Name: Transient expression des gènes dans le tabac en utilisant Assemblée Gibson et le Gene Gun (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-18T18:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Découvrez l'expression transitoire de gènes dans le tabac pour la biologie végétale en utilisant l'assemblage Gibson et le gene gun. Cette méthode permet de cibler les chloroplastes et les peroxysomes sans enzymes de restriction.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Les auteurs tiennent à remercier Jen Sheen de l&#39;Hôpital général du Massachusetts pour le généreux don de plants de Nicotiana benthamiana. Jen Bush nous a beaucoup aidé dans le conseil en culture des plantes et la mise en place d&#39;une zone de la chambre de croissance. Tom Ferrante de l&#39;Institut Wyss a offert une aide cruciale à la microscopie confocale. Les auteurs tiennent tout particulièrement à remercier Don Ingber de l&#39;Hôpital pour enfants de Boston et de l&#39;Institut Wyss pour le don généreux d&#39;un pistolet Gene et fournitures associées. Le financement de ce projet était prévu par un accord de coopération avec le ministère de l&#39;Énergie Advanced Research Projects Agency (ARPA-E Award # DE-000079) pour PAS, JCW, et MdM, et par Chimerion Biotechnology, Inc. pour MJV.

1. Conception de séquences d&#39;épissage alternative-pour Multiple Organelle ciblage <ol><li> Déterminer les sites d&#39;expression de la protéine finale. Pour ce travail, l&#39;intérêt est de cibler le chloroplaste, peroxysomes, et cytosol. </li><li> Utilisez la littérature pour identifier les protéines et les séquences d&#39;ADN connues pour cibler des protéines vers les organites d&#39;intérêt. Dans ce cas, une séquence de ciblage du chloroplaste d&#39;Arabidopsis thaliana L-méthyltransférase isoaspartate 6,15, et une séquence de ciblage de peroxysome de Arabidopsis thaliana transthyrétine-S-comme l&#39;allantoïne 16,17 synthase ont été déterminés. </li><li> Identifier un régime alternatif-épissage qui devrait cibler les protéines d&#39;intérêt pour les organites correctes. Pour ce travail, les sites d&#39;épissage comme observé dans un système de Arabidopsis naturel 6. La séquence de l&#39;ARNm a été redessiné en laissant les sites d&#39;épissage naturels, mais les séquences codantes ont été placés peroxis chloroplastiques ouome-balises de ciblage dans les introns épissés alternativement-(Figure 1). </li></ol> 2. Assemblée Gibson des parties ADN Voir aussi la figure 2. Le procédé d&#39;assemblage Gibson dépend de l&#39;action de plusieurs enzymes dans un mélange de pré-mesure pour 1) digérer partiellement les extrémités de l&#39;ADN double brin de faire brins simples et 2) recuire les paires de bases complémentaires de parties de l&#39;ADN voisin. Ceci permet le clonage de fragments d&#39;ADN, sans les limitations des sites de restriction. <ol><li> Choisir une commande pour les éléments dans le produit d&#39;assemblage d&#39;ADN plasmidique. A titre d&#39;exemple TriTag-1 a des éléments de: a) un vecteur plasmidique (pores, contenant une construction de GFP connu pour fonctionner dans les plantes, un marqueur de résistance à la kanamycine, et des origines de replication pour E. coli et Agrobacterium tumefaciens des hôtes), b) un séquence de promoteur, (P ENTCUP2, montré pour être constitutive dans les plantes), C) une séquence de ciblage du chloroplaste (CTS), c) une séquence de ciblage des peroxysomes (PTS), et d) une série de sites d&#39;épissage tel que décrit précédemment 6. </li><li> Concevoir la base de base de construction avec des logiciels de design in silico. ApE est un logiciel gratuit open source utile pour ce travail. Remarque: TriTag-1, a l&#39;ordre: vecteur plasmidique, promoteur, ATG, site donneur d&#39;épissage, séquence cible chloroplastes, site donneur d&#39;épissage, un site neutre, site accepteur d&#39;épissage, séquence cible peroxysomes, site accepteur d&#39;épissage, GFP figurant dans le vecteur plasmidique . <ol><li> Concevoir la construction d&#39;ADN en silico telle qu&#39;il y ait un chevauchement de 50 pb entre chaque pièce lors de la commande des amorces pour PCR. Il est possible d&#39;utiliser le chevauchement de 50 pb comme amorces: 25 paires de bases respectivement. <ol><li> Assurez-vous de garder une trace de l&#39;origine de chacun des morceaux de séquence. Est-il aussi: un plasmide d&#39;être cultivées et miniprepped; une séquence linéaire qui peut être utilisé comme matrice de PCR; ou une séquence qui devra êtresynthétisé dans le commerce? Plusieurs entreprises offrent des services de synthèse d&#39;ADN à faible coût pour les fragments &lt;500 pb. Dans ce cas, la TriTag lui-même est 437 pb si il était avantageux de commander le commerce. </li><li> Les meilleurs résultats sont si tous les fragments sont amplifiés par PCR et purifiés à partir de leur ADN matrice. Le marqueur de résistance est un bon endroit pour partager ce grand ADN en deux modèles plus petits qui sont plus facilement amplifié par PCR. </li><li> Restriction enzyme de restriction Dpnl coupe l&#39;ADN méthylé. Si la matrice de PCR était une miniprep à partir de E. coli, le traitement Dpnl va supprimer la matrice d&#39;ADN contaminant. </li></ol></li></ol></li><li> Purifier toutes les séquences d&#39;ADN et éluer séparément dans l&#39;eau, ou du tampon TE EB. <ol><li> vecteur de pores partie 1, ~ 3000 pb (flèches vertes). PCR amplifié et traité Dpnl. </li><li> vecteur de pores partie 2, ~ 3000 pb (flèches noires). PCR amplifié et traité Dpnl. </li><li> TriTag insert, 437 pb (flèches bleues). Commandé le commerce. Resuspend dans le trou DDH 2 O. </li><li> P ENTCUP promoteur, ~ 750 pb (flèches oranges). PCR-amplifié et traité Dpnl. </li></ol></li><li> Mesurer les concentrations de chacun des morceaux d&#39;ADN. But pour 150 ng / ul des morceaux de vecteur. </li><li> Prélever une partie aliquote de l&#39;ensemble mélange Gibson du congélateur et décongeler sur la glace. C&#39;est disponible dans le commerce, mais aussi simple à faire dans le laboratoire 12-14. <ol><li> Il ya deux étapes à cette recette: un mélange maître de 5x visqueux et 15 pi 1,33 aliquotes réaction de taille. Le mélange maître 5x contient: 3 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 300 ul de 1 M de MgCl2, 600 ul de 10 mM de chaque dNTP, 300 ul de 1 M DTT, 1,5 g de PEG-8000, 20 mg de NAD, et le trou DDH 2 O à 6 ml. Préparer 320 aliquotes (18) et de geler tous mais à -20 ° C. La solution sera très visqueux. Étiqueter ces &quot;tampon isotherme 5X&quot; </li><li> Pour celui qui reste (320 pi), ajouter 1,2 pi T5 Exonuclease, 20 pl Phusion Haute-Fidelity ADN polymérase, 160 pi de Taq ADN ligase et 700 pi ddH 2 O. Préparer 15 aliquotes (~ 80) sur la glace dans des tubes PCR et conserver à -20 ° C. </li></ol></li><li> Déterminer les volumes de quantités équimolaires de chacun des fragments. Il ya quelques calculatrices en ligne, y compris Gibthon.org. Il devrait y avoir un total de 5 ul de tous les morceaux d&#39;ADN. Ajoutez-les à la 15 pi Gibson mélanger aliquote. Si cela nécessite des volumes trop petits à la pipette, diluer les fragments d&#39;ADN et / ou d&#39;utiliser plus d&#39;une aliquote. <ol><li> N&#39;oubliez pas de préparer un contrôle de l&#39;ADN du vecteur seul (par exemple, la partie de l&#39;ADN contenant le marqueur de résistance à un antibiotique) et porter au volume avec de l&#39;eau. </li></ol></li><li> Incuber les tubes dans un cycleur thermique à 50-55 ° C pendant 30-60 minutes. Remplacer sur la glace et se transformer en E. coli via choc thermique cellules chimiquement compétentes. Ne pas utiliser des cellules électrocompétentes. La forte concentration en sel et la concentration d&#39;ADN relativement faiblepeut causer des cellules à l&#39;arc. <ol><li> Appliquer tous les 20 pi à une préparation commerciale de 200 pi du chlorure de calcium E. compétente coli. Incuber sur de la glace 30 min et 60 sec choc thermique à 42 ° C </li><li> Retour à la glace 2 min, appliquer 750 pi SOC ou milieu LB et récupérer secouant dans un tube à centrifuger 30 min à 37 ° C. Plaque du mélange et des dilutions appropriées sur LB + Kan (ou autre antibiotique approprié). Il peut en résulter fond supérieur (et un nombre plus élevé d&#39;événements de recombinaison non-cibles) que le traditionnel clonage basé ligature, mais il est utile de dépister environ 10 colonies. </li></ol></li><li> Confirmez clone par séquence et stocker une aliquote à -80 ° C </li></ol> 3. Biolistic transfection de tabac avec le pistolet à gènes Il s&#39;agit d&#39;une technique qui est établi dans JoVE 18,19. Étapes et les principales différences sont décrites ci-dessous. <ol><li> Cultivez 50-100 ml E. coli 200 ml ou Agrobacterium. Maxi-prep la culture. Une concentration d&#39;environ 1 500 ng / pl est nécessaire pour continuer. </li><li> Préparer gènes balles d&#39;arme à feu tel que décrit précédemment. Chargez-les dans le pistolet à gènes. </li><li> Pour la transfection de Nicotiana benthamiana tabac tissu feuille épidermique, choisissez une grande feuille près de la base d&#39;une usine de 3 mois. Découpez soigneusement et placez-le côté bas en haut sur des serviettes en papier humide dans une boîte de Petri de 15 cm. </li><li> Régler la pression Il pour le pistolet à gènes à 200-250 psi. </li><li> Viser soigneusement le pistolet à gènes entre les nervures sur la face inférieure d&#39;une feuille, environ 3-5 cm au-dessus. Relâcher la sécurité et délivrer les particules à la feuille. Chaque puce peut être utilisée deux fois au même endroit sur la feuille. Si l&#39;explosion de la feuille, jeter et recommencer une feuille-il nouveau, c&#39;est une certaine variation dans la feuille ténacité en raison de conditions de croissance tels que l&#39;âge, l&#39;humidité, etc Pour un 12 cm feuille, s&#39;attendre à tenir environ 6 coups. </li><li> Rangez la feuille, couvert avec le haut d&#39;unBoîte de Pétri pendant 2-3 jours en basse lumière sur le banc. </li><li> Examinez la feuille dans un microscope de dissection équipé fluorescence UV, et la recherche de cellules individuelles exprimant la GFP. Disséquer 5-10 sections mm de feuille. </li><li> Plonger la feuille dans une lame de microscope dans des puits profonds sous ~ 200 ul de 0,1% de Triton X-100. Le détergent permet d&#39;éviter les bulles d&#39;air de se former sur la surface, et la glissière de microscope bien profond permet une plus grande surface d&#39;imagerie des tissus. </li></ol> 4. Microscopie confocale de tissus transfectées Ces instructions varient pour chaque instrument, il est donc essentiel de se bien formés. <ol><li> Pour les expériences de détection par fluorescence, réglez le laser d&#39;excitation à 489 nm, et définir les détecteurs photomultiplicateurs à 500-569 nm pour fluorescence de la GFP et de 630 à 700 nm pour la chlorophylle auto-fluorescence. cellules de l&#39;image en utilisant un objectif 40x immersion dans l&#39;eau. </li></ol>

<ol><li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trait+stacking+in+transgenic+crops%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22GM+crops%22%5BJournal%5D)">Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities.</a> GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).</li>
<li>Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+plant+splicing+code%3A+experimental+and+computational+approaches+for+predicting+alternative+splicing+and+splicing+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).</li>
<li>Hickey, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene+regulation+in+plants+by+alternative+splicing+of+a+suicide+exon%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).</li>
<li>Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+in+plants+-+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing in plants - coming of age.</a> Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).</li>
<li>Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+alternative+pre-messenger+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing.</a> Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).</li>
<li>Dinkins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+transcriptional+initiation+sites+and+alternative+5%27-+and+3%27-splice+site+selection+of+the+first+intron+deploys+Arabidopsis+protein+isoaspartyl+methyltransferase2+variants+to+different+subcellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%3A+for+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).</li>
<li>Kebeish, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplastic+photorespiratory+bypass+increases+photosynthesis+and+biomass+production+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).</li>
<li>Maier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Introduction+of+a+Glycolate+Oxidative+Cycle+into+A.+thaliana+Chloroplasts+Leads+to+Growth+Improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+the+isoprenoid+pathway+in+tobacco+by+expressing+the+cytoplasmic+mevalonate+pathway+in+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts.</a> Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).</li>
<li>Sapir-Mir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+localization+of+Arabidopsis+isopentenyl+diphosphate+isomerases+suggests+that+part+of+the+plant+isoprenoid+mevalonic+acid+pathway+is+compartmentalized+to+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).</li>
<li>Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+heterologous+protein+to+multiple+plant+organelles+via+rationally+designed+5%27+mRNA+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags.</a> Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Lowenson, J. D., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+D-aspartyl+residues+in+polypeptides+by+the+erythrocyte+L-isoaspartyl%2FD-aspartyl+protein+methyltransferase.+Implications+for+the+repair+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).</li>
<li>Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+a+camel+through+the+eye+of+a+needle%3A+the+import+of+folded+proteins+by+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell+%2F+under+the+auspices+of+the+European+Cell+Biology+Organization%22%5BJournal%5D)">Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).</li>
<li>Reumann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+Arabidopsis+leaf+peroxisomes+reveals+novel+targeting+peptides%2C+metabolic+pathways%2C+and+defense+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms.</a> The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li>
<li>Hollender, C. A., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+Fluorescence+Complementation+%28BiFC%29+Assay+for+Protein-Protein+Interaction+in+Onion+Cells+Using+the+Helios+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene.</a> (40), (2010).</li>
<li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Dans cette étude, des stratégies simples sont décrits pour la localisation d&#39;une seule protéine transgénique à plusieurs compartiments cellulaires chez les plantes. L&#39;objectif était de concevoir construction qui exprimerait un seul gène dans plus d&#39;un organite dans Nicotiana benthamiana. Les stratégies comprennent la conception rationnelle de constructions à base d&#39;ADN GFP, assemblage Gibson, la livraison des plasmides aux cellules de la feuille avec le pistolet à gènes, et l&#39;observation des...

Ce travail est un projet d&#39;ingénierie / de la biologie synthétique métabolique dans lequel les cellules végétales sont modifiées pour exprimer une protéine rapporteur dans plusieurs organites mais avec une seule construction d&#39;ADN. Une approche pour cibler des protéines à plus d&#39;un emplacement de clonage implique de multiples copies génétiques, chacune contenant un peptide de localisation différente. Chaque copie doit être introduite par retransformation successifs, ou encore, par rétrocroisement transformations simples 1. Il s&#39;agit de clonage supplémentaire, et est limitée par une balise de localisation par terminus. Une autre façon de localiser une protéine à plusieurs endroits à travers l&#39;épissage alternatif 2-5. ARN est transcrit à partir d&#39;un seul gène, mais différentes copies de la transcription sont traitées différemment, souvent dans plus d&#39;un titre par cellule. Cela peut entraîner plus d&#39;un ARN messager dans la cellule transcrit à partir d&#39;un gène unique. Ces différents messengeARN R peut coder pour différentes isoformes de la même protéine, ou dans le cas d&#39;un décalage du cadre, une protéine différente. Bien que l&#39;épissage alternatif ont été décrits dans la littérature depuis de nombreuses années, les mécanismes d&#39;action et de donneur conservée et les sites d&#39;épissage des récepteurs ne sont élucidés, plus récemment, 6. Comme ces sites sont mieux décrites, elles ouvrent des opportunités pour l&#39;ingénierie. ingénieurs métaboliques des plantes sont confrontés à un défi en exprimant une protéine dans plusieurs organites. Pour une protéine qui doit être localisée à plus d&#39;un organite, le mécanicien doit cloner le gène même plusieurs fois, chacune avec une séquence signal séparé le diriger vers l&#39;organite d&#39;intérêt. Pour un gène unique en trois organelles, il s&#39;agit simplement de trois gènes. Mais pour une voie métabolique six gène, cela élargit à 18 gènes, un effort significatif de clonage. Combinaison de plusieurs séquences de localisation en un seul signe de gène, alternativement épisséréduit ificantly cet effort. Par exemple, re-engineering photorespiration 7,8 et la synthèse des isoprénoïdes 9,10 implique à la fois les chloroplastes et les peroxysomes. Dans notre cas, nous avons profité de sites d&#39;épissage comme observé dans un système naturel de Arabidopsis thaliana décrit précédemment 6. Nous rationnelle redessiné la séquence d&#39;ARNm de quitter les sites d&#39;épissage naturels seul, mais placés séquences qui coder chloroplastes ou des balises péroxisome ciblage dans les introns épissés alternativement-(Figure 1). La protéine exprimée peut être ou ne pas avoir une étiquette, selon que le pré-ARNm codé qui a été excisé sous la forme d&#39;un intron (figures 1g et 1h). Pour plus d&#39;informations sur la conception des constructions présentées dans ce travail, s&#39;il vous plaît voir l&#39;article de compagnon 11. Parce que c&#39;est encore un effort significatif de clonage, assemblage Gibson, une nouvelle méthode de clonage des constructions d&#39;ADN, est used dans la construction. Procédé Gibson peut être utilisée pour n&#39;importe quelle séquence, indépendamment de sites de restriction (figure 2) de 12 à 14. La composition précise des enzymes permet en une seule étape, l&#39;assemblage isotherme. Dans ce procédé, plusieurs parties linéaires à double brin d&#39;ADN ont été conçus de telle sorte qu&#39;ils ont des séquences chevauchantes de ~ 50 bp. L&#39;ensemble de mélange d&#39;enzymes Gibson digère partiellement les parties d&#39;ADN linéaires, exposant simples brins de séquences homologues. Ces séquences simple brin partiels sont à nouveau recuit dans le mélange réactionnel, résultant en une seule étape, indépendante de la séquence, la réaction de ligature sous-clonage libre-rapide. Ce travail décrit une) conception rationnelle constructions épissage alternatif pour l&#39;expression dans les chloroplastes des plantes, les peroxysomes, et cytosols, 2) leur clonage en utilisant le nouveau procédé d&#39;assemblage Gibson libre ligature, 3) leur livraison dans les cellules de la feuille de tabac avec le pistolet à gènes, et 4) des résultats montrant ciblage organite, comme observé avec la GFPet microscopie confocale.

<table><tbody><tr><td>Amorces d’oligonucléotides</td><td>IDT</td><td>(personnalisé)</td><td>Conçu spécifiquement pour la construction</td></tr><tr><td>GeneBlocks</td><td>IDT</td><td>(personnalisé)</td><td>Oligonucléotides de 500 pb</td></tr><tr><td>Logiciel ApE</td><td>U Utah</td><td>(télécharger)</td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td></tr> <tr><td>MinElute kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Utilisé pour purifier les produits de PCR</td></tr><tr><td>QIAprep spin miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Utilisé pour préparer des quantités de plasmide appropriées au clonage</td></tr><tr><td>Phusion Master Mix avec tampon GC</td><td>NEB</td><td>M0532S</td><td>Utilisé pour amplifier par PCR le gène d’intérêt Mélange de réaction d’assemblage Gibson</td></tr><tr><td></td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Mélange principal des 9 ingrédients suivants</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH7.5</td><td>Teknova</td><td>T1075</td><td>Gibson mix</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>G Biosiences</td><td>82023-086</td><td>Gibson mélange</td></tr><tr><td>de montage dNTP</td><td>mix Fermentas</td><td>R0192</td><td>Gibson mélange de montage</td></tr><tr><td>1 M DTT</td><td>Fermentas</td><td>R0861</td><td>Gibson mélange de montage</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Affymetrix</td><td>19966</td><td>Gibson mélange de montage</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Applichem</td><td>A1124,0005</td><td>Gibson mélange de montage</td></tr><tr><td>T5 exonucléase</td><td>Epicentre</td><td>T5E4111K</td><td>Mélange d’assemblage Gibson</td></tr><tr><td>Phusion polymérase</td><td>NEB</td><td>F530S</td><td>Gibson mélange d’assemblage</td></tr><tr><td>Taq DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0208L</td><td>Gibson mélange</td></tr><tr><td>d’assemblage Gibthon.org</td><td></td><td></td><td>site Web pour simplifier les calculs</td></tr><tr><td>Plasmide PLUS Maxi kit</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td>Utilisé pour préparer l’ADN pour les balles de pistolet</td></tr><tr><td>à gènes Système de pistolet à gènes</td><td>BioRad</td><td>165-2451</td><td>Comprend toutes les pièces nécessaires</td></tr><tr><td>Nicotania benthamiana</td><td>(n/a)</td><td>(n/a)</td><td>Don de Jen Sheen, MGH</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica</td><td>SP5 X MP</td><td>Imagerie des cellules résultantes Lames de</td></tr><tr><td>puits profonds</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>71561-01</td><td>Utilisé pour l’imagerie confocale</td></tr><tr><td>Un éditeur de plasmides (ApE) </td><td>Université de l’Utah </td><td></td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td></tr><tr><td>Gibthon :Calculatrice</td><td></td><td></td><td>de</td> ligature http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</tr></tbody></table>

transient expression des gènes dans le tabac en utilisant assemblée gibson et le gene gun

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Afin de cibler une seule protéine à plusieurs organites intracellulaires, plantes généralement double emploi avec les gènes pertinents, et d&#39;exprimer chaque gène séparément à l&#39;aide des stratégies de réglementation complexes, y compris les promoteurs de différentiels et / ou des séquences de signaux. Ingénieurs métaboliques et les biologistes synthétiques intéressés à cibler les enzymes à un organite particulier sont confrontés à un défi: Pour une protéine qui doit être localisée à plus d&#39;un organite, l&#39;ingénieur doit cloner le gène même plusieurs fois. Ce travail présente une solution à cette stratégie: exploiter l&#39;épissage alternatif de l&#39;ARNm. Cette technique tire parti du chloroplaste établi et des séquences de ciblage de peroxysome et les combine en un seul ARNm qui est épissé de façon alternative. Certains variants d&#39;épissage sont envoyés vers le chloroplaste, les uns pour le peroxysome, et certains au cytosol. Ici, le système est conçu pour les multiples ciblant un organite de l&#39;épissage alternatif. Dans ce travail, la GFP a été prévu pour être exprEssed dans le chloroplaste, cytosol, et peroxysomes par une série d&#39;conçus rationnellement 5 &#39;de l&#39;ARNm des tags. Ces balises ont le potentiel de réduire la quantité de clonage nécessaire lorsque des gènes hétérologues doivent être exprimés en plusieurs organites intracellulaires. Les constructions ont été conçues dans le travail précédent 11, et ont été clones en utilisant Gibson assemblage, un procédé de clonage indépendant de la ligature qui ne nécessite pas d&#39;enzymes de restriction. Les plasmides résultants ont été introduits dans les cellules épidermiques des feuilles de Nicotiana benthamiana avec un protocole Gene Gun modifié. Enfin, les feuilles transformées ont été observées par microscopie confocale.

L&#39;effort de conception est le résultat d&#39;une planification importante. Roman de ce projet est l&#39;utilisation de l&#39;épissage alternatif de créer un pré-ARNm qui est traduit en protéines exprimées de façon différentielle. Ces protéines sont exprimées dans différents organelles, dans ce cas, le chloroplaste, des peroxysomes et / ou cytosol. Nous avons adapté gène d&#39;Arabidopsis naturel qui est épissage alternatif 6, et placé chloroplaste 6 et 17 peroxysomes connus ...

Ce travail décrit un nouveau procédé pour cibler sélectivement des organelles sous-cellulaires dans les plantes, dosés par la BioRad Gene Gun.

Transient expression des gènes dans le tabac en utilisant Assemblée Gibson et le Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'observer l'expression transitoire d'un gène rapporteur marqué par une GFP dans les cellules épidermiques de feuille de tabac. Cela est réalisé en concevant d'abord un construct d'ADN qui sera exprimé dans les chloroplastes et les peroxysomes. Le construct est ensuite assemblé par amplification en chaîne par polymérase (PCR) et assemblage Gibson.Ensuite, un canon à gènes est utilisé pour délivrer le construct à des cellules épidermiques de feuille de tabac. En fin de compte, l'imagerie de la feuille de tabac par microscopie confocale révèle l'expression de la GFP dans le chloroplaste et le peroxysome. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le clonage classique, est qu'elle ne nécessite pas d'enzymes de restriction, et par conséquent, toute séquence pouvant être amplifiée par PCR peut être clonée.En raison de la souplesse de la conception génétique, les applications de ces techniques s'étendent à une échelle plus grande. L'ingénierie génétique des plantes agricoles commence ce protocole en déterminant les sites au sein de la cellule végétale destinés à l'expression finale de la protéin

transient-gene-expression-tobacco-using-gibson-assembly-gene

Research

Recherche

JoVE Journal

Environment

Environnement

Description d'une induite par le virus gene silencing (VIGS) méthode pour le knock-down de l'expression génique dans...

Induite par le virus Gene Silencing (VIGS) dans Nicotiana benthamiana Et aux tomates

Nous présentons le protocole détaillé pour Agrobacterium induite par le virus du gène taire (VIGS) de dosage dans le coton. Le virus du rattle (VRT) vecteurs dérivés VIGS ont été déployés pour inciter RNA silencing de coton GrCLA1, alterados Cloroplastos une gène. Le phénotype albinos causés par faire taire GrCLA1 ​​a été observée au stade plantule dans les 2 semaines après l'inoculation.

Agrobacterium induite par le virus Assay Gene Silencing En Coton

Les plantes offrent un nouveau système pour la production de protéines pharmaceutiques à l'échelle commerciale qui est plus évolutive, rentable et sûre de paradigmes d'expression actuels. Dans cette étude, nous présentons une approche simple et pratique, mais évolutive pour introduire du gène cible...

Agroinfiltration efficace des plantes pour l&#39;expression transitoire de haut niveau de protéines recombinantes

Induite par le virus gene silencing est un outil utile pour identifier les gènes impliqués dans la résistance non hôte des plantes. Nous démontrons l'utilisation d'agents pathogènes bactériens exprimant GFPuv dans l'identification des gènes des plantes silencieux sensibles aux pathogènes non hôtes. Cette approche est simple, rapide et facilite le dépistage à grande échelle et un protocole similaire peut être appliquée à l'étude de divers autres interactions plantes-microorganismes.

VIGS-Mediated dépistage génétique avant pour l&#39;identification des gènes impliqués dans la résistance non hôte

La production de protéines dans les plantes de Nicotiana transitoire basée sur l'infiltration sous vide avec Agrobacteria transportait des vecteurs de lancement (virus de la mosaïque à base de tabac) est une approche rapide et économique pour produire des antigènes de vaccins et de protéines thérapeutiques. Nous avons simplifié la procédure et amélioré l'accumulation de cible en optimisant les conditions de culture de bactéries, la sélection des espèces hôtes, et co-introduction de RNA...

Optimisation et l&#39;utilisation des<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Médiée par la production de protéines transitoire dans<em&gt; Nicotiana</em

Nous décrivons une conception de l'approche des expériences qui peuvent être utilisés pour déterminer et modéliser l'influence des éléments de régulation du transgène, les paramètres de croissance et de développement des plantes, et des conditions d'incubation sur l'expression transitoire des anticorps monoclonaux et des protéines rapporteurs dans les plantes.

Caractérisation des systèmes complexes à l&#39;aide de la conception des expériences approche: l&#39;expression transitoire de protéines dans le tabac comme une étude de cas

Des plants de tabac ont été utilisés pour produire une cellulase fongique, TrCel5A, par l'intermédiaire d'un système d'expression transitoire. L'expression peut être contrôlée en utilisant une protéine de fusion fluorescente, et l'activité de la protéine a été caractérisée post-expression.

Expression de recombinant cellulase Cel5A de<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Dans les usines de tabac

La synthèse de plasmides personnalisés demande beaucoup de temps et de main-d’œuvre. Ce protocole décrit l’utilisation du clonage d’assemblage Gibson pour réduire le travail et la durée de la procédure de clonage d’ADN personnalisé. Le protocole décrit produit également des constructions protéiques marquées fiables pour l’expression des mammifères à un coût similaire au clonage traditionnel de l’ADN par copier-coller.

Génération de vecteurs plasmidiques exprimant des protéines de marquage Flag En vertu du règlement de l&#39;allongement Human Factor-1α promoteur Utilisation Assemblée Gibson

Dans cette étude, l’expression d’une protéine recombinante humaine cible dans différentes plateformes de production a été comparée. Nous nous sommes concentrés sur les cultures traditionnelles à base de fermenteurs et sur les plantes, en décrivant la configuration de chaque système et en mettant en évidence, sur la base des résultats rapportés, les limites et les avantages inhérents à chaque plateforme.

Une analyse comparative des recombinant expression des protéines dans différents bio-usines: bactéries, cellules d&#39;insectes et Plant Systems

Au niveau subcellulaire, les événements de signalisation sont modulés dynamiquement par des signaux développementaux et environnementaux. Nous décrivons ici un protocole qui utilise le système d’expression transitoire du tabac pour surveiller l’interaction dynamique protéine-protéine et pour révéler l’organisation spatiale de la transduction du signal dans les cellules végétales.

Imagerie réorganisation spatiale d&#39;une voie de signalisation MAPK Utilisation du système d&#39;expression transitoire du tabac

L’expression hétérologue transitoire des enzymes biosynthétiques dans les feuilles de Nicotiana benthamiana peut détourner les fournitures endogènes de 2,3-oxidosqualene vers la production de nouveaux produits de haute valeur triterpène. Ici est décrit un protocole détaillé pour la production à l’échelle préparative rapide (5 jours) de triterpènes et analogues utilisant cette plate-forme puissante à base de plantes.

Expression transitoire de Nicotiana Benthamiana quitte pour triterpène Production à l’échelle préparative

Découvrez l'expression transitoire de gènes dans le tabac pour la biologie végétale en utilisant l'assemblage Gibson et le gene gun. Cette méthode permet de cibler les chloroplastes et les peroxysomes sans enzymes de restriction.

Transient expression des gènes dans le tabac en utilisant Assemblée Gibson et le Gene Gun

Explorer plus de vidéos