Génération de Myospheres De CSEh par Reprogrammation épigénétique

L’objectif global de cette procédure est de générer des myosphères. Structures de type EB composées de cellules musculaires squelettiques provenant de cellules souches embryonnaires humaines. Ceci est accompli en reprogrammant les cellules par infection lentivirale de Baf 60 C.La deuxième étape de la procédure consiste à infecter les mêmes cellules avec un deuxième virus, le lentivirus myo D.

Les cellules infectées sont ensuite amenées à former des agrégats semblables à ceux de l’EB pendant cinq jours dans un milieu de culture à base de sérum. Ensuite, le milieu EB est remplacé par un milieu de différenciation libre sérique, et les agrégats sont cultivés pendant deux semaines supplémentaires en myosphères. En fin de compte, l’immunofluorescence est utilisée pour visualiser des sections d’agrégats intégrés à l’OCT.

Le principal avantage de cette technique est la dégénérescence à haut rendement des cellules musculaires squelettiques qui, comme la dérivation des progéniteurs mésenchymateux ou mésodermiques, ne nécessite pas de tri des faits et est donc compatible avec un système culturel tridimensionnel. La veille de l’infection, les cellules souches embryonnaires humaines dans six plaques de puits ajoutent le clonage et le supplément de récupération des cellules souches embryonnaires humaines au milieu à 1000 x pour une concentration finale de deux micromolaires la suivante jour infecter les cellules souches embryonnaires humaines avec un bain à titre élevé 60 CGFP lentivirus. Tout d’abord, dissociez un puits de cellules en une suspension unicellulaire en ajoutant un millilitre de tripes et en incubant la plaque pendant cinq minutes. Ensuite, récupérez et transférez la suspension dans un tube de 15 millilitres.

Ajoutez neuf millilitres du milieu préparé et faites tourner les cellules à 1 200 tr/min pendant cinq minutes en attendant jusqu’à un millilitre de mt. SIR, un. Ajoutez poly brain à six microgrammes par millilitre de concentration finale et le supplément de récupération de cellules souches embryonnaires humaines à deux micromolaires.

Ensuite, remettez les cellules en suspension dans cette solution et transférez-les dans un seul puits d’une plaque de fixation basse à six puits. Ajoutez maintenant le bain concentré 60 C virus à une multiplicité d’infection de 100 millions. Incuber la plaque pendant trois heures avec le virus.

Ensuite, collectez les cellules et divisez-les en deux puits de plaque recouverts de matrigel. Dans chaque plaque, ajoutez deux millilitres de mt, SIR, un avec un supplément de deux micromolaires, puis incubez les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, remplacez le support par un support frais.

Les cellules sembleront s’être déjà agglutinées 48 heures après le début de l’infection. Vérifiez la fluorescence pour évaluer l’efficacité de l’infection. Continuez les changements quotidiens de milieu jusqu’à ce que les cellules soient à 80 % de confluence, puis dissociez les cellules et le virus myo D en cellules en utilisant le même protocole.

Maintenez les cellules infectées avec des changements quotidiens de milieu jusqu’à ce qu’elles atteignent 80 % de confluence la veille de ce point de croissance. Plaque MES sur plaques revêtues de matrigel à 1000 cellules par centimètre carré pour faire passer les cellules infectées vers la plaque ME’S. Le lendemain.

Utilisez le trip ALI pour les dissocier et transférer les cellules dans un tube de 15 millilitres vers les cellules. Ajoutez neuf millilitres de milieu de cellules souches embryonnaires humaines et centrifugez-les. Ajoutez 1 200 tr/min pendant cinq minutes.

Resus, suspendez les cellules granulées dans un nouveau six millilitres de milieu de cellules souches embryonnaires humaines. Retirez maintenant le milieu de deux plaques de mes et ajoutez-y les cellules infectées. Incuber les cellules pendant plusieurs jours.

Une fois, ajoutez 80 % de confluence. Retirez tous les supports et ajoutez un millilitre de collagénase quatre. Ajouter un milligramme par millilitre après cinq minutes de collagénase à 37 degrés Celsius.

Remplacez la collagénase par un millilitre de milieu de cellules souches embryonnaires humaines. Ensuite, sous un microscope de dissection, grattez les colonies à l’aide d’une pointe de pipette de 10 millilitres, transférez les colonies dans un tube de 15 millilitres et laissez-les se déposer. Après trois minutes, retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un milieu de cellules souches embryonnaires humaines.

Ensuite, plaquez les cellules dans un rapport de un à quatre par rapport aux plaques de méthamphétamine. Les cellules infectées doivent être en grand nombre et avoir formé des colonies de bonne qualité pour cette procédure. Retirez le milieu de chaque puits et ajoutez un millilitre de collagénase. Quatre.

Ajoutez un milligramme par millilitre de concentration comme précédemment, et la réaction de collagénase après cinq minutes en la remplaçant par un milieu EB. Et puis utilisez rapidement un microscope pour gratter les colonies. À l’aide d’une pointe de pipette de 10 millilitres, il est possible de dissocier les cellules en petits amas de cellules.

Rassemblez ces agrégats dans un tube de 15 millilitres, et après qu’ils se soient stabilisés pendant environ trois minutes, retirez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans trois millilitres de milieu EB et transférez le tout dans un seul puits d’une plaque de fixation basse à six puits. Incuber cette assiette pendant la nuit du lendemain. Vérifiez-les pour de gros morceaux de colonie.

S’il y en a. Séparez-les en les faisant passer plusieurs fois dans une pipette de cinq millilitres. S’il y a beaucoup de cellules uniques flottantes, recueillir les agrégats par sédimentation et les remplacer par un milieu EB frais.

Remplacez le média tous les deux jours après cinq jours de culture. Collectez les agrégats cellulaires et lavez-les une fois avec deux millilitres de PBS permettant aux cellules de se sédimenter sous une gravité normale. Remplacez ensuite le PBS par trois millilitres de milieu DM et retournez les cellules dans les mêmes puits de plaque au cours des 15 prochains jours de culture.

Remplacez le milieu tous les trois jours. Pendant ce temps, des mésosphères se formeront. Les cellules souches embryonnaires humaines ont été infectées avec un bain de 60 °C portant la fluorescence GFP.

Après 72 heures, les cellules ont été classées avec les faits. Les cellules exprimant BAF 60 C ont été cultivées jusqu’à environ 75 % de fluidité, puis infectées par le lentivirus myo D. L’expression génique exogène a été détectée dans les cellules infectées par PCR quantitative en temps réel.

L’expression et la distribution au niveau des protéines ont été examinées. Ensuite, la GFP correspond à l’expression du baf 60 C, et un anticorps myo D a été utilisé pour vérifier l’expression de myo D. 15 jours après que les cellules souches embryonnaires humaines ont commencé à former des agrégats semblables à ceux de l’EB.

Une partie des myosphères a été incorporée dans un composé OCT et a sectionné la section colorée positive pour les marqueurs de chaîne lourde myogénique et de myosine. À partir du jour 10, il a été possible d’observer une contraction sporadique dans les myosphères. Certaines myosphères ont pris des formes différentes ou inhabituelles, peut-être en raison de la fusion entre les myosphères.

Cette technique fera progresser la recherche dans le domaine de la modélisation et de la thérapie des maladies, car des myosphères peuvent être générées à partir de cellules souches pluripotentes de patients atteints de différents troubles musculaires. Pour cette raison, les myosphères fournissent un modèle d’édition de maladies adapté au nettoyage des médicaments et à la pathogenèse des maladies.