Name: En Interrogation in vivo de système nerveux central Translatome par polyribosome fractionnement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Découvrez la fractionnement des polyribosomes pour étudier le translatome du système nerveux central in vivo chez la souris. Cette méthode permet d'isoler l'ARN lié aux ribosomes à partir de faibles quantités de tissu nerveux.

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Ce travail a été soutenu par le Ministère fédéral allemand de l&#39;Éducation et de la Recherche (BMBF), la biologie des systèmes de signalisation dans le cancer (Helmholtz Alliance sur la biologie des systèmes) et le Centre de recherche allemand contre le cancer (DKFZ).

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives institutionnelles du DKFZ. Attention: Afin de prévenir la contamination de RNase échantillons, prendre des précautions de base pour éviter la contamination RNAse et préparer tous les tampons avec de l&#39;eau traitée au DEPC. 1. Préparation de saccharose dégradés <ol><li> Préparer 17,5, 25,6, 33,8, 41,9 et solutions de saccharose 50% (voir le tableau 1). Commencer à préparer des gradients en ajoutant lentement 2 ml d&#39;une solution de saccharose à 50% à la partie inférieure d&#39;un tube d&#39;ultracentrifugation polyallomère. Geler la couche en plaçant les tubes pendant 20 minutes à -80 ° C. </li><li> Ajouter les couches suivantes à réduire les pourcentages de saccharose avec des étapes de congélation entre les deux, de se retrouver à 17,5% de saccharose. Gardez gradients sur la glace pendant plus de solutions de saccharose afin d&#39;éviter la décongélation des couches sous-jacentes. </li><li> Préparer des gradients de saccharose fraîchement un jour avant utilisation et les conserver à 4 ° C. Alternatively préparer gradients à l&#39;avance, conserver à -80 ° C et décongeler à 4 ° C la nuit avant l&#39;expérience. </li></ol> 2. Préparation de tissu (cordon et / ou du cerveau épinière) <ol><li> Anesthésier la souris par une overdose de xylazine et de kétamine en NaCl et perfuser transcardiaque avec 20 ml de sels équilibrée solution de Hank (HBSS) contenant 200 ug / ml CHX ribosomes qui immobilise sur transcripts associés. Confirmez anesthésie appropriée par l&#39;absence de réponse à pincées d&#39;orteil. </li><li> Extrait rapidement les tissus. Ouvrez la dorsale de crâne et extraire le cerveau. Effectuer une laminectomie de l&#39;ensemble thoracique de la colonne vertébrale lombaire et extraire la moelle épinière. Utiliser le cerveau entier (~ 400 mg) ou un morceau de la moelle épinière (~ 90 mg) de 4 cm, respectivement. </li><li> Transfert tissu dans de la glace froide homogénéisation tampon A (voir le tableau 1) (moelle épinière: 1 ml; cerveau: 4 ml) et couper en petits morceaux avec un scalpel propre pour permettre une absorption accrue de cycloheximide. Perform toutes les autres étapes sur la glace. </li><li> Incuber pendant 15 min et homogénéiser le tissu mécaniquement à l&#39;aide d&#39;un homogénéisateur Dounce. Homogénéisation soigneusement contrôlée est nécessaire de veiller à ce que les noyaux restent intacts. Traiter tous les échantillons de la même manière à assurer la comparabilité. Remarque: pour les tissus du cerveau: Broyer le tissu par 5 coups avec un pilon hermétique. Pour les tissus de la moelle épinière: perturber par 5 coups avec un pilon à ajustement lâche, suivie par 5 autres coups d&#39;un pilon avec ajustement serré. </li><li> Prenez aliquotes (400 pi pour le cerveau et 200 pi de la moelle épinière), gel flash et conserver à -80 ° C pour l&#39;isolement de l&#39;ARN total. </li><li> Retirer les noyaux et les cellules sans perturbation et de fragments de tissus par centrifugation à 500 g pendant 10 min à 4 ° C. Centrifugation à faible vitesse empêche la perte des ribosomes. </li><li> Lyse des fragments de membranes dans le surnageant exempt de germes pendant 30 min par ajout de NP-40 et les détergents désoxycholate de sodium (chacun à une concentration finale de 1%). </li></ol><ol><li> Cette étape élimine les composants gras à partir de l&#39;échantillon qui, autrement, masquer le signal dans le profil de polyribosome. Tout d&#39;abord, pré-refroidissement des seaux d&#39;ultracentrifugation et rotor à 4 ° C et préparer 2 M, 1,1 M et 0,9 M solutions de saccharose (voir le tableau 1). </li><li> Mélanger lysat avec un 1,22 volumes de solution 2 M de saccharose et de les transférer dans un tube en polyéthylène d&#39;ultracentrifugation. Remplissez tous les tubes à volume égal de 10 ml avec 1,1 M solution de saccharose, puis recouvrir soigneusement avec 0,9 M solution de saccharose. </li><li> Placer les tubes d&#39;ultracentrifugation dans des seaux d&#39;ultracentrifugation pré-réfrigérés. Centrifuger pendant 3 heures à 100 000 g à 4 ° C. Au cours de ce processus les ribosomes se déposer dans le culot alors que les composants gras flottent et restent dans le surnageant. </li></ol> 4. Gradient de saccharose fractionnement <ol><li> Retirer le surnageant et dissoudre le culot dans un tampon d&#39;homogénéisation B (voir le tableau 1 </strong&gt;). Mesurer l&#39;absorbance à 260 nm pour chaque échantillon en utilisant un appareil équivalent ou Nanodrop et normaliser les quantités à charger en fonction de la valeur d&#39;absorbance. </li><li> Placez gradients de saccharose (préparation est décrite dans une section précédente) dans les seaux d&#39;ultracentrifugation pré-réfrigérés. échantillons soigneusement sur le dessus de la pente de la couche. Ajouter un gradient de saccharose à blanc comme témoin technique. </li><li> Ajuster le poids de chaque godet avec un tampon d&#39;homogénéisation. Centrifuger les échantillons de 1,5 h à 285 000 xg à 4 ° C. </li><li> Commencez à préparer la Isco fractionnement 30 min avant la fin de la centrifugation. Si un autre modèle de colonne de fractionnement est utilisée, suivre le protocole du fabricant. <ol><li> Réglez la sensibilité appropriée (0,2 AUFS pour cerveau ou 0,05 AUFS pour la moelle épinière) pour la lampe UV et l&#39;allumer pour se réchauffer. Assemblez le perceur du tube, connectez via la pompe de roulement à une solution de saccharose à 60% par le perceur de tube. </li><li> Testez la configuration en pompant saccharose (flux rate: 1 ml / min), en particulier s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y ait pas de fuites dans les tuyaux qui va introduire des bulles dans le gradient. </li><li> Fond flan absorption en pompant manuellement tampon à gradient dans le détecteur d&#39;UV et de corriger la ligne de base. </li></ol></li><li> Retirez délicatement les seaux d&#39;ultracentrifugation contenant les gradients de saccharose avec des échantillons sédimentés du rotor et placer sur la glace. Éviter tout heurt des gradients pour éviter la perte de résolution. </li><li> Gradients s&#39;exécuter sur la colonne de fractionnement. Exécutez gradients vides premier à évaluer l&#39;absorption de fond et d&#39;assurer la configuration technique adéquate. <ol><li> Attacher le gradient de détecteur UV et percer le fond du tube avec le dispositif de perçage de tube. Démarrer le pompage de 60% de saccharose, ce qui déplace le gradient vers le haut avec des échantillons sédimentés à travers le détecteur d&#39;UV et dans le compte-gouttes. </li><li> L&#39;absorbance à 260 nm est documentée pour générer le profil d&#39;absorption de l&#39;échantillon, avec des pics indiquant la sédimentationtion des ARNm associés à des sous-unités ribosomiques, monosomes et augmenter par la suite le nombre de ribosomes. </li></ol></li><li> Prélever des échantillons en 20 fractions par le compte-gouttes (600 pi de chacun, en tubes de 2 ml). </li></ol> 5. RNA de fractions individuelles <ol><li> Ajouter 10% SDS à une concentration finale de 1% à chaque fraction et bien mélanger afin de déployer des protéines et dissocier les ribosomes. A ce stade, les échantillons peuvent être congelés à -80 ° C. Selon la question à traiter, les fractions peuvent être regroupées en fonction du profil d&#39;absorbance. </li><li> Isoler l&#39;ARN à l&#39;extraction phénol / chloroforme acide, ce qui supprime également des traces de contamination d&#39;ADN. <ol><li> Ajouter un volume d&#39;acide phénol / chloroforme (préchauffé à la température ambiante) pour chaque échantillon, la chaleur pendant 10 min à 65 ° C et la pression de sortie sous la hotte après. </li><li> Centrifuger les échantillons pendant 20 minutes à 17 000 xg à température ambiante. Soigneusement transférer phase aqueuse à 1.5 mltube. Soyez conscient de l&#39;inversion de phase dans les fractions de saccharose plus denses, où la phase aqueuse peut être au fond après centrifugation. </li><li> Ajouter un volume d&#39;isopropanol, 1/9 d&#39;acétate de sodium en volume (pH 5,2) et 1 ul de chaque échantillon GlycoBlue afin de précipiter l&#39;ARN. Conserver les échantillons au moins 1 h à -80 ° C. </li><li> Centrifuger pendant 30 min à 17 000 xg et 4 ° C. GlycoBlue fournit une visualisation de la pastille. Retirer le surnageant, laver culot une fois avec de la glace froide 80% d&#39;éthanol et de l&#39;air culot sec. Dissoudre le culot dans RNAse eau libre. </li></ol></li><li> Quantifier quantité d&#39;ARN par Nanodrop et analyser l&#39;intégrité de l&#39;ARN par une puce Bioanalyzer. ARN qui est obtenu par le protocole présenté est adapté à tous état de l&#39;art des tests à haut débit, y compris puces à ADN et le séquençage profond. </li></ol>

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Bien polyribosome fractionnement n&#39;est pas une nouvelle technique, il demeure une question particulièrement difficile. Sur la base du matériau d&#39;entrée, l&#39;optimisation substantielle peut être nécessaire. Cela est particulièrement le cas pour les échantillons in vivo dans le SNC, où la quantité de matière est souvent une limitation et gras composants des tissus entravent l&#39;isolement des ARNm de traduction. La plupart des protocoles de fractionnement publiés portent sur ​​des levures ou des lignées de cellules de mammifères, et il existe des protocoles établis pour le cerveau 12,13,14. En revanche, il n&#39;y a pratiquement plus de publications décrivant le fractionnement de la moelle épinière, et les protocoles précédents nécessitent la moelle épinière d&#39;un grand nombre d&#39;animaux à mettre en commun 15. Pour ces raisons, plusieurs modifications essentielles ont été apportées pour adapter le protocole de fractionnement pour les tissus du système nerveux central, y compris la simple moelle épinière de souris. Immobilisation ribosome avec cycloheximide est effectuée pendant la perfusion de l&#39;animal pour éviter la dissociation des ribosomes During le long processus d&#39;extraction de tissu. Par la suite, les ARN polysomique sont extraits d&#39;une manière spécifique afin de maximiser le rendement en polyribosome. Tout d&#39;abord, contrôlée homogénéisation du tissu par douncing, maintient le noyau intact et empêche la contamination de l&#39;ADN. Le noyau est ensuite retiré de manière fiable par centrifugation. La combinaison de détergents NP-40 et le désoxycholate de sodium assure une lyse du réticulum endoplasmique et la libération de ses membranaires associées ribosomes. En outre, les composants absorbant les UV dans la myéline riche lipides masquent les profils de polyribosome. Myéline flottation est donc nécessaire, où les composés denses tels que polyribosomes sont culottées et composés plus légers tels que la myéline flotteur et 16 sont supprimés. Polyribosomes sont ensuite sédimentés sur un gradient de saccharose à 17,5% à 50%. Au lieu de la superposition et le gel manuellement chaque couche de saccharose, des gradients peuvent également être préparés en utilisant un mélangeur à gradient. Extraction d&#39;ARN à partir de fractions à l&#39;aide acide phénol / chloroforme permet DNA pour être enlevée avec un minimum de perte de l&#39;ARN. Cependant, l&#39;inversion de phase peut se produire à des fractions de saccharose denses (ci-dessus fraction 16). Ce protocole offre des avantages sur les autres méthodes classiques qui traitent le niveau de la traduction. Par exemple, à la fois la mesure de phosphorylée S6 (un marqueur de traduction de premier plan) ainsi que l&#39;étiquetage des chaînes naissantes avec des radio-isotopes fournissent des informations sur les niveaux de traduction mondiales mais révèlent peu sur ce qui est spécifiquement en cours de traduction. Polyribosome fractionnement, d&#39;autre part, permet non seulement l&#39;évaluation globale de la traduction, mais également de l&#39;identité de traduction et les ARNm des protéines régulatrices associées. PCR quantitative en temps réel peut être réalisée sur des ARN isolés pour une lecture rapide de ARNm sélectionnés, et les microréseaux et le séquençage de prochaine génération ARN peut être réalisée pour des études larges de génome. Les optimisations présentées ici permettent la technique pour être utilisé avec des quantités minimes de tissus du système nerveux central, donc diminuement le nombre d&#39;animaux nécessaires et améliorer la qualité expérimentale globale en réduisant le temps de traitement des tissus. D&#39;autre part, cette technique ne peut pas distinguer les ribosomes au point mort de ceux traduction. Transcriptions portant ribosomes bloqués seront sédiments dans les fractions lourdes, et cela doit être gardé à l&#39;esprit lors de l&#39;interprétation des données. Il existe des techniques récentes communiquées, à savoir RiboTaq et TRAP, dans laquelle les ribosomes sont étiquetés avec des étiquettes ou des journalistes épitopes respectivement d&#39;une manière spécifique de type cellulaire et ARNm isolé par immunoprécipitation 17,18 associés. Cette technique peut être couplé à polyribosome fractionnement d&#39;offrir une grande résolution lire des populations cellulaires spécifiques. Pied-impression ribosome est une autre technique nouvelle qui implique la digestion de nuclease pour générer des petits fragments, ou «traces», des ARNm qui sont protégées par les ribosomes. Les bibliothèques sont ensuite générés à partir de ces empreintes et séquencés. Cette méthode provIdes une analyse complète du génome spécifique de codon sur la traduction et est en mesure d&#39;identifier les ribosomes bloqués, non-AUG codons et les petits amont cadres de lecture ouverts, qui ne peuvent être atteints par polyribosome fractionnement 19. Cependant, polyribosome fractionnement peut être couplé à un profilage ribosome pour l&#39;isolement des fragments digérés contenant des ribosomes simples, enrichissant ainsi les espèces moléculaires nécessaires à la préparation de bibliothèque dans lequel la pureté élevée de l&#39;échantillon est souvent nécessaire. Pris ensemble, polyribosome fractionnement est une méthode souple et durable avec la signification peut être couplé à diverses applications en aval, y compris des dosages génomiques telles que le séquençage de largeur de la prochaine génération.

L&#39;expression génique est déterminée par l&#39;action combinée de la transcription, la traduction et la stabilité de l&#39;ARNm et des protéines, avec la traduction en gardant l&#39;effet le plus prédominant 1. Il est maintenant évident que chacune de ces étapes est très réglementé. Micro-ARN, la formation de granules d&#39;ARN alternatif, et la polyadénylation cytoplasmique quelques exemples de régulation post-transcriptionnelle de l&#39;expression génique 2,3. Chacun de ces mécanismes découple la transcription de la traduction et influe sur le protéome dans le système biologique d&#39;intérêt. Ainsi, sans surprise, seuls les niveaux d&#39;ARNm sont une lecture imparfaite des niveaux de protéines 4. Protéomique quantitative fournit l&#39;évaluation la plus directe de l&#39;expression génique, mais malgré les progrès récents, il ya encore des limitations considérables sur la sensibilité et la résolution de la séquence de la protéine. Par conséquent, l&#39;adressage translatome, le répertoire des ARNm traduire, offre un excellent compromis entre l&#39;étude de latranscriptome et protéome. Il est plus précis que la transcriptomique en évaluer l&#39;expression finale de gène, et fournit à la fois une couverture plus élevée et la résolution de la séquence de la protéomique. Dans les systèmes de mammifères, la plupart des événements de la traduction commence par l&#39;initiation de cap-dépendante. Un groupe de facteurs d&#39;initiation eucaryote avec la petite sous-unité ribosomique 40S assembler à la coiffe 5 &#39;d&#39;un ARNm. Le complexe balaie ensuite l&#39;ARNm et en atteignant le codon AUG, recrute la grande sous-unité ribosomique 60S pour former un ribosome 80S complets. Le produit de l&#39;étape d&#39;élongation avec le ribosome se déplaçant le long de l&#39;ARNm, avec des facteurs d&#39;élongation aider l&#39;incorporation d&#39;acides aminés à partir des ARNt chargés à la chaîne peptidique naissante. Ribosomes multiples peuvent passer le long d&#39;un seul ARNm simultanément et le nombre de ribosomes associés a été démontré que la corrélation avec le taux de synthèse des protéines 5,6. Cela rend le chargement ribosomique une indication fiable pour translation et permet la séparation de la traduction des ARNm activement sur la base de la vitesse de sédimentation. En plus de la quantification de la traduction des ARNm, des informations de séquence peut être obtenue à identifier des motifs impliqués dans la régulation de la traduction. Aussi ARN des protéines de liaison et d&#39;autres facteurs de traduction peuvent être isolés à partir de différentes fractions, ce qui facilite l&#39;étude et à la découverte de protéines régulatrices associées. Dans le système nerveux, le contrôle traductionnel a été liée à des processus tels que le stockage de l&#39;ARNm, le transport et la synthèse des protéines local. cônes de croissance se sont avérés héberger un pool d&#39;ARNm spécifique localisée distinctes du reste de l&#39;axone 7. En outre, les axones possèdent la capacité de synthétiser localement des protéines 8,9. En conséquence, le contrôle local de la traduction est devenue un sujet crucial de l&#39;étude en neurobiologie. Le potentiel de polyribosome fractionnement pour traiter cela a été illustré dans plusieurs études, dans lequel la technique a été utilisée pourexaminer le guidage axonal dans le développement de la moelle épinière, et a démontré la traduction dépendante de l&#39;activité de BDNF dans le cerveau de 10,11.

<table><tbody><tr><td>Hank' s solution de sels équilibrés</td><td>Gibco</td><td>14170-138</td><td></td></tr><tr><td>Tube, paroi mince, polyallomère, 14 ml, 14 x 95 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>331374</td><td></td></tr><tr><td>Pyrocarbonate de diéthyle&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>mise en garde</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>C7698</td><td>danger</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>avertissement</td></tr><tr><td>Inhibiteur complet de protéase Cocktail Tablets</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Phénylméthanesulfonyle fluorure solution</td><td>Sigma</td><td>93482</td><td>danger</td></tr><tr><td>RNasin Plus Inhibiteur de RNase</td><td>Promega</td><td>N2611</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Roche</td><td>11332473001</td><td>danger</td></tr><tr><td>Désoxycholate de sodium</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>avertissement</td></tr><tr><td>Acide-Phénol :Chloroforme, pH 4,5 (avec IAA, 125:24:1)</td><td>Ambion</td><td>AM9722</td><td>danger</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Équipement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dounce Tissue Moulin, 1 ml/7 ml</td><td>Wheaton</td><td>357538/357542</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW 40 Ti Rotor, seau oscillant, titane, 6 x 14 ml, 40 000 tr/min, 285 000 x&nbsp ; g</td><td>Beckman Coulter</td><td>331302</td><td></td></tr><tr><td>Fractionneur de gradient de densité</td><td>Teledyne Isco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyseur</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

en interrogation in vivo de système nerveux central translatome par polyribosome fractionnement

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Plusieurs processus sont impliqués dans l&#39;expression du gène y compris la transcription, la traduction et la stabilité des ARNm et des protéines. Chacune de ces étapes sont strictement réglementées, affectant la dynamique finales de protéines abondance. Divers mécanismes réglementaires existent à l&#39;étape de traduction, ce qui rend les taux d&#39;ARNm seul un indicateur fiable de l&#39;expression des gènes. En outre, la réglementation locale de la traduction des ARNm a été particulièrement impliquée dans les fonctions neuronales, décalage »translatomics» au centre de l&#39;attention en neurobiologie. La méthode présentée peut être utilisée pour la transcriptomique de pont et de la protéomique. Nous décrivons ici des modifications essentielles à la technique de fractionnement polyribosome, qui interroge le translatome basée sur l&#39;association d&#39;ARNm traduits activement à plusieurs ribosomes et leur sédimentation différentielle dans des gradients de sucrose. Traditionnellement, travailler avec des échantillons in vivo, en particulier de la central Système nerveux central (SNC), s&#39;est avérée difficile en raison des montants limités de matériel et la présence de composants de tissus gras. Pour résoudre ce problème, le protocole décrit est spécifiquement optimisé pour une utilisation avec une quantité minimale de matière CNS, comme en témoigne l&#39;utilisation de simple moelle épinière et le cerveau de souris. En bref, les tissus du système nerveux central sont extraites et ribosomes traduisant sont immobilisés sur des ARNm avec cycloheximide. Myéline flottation est ensuite effectuée pour éliminer les composants riches en lipides. Le fractionnement est effectué sur un gradient de saccharose où les ARNm sont séparés selon leur chargement ribosomique. Fractions isolées sont adaptés à une gamme d&#39;essais en aval, y compris les nouvelles technologies d&#39;analyse du génome entier.

La figure 2 montre les profils de polyribosome représentatifs après fractionnement. Les profils de cerveau et la moelle épinière montrent les courbes d&#39;absorption caractéristiques comme décrit précédemment pour les lignées cellulaires. ARNm liés à de petites sous-unités ribosomiques (40S) de sédiments à des fractions plus légères et apparaissent d&#39;abord comme un pic sur le profil, suivie par la grande sous-unité ribosomique (60S) et monosome (80S) __gVirt_NP_NNS_NNPS&lt;__ ARNm liés. ARNm liés à plusieurs ribosomes sédiments à des fractions plus lourdes, avec des pics plus tard en indiquant l&#39;augmentation du nombre de ribosomes liés. Traduction globale peut être évaluée à partir du profil. A titre d&#39;exemple, le tissu cérébral a une polyribosome supérieur à monosome rapport que le tissu de la moelle épinière, ce qui indique une traduction plus actif. ARN extrait à partir de fractions individuelles ont été évaluées par bioanalyser, montrant la distribution de rARN 18S et 28S. 18S rRNA apparaît plus tôt dans le profil, en conformité avec les petites sous-unités ribosomiques sédimentation dans sucr briquet<html> fractions d&#39;oses. Les rendements typiques d&#39;ARN total sont de 10-20 mg pour le cerveau et 2-4 pg de la moelle épinière. Les rendements d&#39;ARN à partir de fractions individuelles sont jusqu&#39;à 4 pg et 0,8 pg pour le cerveau et la moelle épinière, respectivement, en fonction de la fraction. Un gradient de saccharose flan montre déjà une certaine absorption de fond à 260 nm, en raison de la présence de DTT. Ce fond peut être soustraite au cours de l&#39;analyse des données afin de normaliser les valeurs d&#39;échantillon. traitement EDTA effondré les pics de polyribosome, démontrant le profil de sédimentation est due à la traduction. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. Flux de travail et les applications potentielles de in vivo polyribosome fractionnement.&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> Profils Figure 2. (A) des profils de polyribosome typiques de cerveau et la moelle épinière, à l&#39;évaluation de l&#39;ARN extrait par bioanalyser. (B) de distribution de l&#39;ARNm GAPDH sur fractions par qRT-PCR. (C) polyribosome de gradient vide et le cerveau avec et sans traitement de l&#39;EDTA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> Tampon de gradient 2x </td><td> 30 mM Tris-HCl pH 7,4, 30 mM de MgCl2, 600 mM NaCl, 200 ug / ml de cycloheximide (CHX), 2 mM de dithiothréitol (DTT) </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solution de saccharose de 17,5% </td><td> 8,67 g de saccharose, 25 ml de tampon 2x gradient, jusqu&#39;à 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solution de saccharose de 25,6% </td><td> 12,8 g de sucrose, 25 ml de tampon 2x gradient, jusqu&#39;à 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solution de saccharose de 33,8% </td><td> 16,9 g de sucrose, 25 ml de tampon 2x gradient, jusqu&#39;à 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solution de saccharose de 41,9% </td><td> 20,95 g de saccharose, 25 ml de tampon 2x gradient, jusqu&#39;à 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solution de saccharose à 50% </td><td> 25 g de saccharose, 25 ml de tampon 2x gradient, jusqu&#39;à 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> homogénéisationUn tampon </td><td> 0,25 M de saccharose, 50 mM de Tris / HCl, pH 7,4), 5 mM de MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 200 pg / ml CHX, inhibiteur de la protéase complète 1x Roche, DTT 1 mM, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), 100 U / ml RNAsin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> Solution de saccharose 2M </td><td> 68,4% de saccharose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM de MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 100 pg / ml CHX, inhibiteur de protéase complet 1x Roche, 1 mM de DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 1,1 M solution de saccharose </td><td> 38,5% de saccharose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM de MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 100 pg / ml CHX, inhibiteur de protéase complet 1x Roche, 1 mM de DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 0,9 M solution de saccharose </td><td> 30,8% de saccharose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM de MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 100 pg / ml CHX, inhibiteur de protéase complet 1x Roche, 1 mM de DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> homogenization tampon B </td><td> 0,25 M de saccharose, 50 mM de Tris / HCl, pH 7,4, 5 mM de MgCl2, 25 mM de KCl, 1% de NP-40, le désoxycholate de sodium à 1% </td><td> 200 pg / ml CHX, inhibiteur 1x Roche complète de la protéase, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, 100 U / ml RNAsin </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Liste des tampons et des solutions.

Ce protocole illustre modifications essentielles de polyribosome fractionnement afin d&#39;étudier la translatome de vivo échantillons dans le SNC. Il permet une évaluation globale de la régulation de la traduction et de la transcription par l&#39;isolement et la comparaison de l&#39;ARN total à ribosome fractions d&#39;ARN liés.

En Interrogation in vivo de système nerveux central Translatome par polyribosome fractionnement

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'identifier les ARNm en cours de traduction dans un tissu du SNC primaire. Le protocole commence par l'extraction des tissus pertinents chez la souris en présence de cycloheximide. Cette étape est suivie d'une homogénéisation mécanique et d'une lyse en détergent.Ensuite, une flottaison de la myéline est effectuée afin d'éliminer les composants lipidiques gras des tissus, qui masqueraient les profils de polyribosomes. Le culot, contenant les ribosomes et les ARNm associés, est sédimenté sur un gradient de saccharose pour séparer les ARNm liés aux ribosomes. Le gradient est ensuite fractionné afin d'obtenir un profil de polyribosomes, chaque pic représentant des ARNm associés à un nombre donné de ribosomes ou de sous-unités ribosomiques.Les fractions contenant des polyribosomes sont ensuite purifiées afin d'obtenir de l'ARN pour des applications en aval. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu'elle permet de travailler avec de faibles quantités de tissu du SNC et qu'elle est polyvalente dans ses applications en aval. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l'étude de la traduction dans le système nerveux, telles que les modifications des niveaux de traduction dans différentes conditions, ainsi que le rôle des facteurs régulateurs de la traduction et des motifs de séquence.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car les échantillons de tissu du SNC in vivo sont généralement limités, et les composants atiques présents dans le tissu peuvent masquer les profils de polyribosomes. Pour une souris ayant subi une perfusion transcardiale avec du HBSS contenant du cycloheximide, commencez rapidement l'extraction du tissu. Ouvrez le crâne en position dorsale et retirez le cerveau. Transférez le cerveau dans un tampon A glacé et hachez directement le tissu cérébral.Ensuite, réaliser une laminectomie de la colonne vertébrale thoracique et lombaire. Prélever quatre centimètres de moelle épinière et transférer dans un tampon A glacé sur de la glace. Hacher finement les tissus séparés afin d'augmenter leur absorption de cycloheide, puis incuber sur glace pendant 15 minutes.Ensuite, homogénéiser les tissus à l’aide de l’homogénéisateur descendant afin de garantir l’intégrité des noyaux. Le tissu cérébral nécessite cinq allers-retours avec un piston ajusté ; transférer le tissu filtré dans des tubes. Le tissu de la moelle épinière nécessite cinq allers-retours avec un piston lâche, puis cinq autres allers-retours avec un piston ajusté.Prélève maintenant des aliquotes pour l'isolement de l'ARN total : 200 microlitres de moelle épinière et 400 microlitres de cerveau congelé. Les congeler et les conserver à moins 80 degrés Celsius. Pour éliminer les noyaux, les cellules non lysées et les fragments tissulaires, centrifuger les tissus à 500 G pendant 10 minutes.Recueillir le surnageant contenant le réticulum endoplasmique avec ses ribosomes liés, et éliminer le culot contenant les noyaux. Ensuite, lyser les fragments de membrane du réticulum endoplasmique afin de libérer les ribosomes en ajoutant les détergents NP-40 et dodécylsulfate de sodium, chacun à une concentration finale de 1 %. Laisser les échantillons s'incuber pendant 30 minutes sur de la glace. L'un des défis liés à la manipulation des tissus du système nerveux est que la myéline et d'autres composants riches en lipides interfèrent avec les profils de polysomes maîtres.Afin de résoudre ce problème, il est nécessaire d'introduire le processus de modélisation de la flottaison pour éliminer ces composants avant de commencer. Prérefroidissez les godets et le rotor de l'ultracentrifugeuse à quatre degrés Celsius. Mélangez maintenant les lysats recueillis avec 1,22 volume de saccharose deux molaire.Transférez chaque mélange dans un tube de polyéthylène pour ultracentrifugation et remplissez les tubes jusqu'à 10 millilitres avec du saccharose 1,1 M. Recouvrez ensuite soigneusement les tubes avec du saccharose 0,9 M. Placez maintenant les tubes dans les godets refroidis et équilibrez-les avec le tampon B. Insérez les godets équilibrés dans le rotor refroidi et faites tourner l'ultracentrifugeuse à 100 000 ×g pendant trois heures à 4 °C. Les ribosomes et les ARN sédimenteront sous forme de culot, tandis que les lipides resteront en suspension.Après la centrifugation de flottation de la myéline, retirez le surnageant et dissolvez les culots contenant les ribosomes dans le tampon B. Mesurez ensuite l'absorbance des solutions de ribosomes à 260 nanomètres à l'aide d'un appareil NanoDrop. Estimez les concentrations totales en ARN à partir de ces valeurs. Transférez maintenant les échantillons sur des gradients de saccharose préparés.Veillez à ne pas perturber les gradients et incluez un gradient vide comme témoin. Équilibrez les godets refroidis avec les échantillons comme précédemment. Ensuite, faites tourner la centrifugeuse à 285 000 Gs pendant une heure et demie à quatre degrés Celsius.Pendant que la centrifugeuse tourne, préparez le fractionneur. Réglez d'abord la sensibilité de la lampe UV. Ensuite, fixez le perce-tube au fractionneur et reliez-le par un tube à une bouteille de saccharose à 60 %.Avec une pompe intermédiaire, commencez à pomper le saccharose dans le fractionneur à raison d'un millilitre par minute. Vérifiez la présence de fuites d'air provoquant des bulles et resserrez les joints. Ensuite, pompez manuellement le tampon de gradient dans le détecteur UV afin de régler la ligne de base.Après avoir soigneusement retiré les échantillons de l'ultracentrifugeuse sans les entrechoquer, placez-les dans le fractionneur, puis percez le fond du tube à l’aide du perceur. Commencez à pomper le saccharose à 60 % afin de déplacer le gradient devant le détecteur UV et vers le distributeur de gouttes. Enregistrez le profil d'absorbance à 260 nanomètres.Prélevez 20 fractions à partir du distributeur de gouttes dans des tubes de deux millilitres. Collectez 600 microlitres par fraction, puis procédez au traitement des gradients d'échantillons en ajoutant à chaque fraction du SDS 10 % pour obtenir une concentration finale de 1 % de SDS, et mélangez soigneusement. Isolez ensuite l'ARN à l'aide d'une extraction acide au chloroforme phénylique.Commencez par ajouter un volume de phényl chloroforme acide à température ambiante, puis chauffez les tubes à 65 degrés pendant 10 minutes. Ouvrez soigneusement les flacons sous hotte après le chauffage afin de relâcher la pression. Ensuite, centrifugez les fractions à 17 000 ×g pendant 20 minutes à température ambiante et récupérez la phase aqueuse, qui peut se trouver au-dessus ou au-dessous du saccharose.Ensuite, ajoutez un volume d'isopropanol, un neuvième volume d'acétate de sodium et un microlitre de glyco bleu. Précipitez l'ARN pendant au moins une heure à moins 80 degrés, puis mettez-le en pellet par centrifugation. Lavez ensuite les pellets une fois avec de l'éthanol 80 % refroidi, puis, après avoir reconstitué le pellet d'ARN une nouvelle fois, séchez-les à l'air, redispersivez-les dans de l'eau et procédez à l'analyse en aval.Alternativement, les échantillons peuvent être conservés à moins 80 degrés jusqu'à leur utilisation. Un gradient de saccharose témoin présente une absorption de fond à 260 nanomètres en raison de la présence de DTT. Ce fond peut être soustrait lors de l'analyse des données afin de normaliser les valeurs des échantillons ; les profils obtenus à partir du cerveau et de la moelle épinière montrent des courbes d'absorption caractéristiques : les ARNm liés aux petites sous-unités ribosomiques sédimentent dans les fractions les plus légères, apparaissant en début de profil.Ils sont suivis par la grande sous-unité ribosomique et par les ARNm liés à un seul ribosome ; les ARNm liés à plusieurs ribosomes sédimentent dans des fractions ultérieures. Le traitement des échantillons par l'EDTA a fait disparaître les pics de polyribosomes, démontrant ainsi que le profil de sédimentation était dû à la traduction. Des méthodes supplémentaires telles que Ribot-attack et trap peuvent être associées à cette technique afin de réaliser des études spécifiques selon le type cellulaire sur la traduction.Grâce à ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la neurobiologie pour explorer le rôle de la régulation de la traduction dans le développement neuronal et les maladies. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une fractionnement de polysomes à partir de faibles quantités de tissu du SNC et de purifier l'ARN en vue d'applications ultérieures de votre choix.

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Cet article décrit un protocole pour l'extraction de traduire les ribosomes des cellules eucaryotes. Une fois extraites, les ribosomes sont séparés en monosomes et polyribosomes par fractionnement sur gradient de saccharose pour permettre à différentes populations ribosomique pour être analysé. En tant que tel, cette méthode est le gold standard pour examiner la régulation de la traduction.

Eucaryotes Analyse du profil polyribosome

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Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants<em&gt; In vitro</em&gt; Pour identifier les sites de pause de translation le long d&#39;ARNm

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Isolement des sous-populations de ribosomes subcellulaires basé sur la biotinylation enrichie par éclairage restreinte par peptide peptidique spécifique à la marque de recombinaison

Découvrez la fractionnement des polyribosomes pour étudier le translatome du système nerveux central in vivo chez la souris. Cette méthode permet d'isoler l'ARN lié aux ribosomes à partir de faibles quantités de tissu nerveux.

En Interrogation in vivo de système nerveux central Translatome par polyribosome fractionnement

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