitres.Utilisez de l'eau pour ajuster le volume si nécessaire. Incubez les tubes à 50 à 55 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes. Après l'incubation, replacez les tubes sur de la glace.Retirer un tube microfuge contenant une préparation commerciale de 200 microlitres de *E. coli* compétent au chlorure de calcium d'un congélateur à moins 80 degrés Celsius, puis le réchauffer légèrement à la main. Ajouter ensuite l'intégralité des 20 microlitres de la réaction à l'*E. coli*. Incuber les cultures sur de la glace pendant 30 minutes, puis les transférer dans un bain-marie à 42 degrés Celsius et effectuer un choc thermique pendant 60 secondes.N'utilisez pas de cellules électro-compétentes. La concentration relativement élevée en sel et la faible concentration en ADN peuvent provoquer un arc électrique dans les cellules après la transformation. Remettez les cultures sur de la glace pendant deux minutes, puis ajoutez 750 microlitres de milieu SOC ou LB et laissez-les récupérer pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.Plaque suivante, déposer le mélange sur des plaques LB contenant de la cany ou un autre antibiotique approprié, puis incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Analyser 10 colonies par séquençage. Remarque : cette méthode peut entraîner un bruit de fond plus élevé et un nombre accru d'événements de recombinaison non ciblés par rapport au clonage classique basé sur la ligature. La transfection biotique du tabac à l’aide d’un pistolet à gènes a déjà été décrite dans JoVE.Ici, les étapes clés et les différences par rapport aux protocoles précédents sont passées en revue. Après amplification et isolement des constructions, préparez des microprojectiles pour le pistolet à gènes comme décrit dans l'article JoVE par woods et zeto, puis chargez-les dans le pistolet à gènes pour la transfection du tissu épidermique de feuille de tabac Nico Tania Benham Miana. Choisissez une grande feuille proche de la base d'une plante âgée de trois à cinq mois.Placez-le délicatement par en dessous sur des serviettes en papier humides dans une boîte de Pétri de 15 centimètres en portant une protection oculaire et auditive appropriée. Réglez la pression d'hélium du pistolet à gènes entre 200 et 250 PS.I. Visez soigneusement le pistolet à gènes entre les nervures sur la face inférieure d'une feuille, à environ trois à cinq centimètres au-dessus. Désengagez la sécurité et délivrez les particules sur la feuille.Utilisez chaque projectile deux fois au même endroit sur la feuille. Passez à un autre emplacement et répétez le processus si la feuille explose, jetez-la et commencez avec une nouvelle feuille. Il existe une certaine variabilité de la résistance des feuilles en raison des conditions de croissance, telles que l'âge, l'humidité, entre autres.Une fois toutes les injections effectuées, couvrez la feuille et conservez-la deux à trois jours dans une lumière faible sur la paillasse. Examinez la feuille au microscope stéréoscopique équipé d'une fluorescence UV et recherchez les cellules individuelles exprimant la GFP. Lorsque des cellules exprimant la GFP sont observées, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour extraire soigneusement des fragments de feuille de cinq à dix millimètres.Immerger immédiatement chaque fragment foliaire individuel dans la cavité d'une lame de microscope à puits profond contenant environ 200 microlitres de Triton X-100 à 0,1 %. Le détergent aide à prévenir la formation de bulles d'air à la surface, et la lame de microscope à puits profond permet une zone d'imagerie tissulaire plus grande pour l'observation des cellules au microscope confocal équipé des filtres appropriés et d'un objectif à immersion dans l'eau de 40 x. Dans cette étude, les trois constructions différentes de ciblage d'organites par GFP ont été comparées à la GFP non marquée et à une rubis.Coag.La microscopie confocale GFP a été utilisée pour détecter la fluorescence GFP dans les cellules individuelles transitoirement transformées lors d'expériences de contrôle dans lesquelles le GFP non marqué était exprimé. La fluorescence est observée uniquement dans le noyau et le cytosol, mais pas dans le chloroplaste, qui sont identifiés par la fluorescence rouge autofluorescente de la chlorophylle, comme illustré dans cet exemple de cellule transfectée avec un construct Rubis Oag destiné uniquement au chloroplaste. Le construct GFP a été exprimé dans les grands organites.La cellule est délimitée en blanc. Le jaune indique les zones de colocalisation de la construction avec la chlorophylle, ce qui montre que la construction est dirigée vers le chloroplaste. Comme le montre cette image, dans une cellule transfectée avec triag un, l'expression de la GFP est observée dans le chloroplaste, aux périphéries, dans le cytosol et dans de petites organites ponctuées, probablement des peroxyosomes. De même, les cellules transfectées avec triag deux expriment également la GFP dans le chloroplaste, le cytosol et les peroxyosomes. Triag trois, qui comprend un signal de peroxyosome intégré dans une région de faible complexité de la séquence du chloroplaste, se localise uniquement dans le chloroplaste et le peroxyosome.Remarquez que cette cellule se trouve dans une couche foliaire différente. Cette figure résume l'expression observée dans les compartiments d'une cellule épidermique typique de feuille de tabac. Les tailles et positions relatives au sein de la cellule sont indiquées, ainsi que les niveaux d'expression relatifs observés par transfection au canon à gènes et microscopie confocale.Notez que la GFP non marquée se localise dans le cytosol et le noyau, que le contrôle PIMT deux GFP se localise dans le chloroplaste, et que triag une GFP, triag deux GFP et Triag 3G FP se localisent dans le chloroplaste et le peroxysome, comme prévu. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment construire un plasmide par assemblage Gibson, le délivrer par balistique dans des feuilles de tabac et observer l'expression de la GFP en trois jours. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir d'utiliser 150 nanogrammes par microlitre d'ADN vecteur pour l'assemblage Gibson, et 1500 nanogrammes par microlitre de votre construit final d'ADN pour fabriquer vos microprojectiles. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme la transfection par agrobactérie, peuvent être réalisées afin d'obtenir une expression génique stable plutôt que transitoire.

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Transient expression des gènes dans le tabac en utilisant Assemblée Gibson et le Gene Gun

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