Name: Génération de Myospheres De CSEh par Reprogrammation épigénétique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Découvrez la reprogrammation épigénétique de cellules souches embryonnaires humaines pour générer des myosphères contractiles. Cette méthode permet d'étudier la biologie musculaire et la régénération tissulaire.

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PLP est un chercheur associé du Centre de recherche en santé de Sanford enfants. Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes à PLP: R01AR056712, R01AR052779 et P30 AR061303 de l&#39;Institut national de la santé / Institut national de l&#39;arthrite et de l&#39;appareil locomoteur et de Skin Diseases (NIAMS), MDA et Sanford enfants attribution recherche en santé. Ce travail a en partie bénéficié de financement de la recherche du septième programme-cadre de la Communauté européenne dans le projet FP7-santé - 2009 EndoStem 241440 (activation des cellules du système vasculaire associés souches et les cellules souches musculaires pour la réparation et l&#39;entretien du tissu musculaire) SA a été soutenue par. CIRM bourse.

1. Infection des CSEh Ce protocole nécessite une grande lentivirus de titre codage BAF60C et MyoD 13. Ces constructions sont disponibles sur demande. <ol><li> Recommandations avant de commencer <ol><li> Afin d&#39;assurer une efficacité élevée de l&#39;infection, les CSEh plaque d&#39;infection sur les conditions de libre-alimentation (figure 2A) pour éliminer des concurrents cellulaires au cours de l&#39;absorption virale. En effet, MEF sont notoirement plus facile à infecter par rapport à CSEh et sont compétents pour la conversion de MyoD médiation. Ainsi, l&#39;élimination MEF à partir de cultures de CSEh augmente le taux d&#39;infection. </li><li> Il est recommandé d&#39;avoir des lentivirus à titre élevé pour assurer une haute efficacité d&#39;infection. Options pour améliorer l&#39;efficacité de l&#39;infection sont discutés dans la section &quot;contrôle l&#39;infection&quot;. </li><li> Préparer des plaques de matrigel revêtues en ajoutant 1 ml de 1 mg / ml de Matrigel dans chaque puits et laisser au moins une heure à température ambiante (ou O / N scellé à 4 ° Csi préparé la veille). </li></ol></li><li> procédure d&#39;infection <ol><li> Jour avant l&#39;infection <ol><li> Ajouter hES clonage des cellules et Supplément de récupération dans le milieu à 1000 X dilution (2 mM concentration finale). </li></ol></li><li> Jour 0 - Infection à BAF60C Remarque: Effectuez l&#39;infection de CSEh avec BAF60C premier suivi par une infection avec MyoD. <ol><li> Dissocier un puits d&#39;une plaque de 6 puits hESCs cultivés sous forme de colonies 14 dans une suspension à cellule unique par incubation avec 1 ml de TrypLE pendant 5 min à 37 ° C. </li><li> Transfert suspension dans un tube de 15 ml, ajouter 9 ml de milieu CSEh et centrifuger pendant 5 min à 1200 rpm. </li><li> Pendant la centrifugation, préparer le mélange de l&#39;infection dans un tube propre en ajoutant 1 ml de mTeSR1, polybrene (6 mg / ml) et hES cellulaire Clonage &amp; Recovery supplément (2 mM). </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire (environ 5 x 10 5 -1 × 10 6 cellules provenant d&#39;une confluent bien des CSEh) avec 1 ml de mélange infection et la plaque sur une plaque de fixation 6 et faible, ce qui empêche les cellules d&#39;adhérer au plastique. </li><li> Ajouter BAF60C-IRES-GFP virus à 10 8 MOI et incuber 3 heures dans l&#39;incubateur </li><li> Recueillir la suspension de cellules contenant les virus et répartir également dans deux puits de matrigel revêtu. Ensuite, ajouter 2 ml de cellules Supplément Clonage &amp; Recovery mTeSR1 + hES à chaque puits et laisser O / N dans l&#39;incubateur. </li></ol></li><li> Jour 1 <ol><li> Retirez délicatement le milieu contenant le virus et le remplacer par 2 ml de mTeSR1and hES clonage des cellules et Supplément de récupération. Les cellules vont commencer agglutination comme le montre la figure 2B. </li></ol></li><li> Jour 2 - Infection à MyoD <ol><li> Avant de continuer de vérifier l&#39;état de la fluorescence des cellules sous un microscope à fluorescence pour s&#39;assurer d&#39;avoir un rendement élevé d&#39;infection. Sinon, consultez la section «vérifier infecterion «. </li><li> Si les cellules ont atteint au moins 80% de confluence, procédez comme suit; sinon attendre une journée supplémentaire avant de procéder. </li><li> Retirez le support et ajouter 1 ml de réactif TrypLE à dissocier les cellules. Incuber 5 minutes à 37 ° C. </li><li> Répéter comme from1.2.2.2 décrit - 1.2.2.6 ajoutant virus de MyoD à 10 8 MOI. </li></ol></li><li> Jour 3 <ol><li> Retirez délicatement le milieu contenant le virus et le remplacer par 2 ml de mTeSR1and hES clonage des cellules et Supplément de récupération. </li><li> MEF de plaque sur matrigel revêtus de plaques de 2,5 x 10 5 / cm 2 pour le lendemain pour permettre la propagation des cellules infectées. </li></ol></li><li> Jour 4 <ol><li> Retirez le support et ajouter 1 ml de réactif TrypLE à dissocier les cellules. Incuber 5 minutes à 37 ° C. </li><li> Transférer les cellules dans un tube Falcon de 15 ml, ajouter 9 ml de milieu CSEh et centrifuger pendant 5 min à 1200 rpm. </li><li> Remove le surnageant et remettre en suspension dans 6 ml de milieu CSEh. </li><li> Retirez le support de la plaque de 6 puits contenant MEF et CSEh plaque à 01:02 rapport de division, de distribution 3 ml pour chaque MEF contenant bien. Astuce! Lorsque les colonies atteignent la confluence, certains des puits de cellules MyoD/BAF60C-infected peuvent être congelés dans l&#39;azote liquide comme un stock de réserve. Milieu de congélation comprend 90% de KOSR et 10% de DMSO plus 2 mM hES clonage des cellules et Supplément de récupération. Les puits restants peuvent être ensuite exposés au protocole de différenciation - voir ci-dessous pour la description. Si plusieurs cellules sont nécessaires pour produire plus myospheres, CSEh infectés peuvent se propager comme suit en outre: </li><li> Enlever le milieu et incuber avec 1 ml de 1 mg / ml de collagénase IV pendant 5 min à 37 ° C. </li><li> Retirer la collagénase IV et ajouter 1 ml de milieu de CSEh. </li><li> Sous un microscope de dissection gratter les colonies avec une pointe de 10 ml. </li><li> Ramassez les morceaux de colonisationes dans un tube de 15 ml et permettre aux sédiments pendant 3 min. Ensuite, retirer le surnageant, remettre en suspension dans un milieu CSEh et la plaque sur MEF plaques en utilisant un rapport de 1:4. </li></ol></li></ol></li><li> Vérification de l&#39;infection <ol><li> Alors que la propagation des cellules, il est recommandé de plaquer les cellules infectées dans une plus petite échelle à la récolte pour l&#39;analyse de l&#39;ARN et effectuer une analyse de l&#39;expression des protéines par immunofluorescence afin de vérifier les biomarqueurs qui reflètent la situation biologique correcte à chaque étape (voir résultats représentatifs). Pour les lentivirus de titre élevé, le pourcentage de cellules infectées attendus doit être d&#39;au moins 80%. </li><li> Pour assurer une efficacité élevée, les vecteurs lentiviraux peuvent être modifiées, l&#39;introduction d&#39;un marqueur de sélection de fluorescence et / ou une résistance à un antibiotique. Notre plasmide lentiviral exprimant BAF60C porte également fluorescence de la GFP. </li><li> Tri CSEh pour un marqueur fluorescent. Dans le cas d&#39;une faible efficacité de l&#39;infection est recommandé d&#39;utiliser une fluorescencecellules ctivated de tri (tri par FACS) pour enrichir les cellules exprimant le virus de BAF60C puis infecter les cellules par le virus de titre élevé de MyoD. <ol><li> Ajouter hES clonage des cellules et Supplément de récupération dans le milieu de la journée avant le tri. </li><li> Le jour du tri, dissocier les cellules par TrypLE (comme décrit au jour 0) et remettre en suspension les cellules dans le sérum de remplacement KO, plus hES cellulaire Supplément Clonage &amp; Recovery en FACS-tubes. </li><li> A la fin du tri, de recueillir les cellules KO sérum de remplacement et la plaque sur MEF plaques ajoutant hES clonage des cellules et Supplément de récupération. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. EB-comme induction et différenciation <ol><li> Induction et la différenciation procédure <ol><li> Jour 0 - EB induction <ol><li> Assurez-vous, avant de commencer la différenciation de BAF60C/Myod-infected CSEh, pour avoir un nombre élevé de colonies dans le puits (figure 2C). </li><li> Pour chaque bien remove le milieu, laver avec du PBS et ajouter 1 ml de 1 mg / ml de collagénase IV. Incuber pendant 5 min à 37 ° C. </li><li> Retirer la collagénase et ajouter 1 ml de milieu EB. </li><li> Sous un microscope de dissection rapidement dissocier mécaniquement les colonies en 400-800 agrégats de cellules en grattant avec une pointe de 10 ml. </li><li> Ramassez les morceaux de colonies dans un tube de 15 ml et laisser sédimenter pendant 3 min. Retirer le surnageant, remettre en suspension dans 3 ml de milieu EB et transférer la suspension cellulaire à un puits d&#39;une plaque à 6 puits peu d&#39;attachement. </li></ol></li><li> Jour 1 <ol><li> Vérifiez la taille des colonies et la mort de la cellule avant de poursuivre. Si de gros morceaux sont présents, les briser par un léger pipetage de haut en bas avec une pipette de 5 ml, 3-4 fois. Si la mort cellulaire est très élevé (de nombreuses cellules et les débris flottants) remplacent le milieu par la collecte des agrégats dans un tube de 15 ml par gravité et leur plaque avec 3 ml de milieu EB frais, sinon procédez comme suit. </li><li> Ajouter 1,5ml de milieu EB frais dans les puits </li></ol></li><li> Jour 2 <ol><li> Changer le support en recueillant les agrégats des puits dans un tube de 15 ml. Qu&#39;ils s&#39;installent pendant 2 min. </li><li> Retirer le surnageant, remplacer par 3 ml de milieu EB frais et redistribuer sur les mêmes puits. </li></ol></li><li> Jour 3 <ol><li> Ajouter 1,5 ml de milieu EB frais dans les puits. </li></ol></li><li> Jour 4 <ol><li> Procédez comme décrit dans &quot;Jour 2&quot;. </li></ol></li><li> Jour 5 - la différenciation myogénique des grappes EB-comme (figure 2D). <ol><li> Recueillir les agrégats comme décrit dans 2.1.3.1 et laver une fois avec 2 ml de PBS; permettent l&#39;agrégation de sédiments. </li><li> Retirer du PBS et ajouter 3 ml de milieu de DM; plaque sur les mêmes puits. </li></ol></li><li> Jour 6 - Jour 20 <ol><li> De d6 à d20 remplacer le milieu par du milieu frais tous les 3 jours. Myospheres représentatifs sont présentés dans Figure 2E. </li></ol></li></ol></li><li> Différenciation myosphere Vérification <ol><li> Avant de poursuivre, il est recommandé de vérifier l&#39;efficacité de la différenciation myogénique dans les myospheres en faisant des sections des myospheres noyées dans du composé OCT, comme décrit dans un protocole JoVE précédente 12. Effectuer une coloration par immunofluorescence des marqueurs myogéniques tels que myognenin (clone de F5D, DSHB) et la myosine chaîne lourde (clone de MF20, DSHB) (voir résultats représentatifs). ASTUCE: Pour être réussie avec la coloration pour la myogénine sur des sections EB il est essentiel d&#39;effectuer l&#39;extraction de l&#39;antigène par traitement avec du dodécylsulfate de sodium (SDS) à 0,5% pendant 5 min. En outre, il est possible d&#39;utiliser ce protocole pour la double coloration en utilisant des anticorps F5D et MF20. </li></ol></li></ol> 3. Médias Recettes <ol><li> Moyen ESC DMEM-F12 1 mM de L-glutamine 20% Knockout Serum moyen de remplacement (KOSR) 0,1 mM acides aminés non essentiels (acides aminés non essentiels) 50 U / ml de pénicilline / streptomycine (Pen / Strep) 0,1 mM de bêta-mercaptoéthanol 8 ng / ml de facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF) </li><li> Moyen EB DMEM F12 1 mM de L-glutamine 15% de FBS 5% de sérum de cheval </li><li> milieu de DM DMEF F12 Supplément 1X SON Liquid Media 1X N-2 Complément </li></ol>

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</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Le protocole proposé ici décrit comment générer des grappes en trois dimensions des fibres musculaires contractiles (de myospheres) directement à partir de CSEh. La stratégie proposée a le potentiel sans précédent et extraordinaire pour produire des mini muscles en suspension qui peuvent être utilisées comme une «maladie dans un plat de« modèle pour les deux tests de dépistage et des études sur le développement. En outre, le procédé pour générer des cellules hES de myospheres est simple et ne nécessite aucune étape de tri par FACS au cours de la différenciation, ce qui a généralement un effet négatif sur le rendement en cellules récupérées. Par ailleurs, une procédure de tri au cours de la différenciation serait interférer avec l&#39;agrégation, car il implique une dissociation de l&#39;EB dans des cellules individuelles. La méthode proposée est basée sur la reprogrammation épigénétique de CSEh à des facteurs spécifiques, MyoD et BaAF60C, qui ne sont pas exprimés dans les cellules souches embryonnaires pluripotentes. MyoD et BAF60C fournissent le «noyau» de protéines e complexeà marque le locus génomique de transcription qui procède à activer le programme myogénique squelettique. Les deux facteurs sont délivrés à des cellules par l&#39;intermédiaire d&#39;infections lentivirales et il est donc essentiel d&#39;obtenir une haute efficacité d&#39;infection de ces deux facteurs dans toutes les cellules. Ceci peut être réalisé à l&#39;aide de virus de titre élevé ou des virus dotés de marqueurs de sélection. Les conditions de culture jouent également un rôle important dans l&#39;optimisation de l&#39;étendue de la différenciation myogénique. Nous vous proposons un protocole de différenciation à base de sérum pour la différenciation des cellules hES MyoD/BAF60C exprimant en grappes de précurseurs myogéniques, suivie d&#39;une incubation dans un milieu défini sans sérum (contenant de l&#39;insuline transferrine - STI) pour obtenir une conversion des précurseurs myogéniques en myotubes squelettiques. Cependant, il est possible que d&#39;autres milieux définis peuvent réaliser une différenciation myogénique égale ou meilleure. Une limitation du courant du protocole est qu&#39;il repose sur l&#39;utilisation de sérum bovin foetal, qui contient en outrement de nombreuses protéines et des substances animales, montre des variations de lot à lot. Cela peut entraîner une moindre efficacité ou l&#39;hétérogénéité de conversion myogénique dans myospheres. Fait à noter, toutes les structures EB-comme dérivées de CSEh BAF60/MyoD-expressing ne sont pas myospheres; à savoir, certains sont des agrégats EB-comme entièrement constitués de fibres musculaires. Le nombre de myospheres normalement dérivées de CSEh exprimant BAF60C et MyoD peut varier de 30 à 60% selon les estimations de coloration immunologique sur les sections EB effectuées à la fin du protocole (voir résultats). Une approche possible pour enrichir une boîte de culture pour seulement myospheres serait d&#39;utiliser un journaliste myogénique. Cela faciliterait en rejetant les groupes EB-comme partiellement ou pas différenciées et ne sélectionnant que les myospheres. Enfin, une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents aux exigences temporelles des facteurs introduits serait utile d&#39;améliorer la méthode de livraison. Par exemple, si BAF60C et MyoD ne sont nécessaires que pour shtemps ort à &quot;kick&quot; les cellules dans la bonne direction, les méthodes basées sur la livraison de l&#39;ARNm modifié pourrait être appliquée. En revanche, si les facteurs sont nécessaires pour un temps plus long avant que les cellules exploiter leurs protéines endogènes, une approche épisomique serait recommandé d&#39;éliminer la variabilité et des effets incontrôlés dus à l&#39;intégration dans le génome. Enfin, nous notons qu&#39;il est obligatoire d&#39;exprimer BAF60C avant ou en même temps que MyoD (jamais après) afin de réaliser la conversion de CSEh dans les muscles squelettiques. L&#39;exigence pour l&#39;expression préalable de BAF60C repose vraisemblablement sur ​​son rôle dans la pré-réglage du paysage épigénétique pour une bonne répartition de la chromatine à travers MyoD le génome 6,15. En tant que tel, les futurs protocoles pourraient être améliorées par des composés ou d&#39;autres manipulations qui favorisent l&#39;expression de BAF60C dans les CSEh.

En raison de leur capacité unique d&#39;auto-renouvellement, tout en conservant la pluripotence, les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont considérés comme une ressource inestimable pour la médecine régénérative. Génération des cellules souches repeuplement médiation des muscles malades et les cellules CSEh ou souches pluripotentes induites (iPSC) dérivés des muscles squelettiques pour la modélisation de la maladie in vitro sont des objectifs clés des études visant à identifier les traitements et élucider la pathogenèse de nombreuses maladies neuromusculaires. Cependant, ces études ont été contestées par la résistance de CSEh à convertir en cellules musculaires squelettiques et par le manque d&#39;informations en ce qui concerne la régulation moléculaire de CSEh engagement envers la myogenèse squelettique. En effet, les précédentes tentatives pour générer des progéniteurs musculaires squelettiques de CSEh ont révélé que seul organe embryoïde des descendances (EB) dérivés ou des cellules mésenchymateuses sont compétents pour activer la myogenèse squelettique suivant l&#39;expression ectopique de activateurs de transcription (par exemple,Pax3 ou Myf5) 1-3 ou par exposition à des conditions de culture spécifiques 4-5. Nous avons précédemment montré que le composant SWI / SNF, BAF60C (codée par SMARCD3), est une composante essentielle de la machinerie transcriptionnelle qui permet l&#39;activation de MyoD médiation de spécifique du muscle loci 6. Nous avons récemment découvert que l&#39;absence sélective de cellules hES sur BAF60C confère la résistance à l&#39;activation de MyoD à médiation de la myogenèse squelettique 7 qui est par ailleurs observée dans les cellules somatiques exprimant BAF60C 8-10, un procédé couramment appelé conversion myogénique. Expression forcée de BAF60C permet MyoD pour activer directement la myogenèse squelettique dans les CSEh, des conditions de culture spécifiques, avec BAF60C et MyoD imposant une signature épigénétique qui commet CSEh vers la lignée myogénique 7. Fait à noter, l&#39;analyse protéomique précédente a révélé l&#39;absence sélective de BAF60C, parmi les composants SWI / SNF, dans CES 11. Nous avons utilisé ces connaissances pour imposer un engagement épigénétique des CSEh sur la lignée myogénique, conduisant à la génération d&#39;une population homogène de myoblastes squelettiques pouvant être regroupés pour former contractile en trois dimensions structures (myospheres) que les muscles fonctionnellement imiter miniaturisés squelettiques 7. effet, notre méthode de génération de progéniteurs musculaires squelettiques de CSEh s&#39;appuie sur l&#39;engagement épigénétique de CSEh à la lignée myogénique, qui est phénotypiquement latente jusqu&#39;à ce que les cellules sont exposées à des signaux de différenciation, comme cellule l&#39;agrégation et de la culture en milieu de différenciation (voir protocole spécifique). Cette stratégie permet l&#39;expansion d&#39;une population homogène de cellules hES qui sont épigénétique engagé à lignage musculaire squelettique et adapté à la formation de myospheres contractiles tridimensionnelles qui récapitulent histologiques et des propriétés fonctionnelles du squelettemuscles. Les myospheres fournissent la première preuve de muscles miniaturisés exploitables pour une «maladie dans un plat&quot; modèle de maladies musculaires. Quand elle est générée à partir de dérivées patient CSPi, ces myospheres ont le potentiel pour élucider les questions de développement de longue date et la pathogenèse des maladies rares, en plus d&#39;offrir l&#39;énorme potentiel comme outil de criblage à haut débit de composés thérapeutiques. Nous notons également que l&#39;une lecture immédiate de myosphere analyse pourrait être fournie par immunohistochimie sur coupes, comme décrit dans un protocole de JoVE par Gomes et al. 12

<table><tbody><tr><td>Plaque 6 puits</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de fixation basse 6 puits</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>GFR Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>MEFs (growth arrested)14</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Invitrogen</td><td>15-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>1 mM L-glutamine (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>NEAA (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>ITS Supplément de milieu liquide</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>N2-supplement&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>HS</td><td>Invitrogen</td><td>16050114</td><td></td></tr><tr><td><a href="https://www.stemgent.com/products/193">hES Clonage cellulaire & Supplément de récupération</a></td><td>Stemgent</td><td>01-0014-100</td><td></td></tr><tr><td>bfgf</td><td>Sigma</td><td>4114-TC</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MyoD</td><td>BD Biosciences</td><td>554130</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MyHC</td><td>DSHB</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>Anti-myogénine</td><td>DSHB</td><td>F5D</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de myospheres de cseh par reprogrammation épigénétique

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

La génération d&#39;une population homogène et abondante de cellules musculaires squelettiques à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) est une exigence pour des thérapies à base de cellules et pour une &quot;maladie dans une boîte de&quot; modèle de maladies neuromusculaires humaines. Obstacles majeurs, tels que la faible abondance et l&#39;hétérogénéité de la population d&#39;intérêt, ainsi que l&#39;absence de protocoles pour la formation de structures contractiles trois dimensions, ont limité les applications des cellules souches pour les maladies neuromusculaires. Nous avons un protocole qui permet de surmonter ces limites, par introduction ectopique de facteurs définis dans hESCs - le facteur de détermination de MyoD muscle et SWI / SNF de remodelage de la chromatine BAF60C composant complexe - qui sont en mesure de reprogrammer hESCs dans les cellules musculaires squelettiques. Nous décrivons ici le protocole établi pour générer des myoblastes de CSEh dérivées et promouvoir leur regroupement en structures tridimensionnelles miniaturisés (de myospheres) que les muscles squelettiques miniaturisés fonctionnellement imiter 7 </sup&gt;.

La figure 1A montre un schéma du protocole proposé pour générer myospheres de CSEh. Les étapes essentielles pour contrôler (indiquées par les flèches) sont l&#39;efficacité de l&#39;infection dans hESCs et la conversion dans les myospheres myogénique. Dans nos expériences, nous profitons d&#39;un vecteur lentiviral codant BAF60C qui porte fluorescence de la GFP. Nous infectent généralement les cellules avec BAF60C et FACS sorte 72 heures après l&#39;infection pour enrichir la population exprimant BAF60C. Lorsque les cellules atteignent environ 70-80% de confluence, nous infectent avec MyoD lentivirus. Après la primo-infection qu&#39;il faut normalement deux ou trois jours pour les cellules d&#39;atteindre ce confluence. La figure 1B montre les niveaux des gènes exogènes comme un facteur d&#39;induction par rapport aux cellules hES non infectées d&#39;expression. Figure 1C montre l&#39;expression et la distribution au niveau des facteurs de protéines introduites. BAF60C<html> expression est représentée par la fluorescence de la GFP, tandis que l&#39;expression de MyoD est détecté par immunofluorescence avec un anticorps de MyoD. Nous considérons jour 0 le jour où nous commençons la différenciation des CSEh infectés en agrégats EB-comme. Après 15 jours dans un milieu de DM, une partie des myospheres (généralement un ensemble bien) est noyé dans du composé OCT 12 et sectionné à effectuer immunofluorescence des marqueurs myogéniques pour vérifier l&#39;efficacité de conversion myogénique. Figure 1D montre une coloration représentant pour myogénine et chaîne lourde de myosine dans une différenciation myogénique optimale. Myospheres peuvent avoir des formes différentes ou inhabituelles, peut-être à la suite de la fusion avec de petites myospheres. À partir du jour 10, il est possible d&#39;observer la contraction sporadique dans les myospheres (voir vidéo 1 et 2). 43/51243fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. A) Schéma du protocole utilisé pour la génération de myospheres de CSEh. B) les niveaux d&#39;ARNm des gènes exogènes dans les CSEh infectées par BAF60C et MyoD (H9-BM) suivi par qRT-PCR et exprimée en multiples de l&#39;induction, comme par rapport à moquer CSEh infectés images (H9-ctr). C) immunofluorescence montrant MyoD coloration (rouge) et BAF60C fluorescence (vert) en raison de l&#39;élément IRES-GFP dans le vecteur. D) immunofluorescence réalisée sur myosphere sections colorées pour Myogenin (MYOG ), la chaîne myosine lourd (MyHC) et contre-pour DAPI (voir les détails d&#39;immunofluorescence). La barre d&#39;échelle est de 100 um. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2.jpg" /> Figure 2. Des images représentatives de l&#39;apparence des cellules à différents stades de laprotocole de l&#39;infection (partie I) à la différenciation (partie II). Barre d&#39;échelle est de 100 um. Alors que les structures EB-comme de D1 à D5 sont pour la plupart de forme circulaire (D), myospheres adultes de plus de 15 jours selon le schéma de la figure 1A présente une forme imprévisible et sont hétérogènes dans la culture; voir deux exemples E et F.

Ici, nous décrivons un protocole basé sur la reprogrammation épigénétique des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) vers la génération d&#39;une population homogène de progéniteurs musculo-squelettiques, dans des conditions de culture permissive former des amas tridimensionnels de myofibrilles contractiles (les myospheres), qui récapitulent les caractéristiques biologiques de l&#39;homme les muscles squelettiques.

Génération de Myospheres De CSEh par Reprogrammation épigénétique

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

L'objectif général de cette procédure est de générer des sphéroïdes myos, des structures semblables à des corps embryonnaires composées de cellules musculaires squelettiques dérivées de cellules souches embryonnaires humaines. Ceci est réalisé en reprogrammant les cellules par infection lentivirale avec Baf 60 C. La deuxième étape de la procédure consiste à infecter les mêmes cellules avec un second virus, le lentivirus Myo D.Les cellules infectées sont ensuite induites à former des agrégats de type corps embryonnaires pendant cinq jours dans un milieu de culture contenant du sérum. Ensuite, le milieu des corps embryonnaires est remplacé par un milieu de différenciation sans sérum, et les agrégats sont cultivés pendant deux semaines supplémentaires pour former des myosphères. Enfin, l'immunofluorescence est utilisée pour visualiser des sections d'agrégats inclus dans de l'OCT.L'avantage principal de cette technique est la dégénérescence à haut rendement des cellules musculaires squelettiques, qui, tout comme la dérivation à partir de progéniteurs mésenchymateux ou mésodermiques, ne nécessite pas de tri facticiel et est donc compatible avec un système de culture tridimensionnel. La veille de l'infection, ajouter aux cellules souches embryonnaires humaines cultivées dans des plaques à six puits un supplément de clonage et de récupération des cellules souches embryonnaires humaines dans le milieu, à 1000 x pour une concentration finale de deux micromoles. Le lendemain, infecter les cellules souches embryonnaires humaines avec un lentivirus CGFP bath 60 de haut titre. Dissocier d'abord une culture provenant d'un puits en une suspension monocellulaire en ajoutant un millilitre de tripe et en incubant la plaque pendant cinq minutes. Puis recueillir et transférer la suspension dans un tube de 15 millilitres.Ajoutez neuf millilitres du milieu préparé et centrifugez les cellules à 1 200 tr/min pendant cinq minutes, en attendant, dans un millilitre de mt. SIR, un. Ajoutez du polybrain à une concentration finale de six microgrammes par millilitre et le supplément de récupération des cellules souches embryonnaires humaines à deux micromolaires.Ensuite, resuspendre les cellules dans cette solution et les transférer dans un seul puits d'une plaque à six puits à faible adhérence. Ajouter maintenant le virus bath 60 C concentré à une multiplicité d'infection de 100 millions. Incuber la plaque pendant trois heures avec le virus.Ensuite, récupérez les cellules et répartissez-les dans deux puits de plaque recouverts de Matrigel. Ajoutez à chaque puits deux millilitres de milieu mt, SIR, l'un contenant un supplément de deux micromolaire, puis incubez les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le jour suivant, remplacez le milieu par du milieu frais.Les cellules sembleront déjà regroupées 48 heures après le début de l'infection. Vérifiez la fluorescence pour évaluer l'efficacité de l'infection. Poursuivez les changements quotidiens de milieu jusqu'à ce que les cellules atteignent une confluence de 80 %, puis dissociez les cellules et ajoutez le virus myo D aux cellules en utilisant le même protocole.Entretenir les cellules infectées avec des changements de milieu quotidiens jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence de 80 % le jour précédant ce point de croissance. Ensemencer les MES sur des plaques recouvertes de Matrigel à raison de 1000 cellules par centimètre carré pour repiquer les cellules infectées sur la plaque ME'S. Le jour suivant.Utilisez le trip ALI pour les dissocier et transférez les cellules dans un tube de 15 millilitres. Ajoutez neuf millilitres de milieu pour cellules souches embryonnaires humaines et centrifugez-les. Ajoutez 1 200 tr/min pendant cinq minutes.Resuspendez les cellules en culot dans six millilitres frais de milieu pour cellules souches embryonnaires humaines. Retirez maintenant le milieu de deux plaques de mes et ajoutez-y les cellules infectées. Incubez les cellules pendant plusieurs jours.Ajouter une fois, à 80 % de confluence. Retirer tout le milieu et ajouter un millilitre de collagénase IV. Ajouter un milligramme par millilitre après cinq minutes dans la collagénase à 37 degrés Celsius.Remplacez la collagénase par un millilitre de milieu pour cellules souches embryonnaires humaines. Ensuite, sous un microscope stéréo, prélèvez les colonies à l’aide d’une pipette de 10 millilitres, transférez-les dans un tube de 15 millilitres et laissez-les se déposer. Au bout de trois minutes, éliminez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans le milieu pour cellules souches embryonnaires humaines.Ensuite, ensemencez les cellules à un ratio de un à quatre sur des plaques méth. Les cellules infectées doivent être en grand nombre et avoir formé des colonies de bonne qualité pour cette procédure. Retirez le milieu de chaque puits et ajoutez un millilitre de collagénase.Four.Ajoutez une concentration d'un milligramme par millilitre comme précédemment, puis arrêtez la réaction de collagénase après cinq minutes en la remplaçant par du milieu EB. Ensuite, utilisez rapidement un microscope pour prélever les colonies. À l’aide d’une pipette de 10 millilitres, il est possible de dissocier les cellules en petits agrégats cellulaires.Recueillir ces agrégats dans un tube de 15 millilitres, puis après qu'ils se soient déposés pendant environ trois minutes, éliminer le surnageant, resuspendre les cellules dans trois millilitres de milieu EB et transférer le tout dans un seul puits d'une plaque à six puits à faible adhérence. Incuber cette plaque toute la nuit le lendemain. Vérifier la présence de gros agrégats de colonies.S'il y en a, les disperser en les faisant passer plusieurs fois à travers une pipette de cinq millilitres. S'il y a de nombreuses cellules isolées en suspension, recueillir les agrégats par sédimentation et remplacer par du milieu EB frais.Remplacez le milieu tous les deux jours après cinq jours de culture. Récupérez les agrégats cellulaires et rincez-les une fois avec deux millilitres de PBS en laissant les cellules sédimenter sous la gravité normale. Remplacez ensuite le PBS par trois millilitres de milieu DM et remettez les cellules dans les mêmes puits de la plaque pendant les 15 jours suivants de culture.Remplacez le milieu tous les trois jours. Pendant ce temps, des mésosphères se formeront. Des cellules souches embryonnaires humaines ont été infectées avec le bain 60 C porteur de la fluorescence GFP.Après 72 heures, les cellules ont été triées par cytométrie en flux. Les cellules exprimant BAF 60 C ont été cultivées jusqu'à une confluence d'environ 75 %, puis infectées avec un lentivirus myo D. L'expression du gène exogène a été détectée dans les cellules infectées par PCR quantitative en temps réel.L'expression et la distribution au niveau protéique ont été examinées. Le GFP suivant correspond à l'expression de baf 60 C, et un anticorps anti-myo D a été utilisé pour vérifier l'expression de myo D. 15 jours après que les cellules souches embryonnaires humaines ont commencé à former des agrégats de type corps embryonnaires (EB).Une partie des sphères myos a été incluse dans du composé OCT et des sections ont été réalisées ; ces dernières se sont révélées positives pour les marqueurs myogéniques et de la chaîne lourde de la myosine. À partir du jour 10, il a été possible d'observer des contractions sporadiques dans les sphères myos. Certaines sphères myos ont adopté des formes différentes ou inhabituelles, probablement en raison d'une fusion entre sphères myos.Cette technique fera progresser la recherche dans le domaine de la modélisation et du traitement des maladies, car des sphères myogéniques peuvent être générées à partir de cellules souches pluripotentes de patients atteints de divers troubles musculaires. Pour cette raison, les sphères myogéniques fournissent un modèle de maladie pertinent adapté au criblage de médicaments et à l'étude de la pathogenèse des maladies.

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