Name: Organisation hélicoïdale de facteur VIII de coagulation du sang sur les lipides nanotubes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Découvrez la structure du facteur VIII de coagulation organisé sur des nanotubes lipidiques par cryo-microscopie électronique. Cette méthode combine reconstruction 3D hélicoïdale et tomographie pour visualiser l'organisation membranaire.

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Ce travail est soutenu par une subvention de développement national scientifique de l&#39;American Heart Association: 10SDG3500034 et UTMB-BCN fonds de démarrage pour SSM. Les auteurs remercient les installations Cryo-EM et calcul scientifique au Centre de Sealy pour la biologie structurale à l&#39;UTMB ( <a href="http://www.scsb.utmb.edu">www.scsb.utmb.edu</a> ), ainsi que les Drs. Steve Ludtke et Ed Egelman de l&#39;aide avec les algorithmes de reconstruction hélicoïdaux 2D et 3D.

1. Préparation de l&#39;échantillon <ol><li> l&#39;échange de tampon FVIII humain BDD-FVIII porcin et 14 BDD-15 contre du tampon HBS-Ca (20 mM d&#39;HEPES, 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2, pH = 7,4) et on concentre à 1,2 mg / ml. Conserver la solution de protéine à -80 ° C. </li><li> Préparer nanotubes lipidiques (LNT) en mélangeant galactosylcéramide (GC) et la phosphatidylsérine (PS) à 01:04 en poids / poids dans du chloroforme rapport. On évapore le chloroforme sous atmosphère d&#39;argon et de solubiliser les lipides dans un tampon HBS à 1 mg / ml. Conserver la solution de LNT à 4 ° C. </li></ol> 2. Cryo-microscopie électronique de FVIII-LNT <ol><li> Cryo-EM Préparation de l&#39;échantillon <ol><li> Décharge luminescente 300 mesh Quantifoil R2 / 2 grilles de cuivre (côté de carbone jusqu&#39;à) dans un mélange de O 2 et H 2 gaz pendant 10 secondes à 50 W. </li><li> Mélanger les solutions FVIII et LNT dans un tampon HBS-Ca 1:1 w / w rapport et incuber pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Appliquez une goutte de 2,5 piéchantillon de FVIII-LNT à la grille de microscopie électronique hydrophile dans la chambre humidifiée Vitrobot Mark IV (100% d&#39;humidité). </li><li> Blot et flash geler la grille (un blot pour 3.5 sec, la force effacer 1) en liquide C 2 H 6, refroidi par liquide N 2 pour obtenir de la glace amorphe. </li><li> réseaux de magasins dans des boîtes de rangement sous N2 liquide (LN2). </li></ol></li><li> Collecte de données Cryo-EM NOTE: Le JEM2100-LaB6 (année 2010) est équipé d&#39;un système d&#39;exploitation TEMCON constitué d&#39;un ordinateur connecté au microscope électronique, un écran avec des fenêtres de lecture du système de vide, le système d&#39;illumination, HT, les courants de lentille et ainsi en marche, et deux panneaux: gauche et droite, placée de chaque côté de la colonne. Le passage du faisceau X, Y boutons (MAJ Y, Y EIPD) et le multifonctions (DEF / STIG) boutons sont sur les deux tableaux. Sur le panneau de gauche est le bouton d&#39;éclairage (brigthness). Sur le panneau de droite sont: le grossissement (MAG / CAM LONGUEUR) et mise au point (FOCUS) boutons et les trois Imaging (MAG1, MAG2, LOWMAG) et un réseau de diffraction (DIFF) modes boutons. Nous acquérons nos données dans MAG1 à alpha 2. Les conditions minimales de la dose d&#39;illumination (MDS) nécessaires à l&#39;acquisition de données Cryo-EM sont fixés F1 à F6, boutons de la rangée du haut sur le panneau arrière. Dans ce protocole, les paramètres génériques sont utilisés: F1 - lever / abaisser l&#39;écran, F2 - mode de recherche, F3 - Mode FOCUS, F4 - mode PHOTO, F5 - MDS OFF / ON et F6 - BEAM BLANC, utilisé pour protéger l&#39;échantillon de rayonnement endommager en déviant le faisceau. <ol><li> Placez le porte-cryo dans le cryo-poste et remplir le vase de Dewar de la porte et la cryo-poste avec LN2. Lorsque la température atteint -192 ° C, obturateur ouvert sur la pointe de la titulaire, le lieu préalablement congelé grille Cryo-EM dans l&#39;endroit désigné et sûr d&#39;un collier de serrage. </li><li> Insérez le porte-cryo dans le microscope électronique. Remplir le Dewar du porte-cryo et la chambre anti-contaminateur avec LN2. Attendez que le titulaire se stabiliser pendant 30-60 min. Appuyez sur F6 sur ettourner le filament sur. Lorsque le filament est saturée, appuyez sur F6 au large et l&#39;ouverture du volet sur le support pour afficher la grille. </li><li> Appuyez sur Bas Mag / alpha 1 (fixé à 200X mag) et de localiser les zones de glace mince sur la grille. </li><li> Mettez à MAG 1/alpha 2 pour régler la dose minimum de mode (MDS) et l&#39;acquisition de données Cryo-EM à de faibles doses d&#39;électrons, sans endommager l&#39;échantillon. <ol><li> Appuyez sur F2 pour régler le mode de recherche. Réglez l&#39;agrandissement à 40 000 x. Agrandir poutre avec brigtness bouton de dose d&#39;électrons minimale ~ 0,04 e - / A 2 · s. Appuyez sur DIFF pour passer en mode de diffraction. Régler la longueur de l&#39;appareil photo à 120 cm avec bouton MAG / CAM LONGUEUR. Localiser les zones de la grille à l&#39;intérieur des zones pré-sélectionnées dans LOWMAG qui ont des nanotubes lipidiques dans les trous de la couche de carbone. </li><li> Appuyez sur F4 pour passer en mode photo à 40 000 X grossissement et mis en lumière avec LUMINOSITE bouton à des doses de 16-25 e - / 2 · s. Appuyez sur le bouton standard mise au point de fixer les conditions de mise au point le réglage de la hauteur Zde l&#39;échantillon avec les Z touches UP / DOWN (du panneau de commande à droite). Réglez défocalisation entre -1,5 et -2,5 um. </li><li> Alignez RECHERCHE et le mode PHOTO par dessiner un carré dans la fenêtre Live View sur l&#39;écran numérique de l&#39;appareil photo en mode de recherche correspondant à la zone à imager en mode PHOTO. </li><li> Appuyez sur F3 pour régler le mode de mise au point à 100 000 X grossissement. Concentrez-éclairage pour couvrir le capteur CCD (~ 4 - 5 cm de rayon) et hors axe pour ne pas irradier la zone à imager en mode PHOTO. Réglez défocalisation à ~ -1,5 et -2,5 um avec le bouton FOCUS et correcte pour l&#39;astigmatisme de l&#39;image avec les boutons DEF / STIG. </li></ol></li><li> Sélectionnez le FVIII-LNT à imager en mode de recherche par l&#39;acquisition d&#39;images en direct dans la fenêtre Live View sur l&#39;écran de l&#39;appareil photo numérique. Centrez le FVIII-LNT dans le carré dessiné sur la fenêtre de vue en direct. </li><li> Enregistrer une image numérique sur la caméra CCD à 52000 grossissement X efficace et 0,5 exposition sec pour passer en mode photo et en cliquant sur le acquirE bouton sur l&#39;écran de la caméra de micrographie numérique. Les conditions d&#39;acquisition d&#39;image sont définis comme le blanc de faisceau (de VOLETS) ouvert uniquement lorsque l&#39;image est acquise en mode PHOTO. </li><li> Vérifier la qualité et la défocalisation de l&#39;image acquise en appuyant sur CTRL-F pour obtenir une transformée de Fourier rapide (FFT). </li></ol></li></ol> 3. Reconstruction 3D REMARQUE: Le logiciel d&#39;analyse d&#39;images utilisés pour l&#39;analyse 2D et 3D: EMAN2 et IHRSR sont disponibles gratuitement. EMAN2 peuvent être téléchargés à partir de http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install. Le logiciel IHRSR peut être obtenu à partir de professeur Egelman: egelman@virginia.edu. Les améliorations de IHRSR finales sont exécutés sur le Texas Advanced Computing cluster central: http://www.tacc.utexas.edu/ à l&#39;Université du Texas, Austin. L&#39;algorithme de reconstruction 3D montre la figure 1 se compose de deux étapes principales: la sélection d&#39;abord un ensemble homogène de segments hélicoïdaux (particules) avec la référence libre alignme 2Dnt (RFA) des algorithmes mis en oeuvre dans EMAN 2, deuxième réalisation d&#39;une reconstruction 3D à partir des paramètres hélicoïdaux et des algorithmes de rétroprojection incorporés dans IHRSR. La première étape utilise les programmes développés pour la sélection des ensembles de particules homogènes pour la reconstruction 3D avec seule particule SPA (algorithmes) pour lesquels EMAN2 a été spécialement développés et distribués: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Cette étape a été adapté aux données Cryo-EM. La seconde étape est obtenue avec l&#39;algorithme IHRSR, qui est spécifiquement conçu pour le type d&#39;ensembles hélicoïdaux obtenus avec les formes du facteur VIII recombinant. Cet algorithme a été largement documenté dans la littérature scientifique 12. <ol><li> Effectuer l&#39;analyse d&#39;image 2D avec le EMAN2 scientifique bains de traitement d&#39;image: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16 pour sélectionner particule homogène (segment hélicoïdal) des ensembles pour la reconstruction hélicoïdale. <ol><li> Sélectionnez micrographies Cryo-EM avec straight et bien organisé tubes hélicoïdaux avec le logiciel de l&#39;appareil photo numérique et des outils de visualisation. </li><li> Inverser, normaliser et filtrer les pixels rayons X dans l&#39;interface graphique e2workflow.py, la reconstruction de particules unique d&#39;option (SPR): http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager </li><li> Importez les images inversées, normalisées et pixel X-ray filtré dans l&#39;interface graphique de e2helixboxer.py. Sélectionnez tubes hélicoïdaux FVIII-LNT et le segment à 256 x 256 pixels (2,9 Å / pix) avec 90% de chevauchement à l&#39;aide: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer </li><li> Évaluer la défocalisation des micrographies originaux et appliquer contraste fonction de transfert (FCT) de correction (uniquement de correction de phase) pour les segments hélicoïdaux des mêmes micrographies avec l&#39;option e2ctf.py incorporé dans le e2workflow.py: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf. </li><li> Générer des particules initiales (segments hélicoïdaux) définit dans l&#39;interface graphique e2workflow.py option - SPR: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow. </li><li> Calculer des moyennes de classe 2D avec l&#39;algorithme de e2refine2d.py appliquer référence sans classification k-moyenne pour sélectionner les ensembles de données homogènes avec le même LNT de diamètre et le degré de l&#39;ordre hélicoïdale (figure 2), à la suite du script: «e2refine2d.py - iter = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - path = r2d_001 - entrée = INPUT.hdf - NCL = 51 - simcmp = point - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = point - classraligncmp = Phase - classiter = 2 - classkeep = 0,8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = moyenne - normproj-classkeepsig &#39;, en changeant la valeur NCL en conséquence. <ol><li> Classer l&#39;ensemble dans de les LNC = 151 &#39;150 catégories de plus de 8 itérations avec&#39; classkeep = 0,8 &#39;données initiales, ce qui signifie que les particules de moins de 80% de similarité avec la moyenne de la classe sont exclus de la classe donnée. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d </li><li> Fusionner des particules à partir des moyennes de classeavec diffraction hélicoïdale prononcée dans e2display.py pour créer ensemble de données intermédiaire. </li><li> Classer l&#39;ensemble dans de les LNC = 51 &#39;50 catégories de différencier les classes avec le même diamètre et le degré de l&#39;ordre des données intermédiaires. </li><li> Fusionner des particules à partir des classes de même diamètre et le degré de l&#39;ordre dans e2display.py pour créer l&#39;ensemble de données final pour la reconstruction tridimensionnelle: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector. </li></ol></li></ol></li><li> Effectuer reconstruction hélicoïdale avec l&#39;algorithme itératif hélicoïdal réel espace de reconstruction (IHRSR), comme décrit dans Egelman 17, 18. <ol><li> Estimer la hausse, Az (A) de l&#39;hélice FVIII-LNT de Fourier combinée transformer des particules dans l&#39;ensemble de données final. </li><li> Définir l&#39;angle azimutal ΔΦ (º) en exécutant un critère de IHRSR parallèles avec une Az constant, croissant ΔΦ de 576; 60 ° à 5 °. </li><li> Exécutez 100 cycles IHRSR consécutives pour chaque ensemble d&#39;un cylindre sans relief comme un volume initial et les paramètres hélicoïdaux initiales Az et ΔΦ tels que définis au point 3.2.1 des données finales. et 3.2.2. </li><li> Inspectez les derniers volumes de la convergence des paramètres hélicoïdaux et la correspondance entre les moyennes de classe de la classification 2D de l&#39;ensemble de données final et les projections de la reconstruction de IHRSR finale. </li><li> Imposer une symétrie aux reconstructions 3D finale, correspondant à la distribution de l&#39;unité asymétrique observé dans les volumes finaux asymétriques 3D: quatre fois pour le FVIII humain-LNT et 5 fois pour le FVIII porcin-LNT. Exécutez un autre 100 cycles de raffinement, pour une reconstruction finale 3D symétrisé. </li><li> Calculer la courbe de corrélation Fourier Shell pour les deux volumes en séparant d&#39;abord l&#39;ensemble de paires et impaires données correspondantes: «e2proc2d.py &lt;infile&gt; &lt;outfile&gt; - split = 2 &#39;. Ensuite, exécutez 100 IHRSR améliorations consécutives comme décrit au paragraphe 3.2.3. Calculer le FSC des volumes 3D créés à partir des ensembles de données pairs et impairs: «e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc. </li></ol></li><li> Visualisez et Segment volumes FVIII-LNT dans UCSF chimère. </li><li><ol><li> Ouvrez les derniers volumes de l&#39;étape 3.2.5. dans UCSF Chimera et définir le niveau de contour à 0,005 dans le OUTILS&gt; données de volume&gt; option Volume Viewer. </li><li> Dans OUTILS&gt; données de volume&gt; Carte Segment, sélectionnez le volume dans l&#39;onglet PLAN DU SEGMENT et cliquez sur un segment à volume. </li><li> segments du groupe correspondant à une cellule de l&#39;unité en sélectionnant avec CTRL + SHIFT et le groupe de clic. </li><li> Colorer les segments par la cellule de l&#39;unité et l&#39;hélice avec ACTIONS&gt; option de couleur pour souligner les caractéristiques structurelles. </li></ol></li></ol> 4. Tomographie Electron <ol><li> Négativement Stained FVIII-LNT Préparation de l&#39;échantillon <ol> &lt;li&gt; Préparez échantillons FVIII-LNT que pour les expériences Cryo-EM. </li><li> Effluves grille de cuivre à 300 mailles recouverte de carbone (côté vers le haut du carbone) dans un mélange de O 2 et de H 2 gazeux pendant 10 sec à 50 W, comme pour les expériences Cryo-EM. </li><li> Appliquez une goutte de 2,5 pi suspension FVIII-LNT avec 6 nm nanoparticules d&#39;or colloïdal sur la grille, éponger l&#39;excès de liquide et tacher négativement en appliquant 5 pi solution à 1% d&#39;acétate d&#39;uranyle pendant 2 min. Éponger l&#39;excès de liquide et de l&#39;air sec de la grille. </li></ol></li><li> Collecte de données de tomographie électronique <ol><li> Transférer la grille dans le support d&#39;inclinaison unique. </li><li> Transférer le support dans le microscope électronique. </li><li> Collecter automatiquement série d&#39;inclinaison avec le logiciel de SerialEM 19 à 2 ° par incréments sur une plage angulaire de -60 ° à 60 images ° et enregistrer avec une caméra CCD à 52 000 X grossissement efficace, de -6 à -10 um défocalisation et la dose d&#39;électrons de 150 - 170 élémentctrons / Å 2 · s par tomographie. </li></ol></li><li> Electron tomographie reconstruction du FVIII-LNT Remarque: Reconstruire la série inclinée pFVIII-LNT et le facteur VIII humain-LNT acquis en 4.2. avec l&#39;option ETomo du logiciel IMOD suivant le tutoriel: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html <ol><li> En utilisant une fenêtre de terminal, ouvrez la tomographie en 3DMOD. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html. </li><li> Bin la tomographie par 4 avec le IMOD BINVOL commande pour diminuer la taille de la tomographie. </li><li> Choisissez le bon angle pour faire tourner le nanotube lipidique long de l&#39;axe Y dans la tomographie en cellule en utilisant la commande IMOD ROTATEVOL. </li><li> Tournez la tomographie complète avec la commande IMOD ROTATEVOL. </li><li> Recadrer le lipide nanotube choisi, orienté selon l&#39;axe Y avec la commande CLIP REDIMENSIONNER IMOD. </li><li> Ouvrez le sous-tomographie recadrée avec 3DMOD. </li><li> Cliquez sur la tomographie de visualiser l&#39;agencement des molécules de facteur VIII longles tranches dans de l&#39;axe Z et le long de l&#39;axe Y dans le volume sous-tomogramme. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier compétition et ils peuvent être contactés directement en ce qui concerne l&#39;une des procédures publiées dans ce manuscrit.

Dans ce travail, une méthodologie est présentée à la différence entre les deux organisations de protéines hautement homologues membranaires: FVIII humain et porcin auto-assemblée sur des nanotubes lipidiques dans les conditions rencontrées dans le corps humain. Dans la procédure décrite, humain et porcin FVIII sont organisées de façon hélicoïdale avec succès sur des nanotubes de lipides, qui est l&#39;étape la plus critique. La prochaine étape cruciale est de cons...

La coagulation du sang de facteur VIII (FVIII) est une grande glycoprotéine de 2332 acides aminés organisés en six domaines: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. Lors de l&#39;activation de la thrombine FVIII agit comme cofacteur pour le facteur IXa dans le complexe tenase liée à la membrane. La liaison de FVIII activé (FVIIIa) pour FIXa d&#39;une manière à la membrane augmente en fonction FIXa efficacité protéolytique plus de 10 5 fois, ce qui est critique pour l&#39;efficacité de coagulation de sang 4. Malgré le rôle important dans la coagulation FVIII joue et la formation du complexe tenase, la structure de FVIII membranaire fonctionnel est encore à résoudre. Pour y remédier, nanotubes de bicouche lipidique (LNT) riche en phosphatidylsérine (PS), capables de se lier avec une forte affinité FVIII 8, 9 et ressemblant à la surface des plaquettes activées ont été mises au point 10. Organisation hélicoïdale consécutive de FVIII lié à LNT a été prouvé pour être effive pour déterminer la structure de FVIII état ​​liée à la membrane par Cryo-EM 5. Fonctionnalisé LNT sont un système idéal pour étudier la protéine-protéine et des interactions protéine-membrane des protéines associées à la membrane de manière hélicoïdale organisées par cryo-EM 11, 12. Cryo-EM présente l&#39;avantage par rapport aux procédés traditionnels de structure telles que la cristallographie aux rayons X et résonance magnétique nucléaire, que l&#39;échantillon est conservé à la plus proche de l&#39;environnement physiologique (tampon, une membrane, le pH), sans additifs et des isotopes. Dans le cas du FVIII, étude de la structure membranaire avec cette technique est encore plus physiologiquement pertinents, comme la LNT ressemblent beaucoup par la taille, la forme et la composition des pseudopodes des plaquettes activées où les complexes de tenase assemblent in vivo. Les défauts et les carences de la cause FVIII hémophilie A, un trouble de saignement grave qui affecte de 1 à 5000 hommes de la population humaine 4, 6. La plupart des ethérapie éfficace pour l&#39;hémophilie A est l&#39;administration long de la vie du FVIII humain recombinant (facteur VIII humain). Une complication importante de la thérapie FVIII recombinant hémophilie A est le développement d&#39;anticorps inhibiteurs de la forme humaine qui touche environ 30% des patients atteints d&#39;hémophilie A 13. Dans ce cas, le FVIII porcin (pFVIII) concentré est utilisé, en tant que facteur VIII porcin affichages faible réactivité croisée avec des anticorps inhibiteurs contre le FVIII humain et forme des complexes fonctionnels avec FIXa humain 7. Fixant l&#39;organisation liée à la membrane des deux porcine et formes de FVIII humains est important de comprendre la base structurelle de la fonction et les implications pour l&#39;hémostase de sang cofacteur FVIII. Dans cette étude, nous décrivons une combinaison de lipides nanotechnologies, Cryo-EM, et analyse de la structure visant à résoudre l&#39;organisation liée à la membrane de deux formes de FVIII hautement homologues. Les données Cryo-EM présentés et structures 3D pour Porci hélice organiséFVIII humain ne et chargée négativement sur LNT montrent le potentiel de la nanotechnologie proposé comme base pour la détermination de structure et des facteurs FVIII et de complexes dans un environnement de membrane physiologique coagulation liés à la membrane.

<table><tbody><tr><td>JEM2100 avec LaB6</td><td>JEOL Ltd.</td><td>Le JEM-2100</td><td>fonctionnait à 200 kV</td></tr><tr><td>avec le logiciel TEMCON</td><td>JEOL Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gatan626 Porte-cryo-porte</td><td>Gatan, Inc.</td><td>626.DH</td><td>refroidi à -175 &deg ; C</td></tr><tr><td>avec unité de contrôle de température</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caméra CCD Gatan 4K x 4K</td><td>Gatan, Inc.</td><td>US4000</td><td>4 096 x 4 096 pixels à 15 &mu ; Résolution physique m/pixel</td></tr><tr><td>Nettoyeur plasma Solarus Model 950</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grille en cuivre de 300 mailles de 3 mm revêtue de carbone</td><td>Ted Pella</td><td>01821</td><td>nettoyée au plasma pendant 10 secondes sur haute puissance</td></tr><tr><td>Quantifoil R2/2 300 mailles</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>Q225-CR2</td><td>Grilles de Cu de 300 mailles revêtues de carbone avec trous de 2 mm de diamètre.</td></tr><tr><td>Acétate d’uranyle dihydraté</td><td>Ted Pella</td><td>19481</td><td>solution à 1 %,</td></tr><tr><td>céramide de galactosyle</td> filtré <td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td></td><td></td>860546</tr><tr><td>Dioleoyl-sn-glycéro-phospho-L-sérine</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td></td><td></td>840035</tr><tr><td>logiciel EM Micrographie numérique</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td><a href="http://www.gatan.com/DM/">http://www.gatan.com/DM/</a></td></tr><tr><td>EM software EMAN</td><td>téléchargement</td><td></td> gratuit<td><a href="http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/&nbsp ; </a></td></tr><tr><td>EM software Spider</td><td>téléchargement</td><td></td> gratuit<td><a href="http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a></td></tr><tr><td>EM software IHRSR</td><td>téléchargement</td><td></td> gratuit <td>Programmes disponibles auprès de Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/</td></tr> <tr><td>EM software (IMOD)</td><td>téléchargement gratuit</td><td></td><td><a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/">http://bio3d.colorado.edu/imod/&nbsp ; </a></td></tr><tr><td>EM software (SerialEM)</td><td>téléchargement</td><td></td> gratuit<td><a href="ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/">ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/</a></td></tr><tr><td>UCSF-Chimera</td><td>téléchargement</td><td></td> gratuit<td><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</a></td></tr></tbody></table>

organisation hélicoïdale de facteur viii de coagulation du sang sur les lipides nanotubes

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

<html> Cryo-microscopie électronique (cryo-ME) 1 est une approche puissante pour étudier la structure fonctionnelle des protéines et complexes dans un environnement hydraté de l&#39;Etat et de la membrane 2. Le facteur de coagulation VIII (FVIII) 3 est une glycoprotéine du plasma sanguin multi-domaines. Défaut ou l&#39;insuffisance de facteur VIII est la cause pour le type d&#39;hémophilie A - un trouble de saignement grave. Lors de l&#39;activation protéolytique du FVIII se lie à la sérine protéase du facteur IXa sur la membrane plaquettaire chargée négativement, ce qui est essentiel pour la coagulation sanguine normale 4. Malgré le rôle essentiel dans la coagulation FVIII joue, des informations structurelles pour son état ​​membranaire est incomplète 5. Recombinant concentré de facteur VIII est le médicament le plus efficace contre le type de l&#39;hémophilie A et disponibles dans le commerce FVIII peut être exprimée comme humaine ou porcine, les deux complexes fonctionnels formant avec le facteur humain IX 6,7. &quot;&gt; Dans cette étude, nous présentons une combinaison de cryo-microscopie électronique (cryo-ME), lipides nanotechnologie et de la structure d&#39;analyse appliquée pour résoudre la structure de deux formes de FVIII hautement homologues membranaire. Humain et porcin La méthodologie développée dans notre laboratoire d&#39;organiser de manière hélicoïdale les deux formes de FVIII recombinants fonctionnels sur les nanotubes de lipides chargés négativement (LNT) est décrite. Les résultats représentatifs montrent que notre approche est suffisamment sensible pour définir les différences dans l&#39;organisation hélicoïdale entre les deux fortement homologue en séquence (identité de séquence de 86% ) des protéines. protocoles détaillés pour l&#39;organisation hélicoïdale, Cryo-EM et la tomographie électronique (ET) d&#39;acquisition de données sont donnés. bidimensionnel (2D) et en trois dimensions (3D) analyse de la structure appliquées pour obtenir les reconstructions 3D humaine et porcine FVIII-LNT est discutée. Les structures humaines et porcines FVIII-LNT présentés montrent le potentiel de la méthodologie proposée pour Calculate l&#39;organisation fonctionnelle, liée à la membrane de la coagulation sanguine facteur VIII à haute résolution.

FVIII porcin recombinant humain et ont été organisés avec succès en hélice sur chargée négativement unique LNT bicouche, ressemblant à la surface des plaquettes activées. L&#39;organisation hélicoïdale de l&#39;humain et porcin FVIII-LNT était conforme à travers les micrographies numériques collectées (Figure 2). La LNT de contrôle et de l&#39;humain et de tubes hélicoïdaux FVIII-LNT porcine ont été sélectionnés et segmentés avec l&#39;interface graphique de e2helixboxer.py et des ensem...

Nous présentons une combinaison de cryo-microscopie électronique, lipides nanotechnologies, et l&#39;analyse de la structure appliquée pour résoudre la structure membranaire des deux formes de FVIII hautement homologues: les droits et les porcins. La méthodologie développée dans notre laboratoire à organiser de manière hélicoïdale les deux formes de FVIII recombinants fonctionnels sur les nanotubes de lipides chargés négativement (LNT) est décrite.

Organisation hélicoïdale de facteur VIII de coagulation du sang sur les lipides nanotubes

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

L’objectif global de cette procédure est de montrer comment définir la structure d’un hélicoptère de facteur VIII organisé sur des nanotubes lipidiques par cryo-microscopie électronique. Pour ce faire, il organise d’abord le facteur VIII purifié hélicoïdal sur des nanotubes lipidiques et recueille des données de cryomicroscopie électronique à la température de l’azote liquide et à de faibles doses d’électrons. Ensuite, la structure membranaire du facteur VIII est calculée en combinant des particules uniques et des algorithmes de reconstruction 3D hélicoïdale.Ensuite, les données de tomographie électronique sont collectées et la reconstruction 3D est générée. En fin de compte, les structures calculées des nanotubes lipidiques de facteur VIII sont validées en segmentant les volumes 3D et en les comparant aux reconstructions de tomographie. La méthode démontrée peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie structurale et de la coagulation sanguine, telles que quelle est l’organisation membranaire du facteur VIII et comment elle est liée à sa fonction dans la coagulation.Le GM 2100 lab six est équipé d’un système d’exploitation TE con composé d’un ordinateur connecté au microscope électronique. Un écran avec des fenêtres lisant le système d’aspiration, le système d’éclairage, les courants de lentille HT et deux panneaux gauche et droite placés de chaque côté de la colonne, le décalage du faisceau, les boutons XY et les boutons multifonctions ou bâtons sourds sont sur les deux panneaux. Sur le panneau de gauche se trouve le bouton d’éclairage ou de luminosité.Le panneau de droite abrite les boutons de grossissement et de mise au point ainsi que les trois boutons pour l’imagerie mag one, mag two et low mag, et un pour le mode diffraction. Pour ce protocole, acquérez des données en mag un à alpha deux en utilisant les paramètres génériques. Réglez les conditions minimales d’éclairage de dose ou les DMS requises pour l’acquisition de données cryo EM à l’aide des six boutons F1 à F situés sur la rangée supérieure du panneau de droite.Utilisez F1 pour lever ou abaisser l’écran, F deux pour le mode de recherche et F trois pour faire la mise au point. Choisissez F quatre pour le mode photo, F cinq pour désactiver et activer les MDS, et F six pour l’ébauche de faisceau, qui est utilisée pour protéger l’échantillon des dommages causés par les radiations en déviant le faisceau. Après avoir préparé des échantillons cryo EM, selon le protocole de texte, placez le support cryogénique dans la station cryogénique et avec de l’azote liquide, remplissez le faiseur du support et de la station cryogénique.Lorsque la température atteint moins 192 degrés Celsius, ouvrez l’obturateur sur l’extrémité du support, placez la grille cryo EM préalablement congelée à l’endroit désigné et utilisez une pince à anneau pour la fixer. Ensuite, insérez le support cryogénique dans le microscope électronique et utilisez de l’azote liquide pour remplir le faiseur du support cryogénique et la chambre anti-ateur. Une fois que le support s’est stabilisé pendant 30 à 60 minutes, allumez le filament.Lorsque le filament est saturé, appuyez sur F six et ouvrez l’obturateur sur le support. Pour afficher la grille, appuyez sur low mag alpha one et localisez les zones de la grille avec de la glace mince. Passez ensuite en mag un alpha deux pour régler la dose minimale ou le mode MDS et acquérir des données EM cryo à faible dose d’électrons afin de ne pas endommager l’échantillon.Choisissez F deux pour régler le mode de recherche et réglez le grossissement à 40 000 x. Utilisez le bouton de luminosité pour agrandir le faisceau à la dose minimale d’électrons d’environ 0,04 électrons par angström au carré fois seconde. Appuyez ensuite sur diff pour passer en mode diffraction avec le bouton de longueur de la came magnétique.Réglez la longueur de la caméra sur 120 centimètres. Localisez ensuite les zones de la grille qui ont des nanotubes lipidiques dans les trous du film de carbone dans les zones présélectionnées. Ensuite, appuyez sur F quatre pour régler le mode photo à un grossissement de 40 000 x et utilisez le bouton de luminosité pour régler l’éclairage à des doses de 16 à 25 électrons par angström carré fois seconde.Appuyez ensuite sur le bouton de mise au point standard pour régler les conditions de mise au point, en ajustant la hauteur Z de l’échantillon à l’aide des boutons Z haut et bas Réglez la défocalisation entre moins 1,5 et moins 2,5 micromètres. Alignez la recherche et le mode photo en dessinant un carré en mode recherche dans la fenêtre de visualisation en direct sur l’écran de l’appareil photo numérique correspondant à la zone à imager en mode photo, appuyez sur F trois pour régler le mode de mise au point à 100, 000 x grossissement. Ensuite, focalisez l’éclairage pour couvrir la puce CCD et hors axe pour ne pas irradier la zone à imager.En mode photo, ajustez la défocalisation entre moins 1,5 et moins 2,5 micromètres pour corriger l’astigmatisme de l’image si nécessaire. En mode de recherche, sélectionnez les F huit L et T à imager en acquérant des images en direct dans la fenêtre d’affichage en direct sur le centre de l’écran de l’appareil photo numérique, les F huit L et T dans le carré dessiné sur la fenêtre d’affichage en direct. Passez en mode photo et cliquez sur le bouton d’acquisition sur l’écran de l’appareil photo à micrographie numérique.Pour enregistrer une image numérique sur la caméra CCD, appuyez sur CTRL F pour obtenir une transformée de Fourier rapide afin de vérifier la qualité et la défocalisation de l’image acquise. Après avoir utilisé les logiciels gratuits de traitement d’imagerie scientifique Eman two et I-H-R-S-R pour effectuer l’analyse d’images 2D et la reconstruction hélicoïdale selon le protocole texte. Pour visualiser et segmenter les volumes F, huit, L et T, ouvrez les reconstructions 3D finales dans UCSF cera, sélectionnez les outils, la carte de segment de données de volume et, dans l’onglet de carte de segment, sélectionnez le volume et cliquez sur segment pour segmenter les données de volume.Appuyez ensuite sur Ctrl Maj et cliquez sur groupe pour grouper les segments correspondant à une cellule unitaire. Pour mettre en valeur les caractéristiques structurelles, choisissez la couleur des actions pour colorer les segments par cellule unitaire et hélice. Pour collecter les données de tomographie électronique, la grille de microscopie électronique colorée négativement est transférée dans un seul support d’inclinaison avant de transférer le support dans l’inclinaison du microscope électronique.Des séries de facteurs VIII porcins organisés par des alliés sur des nanotubes lipidiques ont été collectées avec le logiciel EM en série. Selon le protocole de texte, le Tom a été reconstruit dans IM et visualisé dans le mod 3D pour diminuer la taille du pour utiliser imad bin Val tobin it de quatre, puis utilisez la commande IM mod rotate vol pour sélectionner l’angle approprié pour faire pivoter le nano tube lipidique le long de l’axe Y et faire pivoter le tommo complet avec la commande de redimensionnement du clip de mod IM recadrer, le nanotube lipidique sélectionné le long de l’axe Y utilise le mod 3D pour ouvrir le sous-tommo recadré. Enfin, cliquez sur le Tommo Graham pour visualiser la disposition des molécules de facteur VII le long des tranches dans l’axe Z et le long de l’axe Y dans le volume sub tomo.Comme le montre ici, des F 8 humains et porcins recombinants ont été organisés avec succès sur des lts bicouches uniques chargés négativement ressemblant à la surface plaquettaire activée. Cette figure montre que l’ordre hélicoïdal des huit F humains et porcins liés à la membrane et de la bicouche lipidique dans les moyennes de classe LNT et LNT 2D du meilleur contrôle et F huit LNT 2D est bien défini et révèle les variations de l’organisation hélicoïdale entre les deux protéines. Ces panneaux représentent les reconstructions 3D initiales pour l’humain et le porcin F huit L et T qui ont été réalisées avec 1000 particules représentatives des ensembles de données finaux humains et porcins F huit L et T ici, les graphiques de corrélation de la coquille foer pour l’homme et le porcin F eight LNT indiquent une résolution de 20,5 angströms à une corrélation de coquille de Fourier égale à 0,5 dans cette figure.Les derniers volumes montrent huit molécules humaines F huit et 10 porcines F huit liées à la membrane organisées autour de l’axe hélicoïdal. Chaque molécule F huit humaine est traduite de 41,2 angströms et pivotée de 42,0 degrés par rapport à la précédente, et chaque molécule F huit porcine est traduite de 35,9 angströms et tournée de 35,2 degrés par rapport à la molécule précédente, ce qui correspond aux paramètres hélicoïdaux des reconstructions 3D finales. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’acquérir des données de cryo-microscopie électronique de protéines brunes membranaires organisées sur des nanotubes lipidiques, et de calculer une structure 3D proche de l’état physiologique.Cette vidéo est un premier pas vers une structure membranaire à haute résolution d’une protéine de coagulation, qui peut être appliquée à d’autres protéines qui fonctionnent dans un environnement lipidique.

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

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Nous rapportons une application intelligente des nanotubes de carbone pour la stabilisation cinétique des particules lipidiques qui contiennent des nanostructures auto-assemblées dans leurs noyaux. La préparation de particules lipidiques nécessite des concentrations plutôt faibles de nanotubes de carbone, ce qui permet leur utilisation dans des applications biomédicales telles que l’administration de médicaments.

Préparation Facile d&#39;intérieur auto-assemblées particules lipides stabilisés par des nanotubes de carbone

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Combiné proche infrarouge imagerie fluorescente et la tomographie par Micro-calculé pour Directement Visualizing cérébrale thromboembolies

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A microfluidique débit Chambre Modèle pour Platelet Transfusion et Hémostase mesures Platelet Déposition et la formation de fibrine en temps réel

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Découvrez la structure du facteur VIII de coagulation organisé sur des nanotubes lipidiques par cryo-microscopie électronique. Cette méthode combine reconstruction 3D hélicoïdale et tomographie pour visualiser l'organisation membranaire.

Organisation hélicoïdale de facteur VIII de coagulation du sang sur les lipides nanotubes

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