Transient expression des gènes dans le tabac en utilisant Assemblée Gibson et le Gene Gun

L'objectif général de l'expérience suivante est d'observer l'expression transitoire d'un gène rapporteur marqué par une GFP dans les cellules épidermiques de feuille de tabac. Cela est réalisé en concevant d'abord un construct d'ADN qui sera exprimé dans les chloroplastes et les peroxysomes. Le construct est ensuite assemblé par amplification en chaîne par polymérase (PCR) et assemblage Gibson.

Ensuite, un canon à gènes est utilisé pour délivrer le construct à des cellules épidermiques de feuille de tabac. En fin de compte, l'imagerie de la feuille de tabac par microscopie confocale révèle l'expression de la GFP dans le chloroplaste et le peroxysome. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le clonage classique, est qu'elle ne nécessite pas d'enzymes de restriction, et par conséquent, toute séquence pouvant être amplifiée par PCR peut être clonée.

En raison de la souplesse de la conception génétique, les applications de ces techniques s'étendent à une échelle plus grande. L'ingénierie génétique des plantes agricoles commence ce protocole en déterminant les sites au sein de la cellule végétale destinés à l'expression finale de la protéine. Pour ce travail, l'objectif est de cibler l'expression vers le chloroplaste, le peroxysome et le cytosol.

Ensuite, concevez le vecteur d'expression. Le vecteur doit contenir un promoteur, un gène détectable et un terminateur au sein d'un seul plasmide. Dans ce cas, le promoteur constitutif P end cup deux contrôle l'expression de la GFP, suivie par le terminateur de synthétase Nolene ou nos t.

Notez que dans cette expérience, nous allons tester une série d'étiquettes, les étiquettes trit, une, deux et trois, exprimées en terminaison N-terminale de la GFP pour une expression dans les chloroplastes et les peroxysomes. La méthode d'assemblage Gibson repose sur l'action de plusieurs enzymes présentes dans un mélange préfabriqué, qui digèrent partiellement les extrémités de l'ADN double brin et facilitent l'hybridation des paires de bases complémentaires des séquences d'ADN voisines. Le vecteur final comporte trois éléments qui doivent être amplifiés lors de quatre réactions de PCR avant l'assemblage Gibson.

Les première et deuxième réactions amplifient un vecteur plasmidique de 8 000 paires de bases, PORE, qui contient GFP NOS T et un marqueur de résistance à la cany. Le marqueur de résistance constitue un bon site pour diviser cet ADN de grande taille en deux modèles plus petits, plus facilement amplifiables par PCR. La troisième réaction amplifie le promoteur P end cup deux, et la quatrième réaction amplifie triag un à l’aide d’un logiciel de conception in silico tel qu’ape design, en assemblant le construct de base en base, de sorte qu’il existe un recouvrement de 50 paires de bases entre chaque fragment.

Lors de la commande d'amorces pour la PCR, il est possible d'utiliser le chevauchement de 50 paires de bases comme amorces, avec 25 paires de bases dans chaque direction. Après avoir effectué la PCR pour amplifier chaque composant, purifier séparément les produits de PCR et les diluer dans de l'eau distillée désionisée. Si le modèle d'ADN pour la PCR provenait d'une minipréparation d'E. coli traitée par l'enzyme de restriction DpnI, cela permettra d'éliminer l'ADN du modèle contaminant. Ensuite, mesurer les concentrations de chacun des fragments d'ADN.

Ajustez la concentration du vecteur à environ 150 nanogrammes par microlitre pour chaque construit à assembler, y compris un témoin. Prélevez un aliquot de 15 microlitres du mélange Gibson Assembly sorti du congélateur et faites-le dégeler sur de la glace. À l’aide de l’outil en ligne gratuit @gibbon.org, déterminez les volumes correspondant à des quantités équimolaires de chacun des fragments.

Ajoutez le volume calculé de chacun des fragments au mélange Gibson de 15 microlitres. Préparez également un témoin constitué uniquement de l'ADN vecteur. Le volume total de chaque réaction doit être de 20 microlitres.

Utilisez de l'eau pour ajuster le volume si nécessaire. Incubez les tubes à 50 à 55 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes. Après l'incubation, replacez les tubes sur de la glace.

Retirer un tube microfuge contenant une préparation commerciale de 200 microlitres de *E. coli* compétent au chlorure de calcium d'un congélateur à moins 80 degrés Celsius, puis le réchauffer légèrement à la main. Ajouter ensuite l'intégralité des 20 microlitres de la réaction à l'*E. coli*. Incuber les cultures sur de la glace pendant 30 minutes, puis les transférer dans un bain-marie à 42 degrés Celsius et effectuer un choc thermique pendant 60 secondes.

N'utilisez pas de cellules électro-compétentes. La concentration relativement élevée en sel et la faible concentration en ADN peuvent provoquer un arc électrique dans les cellules après la transformation. Remettez les cultures sur de la glace pendant deux minutes, puis ajoutez 750 microlitres de milieu SOC ou LB et laissez-les récupérer pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Plaque suivante, déposer le mélange sur des plaques LB contenant de la cany ou un autre antibiotique approprié, puis incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Analyser 10 colonies par séquençage. Remarque : cette méthode peut entraîner un bruit de fond plus élevé et un nombre accru d'événements de recombinaison non ciblés par rapport au clonage classique basé sur la ligature. La transfection biotique du tabac à l’aide d’un pistolet à gènes a déjà été décrite dans JoVE.

Ici, les étapes clés et les différences par rapport aux protocoles précédents sont passées en revue. Après amplification et isolement des constructions, préparez des microprojectiles pour le pistolet à gènes comme décrit dans l'article JoVE par woods et zeto, puis chargez-les dans le pistolet à gènes pour la transfection du tissu épidermique de feuille de tabac Nico Tania Benham Miana. Choisissez une grande feuille proche de la base d'une plante âgée de trois à cinq mois.

Placez-le délicatement par en dessous sur des serviettes en papier humides dans une boîte de Pétri de 15 centimètres en portant une protection oculaire et auditive appropriée. Réglez la pression d'hélium du pistolet à gènes entre 200 et 250 PS.I. Visez soigneusement le pistolet à gènes entre les nervures sur la face inférieure d'une feuille, à environ trois à cinq centimètres au-dessus. Désengagez la sécurité et délivrez les particules sur la feuille.

Utilisez chaque projectile deux fois au même endroit sur la feuille. Passez à un autre emplacement et répétez le processus si la feuille explose, jetez-la et commencez avec une nouvelle feuille. Il existe une certaine variabilité de la résistance des feuilles en raison des conditions de croissance, telles que l'âge, l'humidité, entre autres.

Une fois toutes les injections effectuées, couvrez la feuille et conservez-la deux à trois jours dans une lumière faible sur la paillasse. Examinez la feuille au microscope stéréoscopique équipé d'une fluorescence UV et recherchez les cellules individuelles exprimant la GFP. Lorsque des cellules exprimant la GFP sont observées, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour extraire soigneusement des fragments de feuille de cinq à dix millimètres.

Immerger immédiatement chaque fragment foliaire individuel dans la cavité d'une lame de microscope à puits profond contenant environ 200 microlitres de Triton X-100 à 0,1 %. Le détergent aide à prévenir la formation de bulles d'air à la surface, et la lame de microscope à puits profond permet une zone d'imagerie tissulaire plus grande pour l'observation des cellules au microscope confocal équipé des filtres appropriés et d'un objectif à immersion dans l'eau de 40 x. Dans cette étude, les trois constructions différentes de ciblage d'organites par GFP ont été comparées à la GFP non marquée et à une rubis.Coag.

La microscopie confocale GFP a été utilisée pour détecter la fluorescence GFP dans les cellules individuelles transitoirement transformées lors d'expériences de contrôle dans lesquelles le GFP non marqué était exprimé. La fluorescence est observée uniquement dans le noyau et le cytosol, mais pas dans le chloroplaste, qui sont identifiés par la fluorescence rouge autofluorescente de la chlorophylle, comme illustré dans cet exemple de cellule transfectée avec un construct Rubis Oag destiné uniquement au chloroplaste. Le construct GFP a été exprimé dans les grands organites.

La cellule est délimitée en blanc. Le jaune indique les zones de colocalisation de la construction avec la chlorophylle, ce qui montre que la construction est dirigée vers le chloroplaste. Comme le montre cette image, dans une cellule transfectée avec triag un, l'expression de la GFP est observée dans le chloroplaste, aux périphéries, dans le cytosol et dans de petites organites ponctuées, probablement des peroxyosomes. De même, les cellules transfectées avec triag deux expriment également la GFP dans le chloroplaste, le cytosol et les peroxyosomes. Triag trois, qui comprend un signal de peroxyosome intégré dans une région de faible complexité de la séquence du chloroplaste, se localise uniquement dans le chloroplaste et le peroxyosome.

Remarquez que cette cellule se trouve dans une couche foliaire différente. Cette figure résume l'expression observée dans les compartiments d'une cellule épidermique typique de feuille de tabac. Les tailles et positions relatives au sein de la cellule sont indiquées, ainsi que les niveaux d'expression relatifs observés par transfection au canon à gènes et microscopie confocale.

Notez que la GFP non marquée se localise dans le cytosol et le noyau, que le contrôle PIMT deux GFP se localise dans le chloroplaste, et que triag une GFP, triag deux GFP et Triag 3G FP se localisent dans le chloroplaste et le peroxysome, comme prévu. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment construire un plasmide par assemblage Gibson, le délivrer par balistique dans des feuilles de tabac et observer l'expression de la GFP en trois jours. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir d'utiliser 150 nanogrammes par microlitre d'ADN vecteur pour l'assemblage Gibson, et 1500 nanogrammes par microlitre de votre construit final d'ADN pour fabriquer vos microprojectiles. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme la transfection par agrobactérie, peuvent être réalisées afin d'obtenir une expression génique stable plutôt que transitoire.