En Interrogation in vivo de système nerveux central Translatome par polyribosome fractionnement

L’objectif global de l’expérience suivante est d’identifier la traduction des ARNm dans le tissu primaire du SNC. Le protocole commence par l’extraction des tissus pertinents de la souris dans le cycloheximide. S’ensuit une homogénéisation mécanique et une lyse dans un détergent.

Ensuite, la flottation de la myéline est effectuée, ce qui élimine les composants lipidiques gras des tissus qui masqueront les profils polyribosomiques. La cuiller, qui contient des ribosomes et des ARNm associés, est sédimentée sur un gradient de saccharose pour séparer les ARNm associés aux ribosomes. Le gradient est ensuite fractionné pour fournir un profil polyribosomique, chaque pic représentant des ARNm associés à un certain nombre de ribosomes ou de sous-unités ribosomiques.

Les fractions contenant des polyribosomes sont ensuite purifiées, obtenant de l’ARN pour des applications en aval. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’elle permet de travailler avec de faibles quantités de tissu du SNC et qu’elle est polyvalente dans ses applications en aval. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l’étude de la traduction dans le système nerveux, telles que les changements dans les niveaux de traduction dans différentes conditions, et le rôle de la traduction, des facteurs régulateurs et des motifs de séquence.

D’une manière générale, les individus novices dans cette méthode auront du mal car les matériaux du SNC in vivo sont généralement limités, et les composants atiques présents dans le tissu peuvent masquer les profils poly ribosomes À une souris qui a été trans cordialement perfusée avec HBSS, avec cyclo Heide, commencer rapidement l’extraction tissulaire. Ouvrez dorsalement le crâne et retirez le cerveau. Transférez le cerveau dans le tampon glacé A et coupez directement le tissu cérébral en dés.

Ensuite, effectuez une laminectomie de la colonne vertébrale thoracique et lombaire. Retirez quatre centimètres de moelle épinière et transférez-les dans un tampon A glacé sur de la glace. Coupez les tissus séparés en dés pour augmenter leur absorption de cyclo-heide, puis incubez sur de la glace pendant 15 minutes.

Ensuite, perturbez les tissus avec l’homogénéisateur de duvet pour vous assurer que les noyaux restent intacts. Le tissu cérébral nécessite cinq coups avec un pilon serré, transférez le tissu du maillage dans des tubes. Le tissu de la moelle épinière nécessite cinq coups avec un pilon lâche, puis cinq autres coups avec un pilon serré.

Maintenant, collectez des aliquotes pour l’isolement total de l’ARN, 200 microlitres de moelle épinière et 400 microlitres de flash cérébral. Congelez-les et conservez-les à moins 80 degrés Celsius. Pour retirer les noyaux sans interruption des fragments de cellules et de tissus, centrifugez les tissus à 500 G pendant 10 minutes.

Prélever le surnageant contenant le réticulum endoplasmique avec ses ribosomes liés, et jeter la pastille contenant les noyaux. Ensuite, lyce les fragments de membrane du réticulum endoplasmique pour libérer les ribosomes en ajoutant des détergents NP 40 et sodium deoxy coate chacun à une concentration finale de 1 %Laissez les échantillons incuber pendant 30 minutes sur de la glace. L’un des défis du travail avec les tissus du système nerveux est que la myéline et d’autres composants riches en lipides sont présents dans les profils de polysomes maîtres.

Afin de résoudre ce problème, le processus de modélisation de la flottation doit être introduit pour retirer ces composants avant de commencer. Pré-refroidissement des godets et du rotor de l’ultracentrifugeuse à quatre degrés Celsius. Mélangez maintenant les lysats collectés avec 1,22 volume de saccharose à deux molaires.

Transférez chaque mélange dans un tube ultracentrifuge en polyéthylène et remplissez les tubes à 10 millilitres avec 1,1 molaire de saccharose. Ensuite, recouvrez soigneusement les tubes de saccharose de 0,9 molaire. Transférez maintenant les tubes dans les godets réfrigérés et équilibrez-les avec le tampon B.Chargez les godets équilibrés dans le rotor réfrigéré et faites fonctionner la centrifugeuse à 100 000 G.Pendant trois heures à quatre degrés Celsius, les ribosomes et les ARN vont se granuler sous les lipides en suspension.

Après le spin de flottation de la myéline, retirez la supranatine et dissolvez les pastilles avec les ribosomes dans le tampon B. Mesurez ensuite l’absorbance des solutions de ribosomes à 260 nanomètres à l’aide d’un appareil NanoDrop. Estimez les concentrations totales d’ARN à l’aide de ces valeurs. Transférez maintenant les échantillons sur du saccharose préparé. Gradients.

Veillez à ne pas perturber les dégradés et à inclure un dégradé vide comme contrôle. Équilibrez les seaux réfrigérés avec les échantillons comme précédemment. Ensuite, faites fonctionner la centrifugeuse à 285 000 G pendant une heure et demie à quatre degrés Celsius.

Pendant que la centrifugeuse tourne, préparez le fractionneur. Tout d’abord, réglez la sensibilité de la lampe UV. Ensuite, fixez le perceur de tube au fractionneur et connectez-le via un tube à une bouteille de 60 % de saccharose.

À l’aide d’une pompe de laminage intermédiaire, commencez à pomper le saccharose dans le fractionneur à raison d’un millilitre par minute. Vérifiez qu’il n’y a pas de fuites d’air qui introduisent des bulles et resserrez ces joints. Ensuite, pompez manuellement le tampon de gradient dans le détecteur UV pour définir la ligne de base.

Après avoir soigneusement déchargé les échantillons de l’ultracentrifugeuse sans aucune secousse, chargez-en un dans le fractionneur, puis percez le fond du tube avec le perceur. Commencez à pomper le saccharose à 60 % pour déplacer le gradient au-delà du détecteur UV et dans le distributeur de gouttes. Enregistrez le profil d’absorbance à 260 nanomètres.

Collectez 20 fractions du distributeur de gouttes dans des tubes de deux millilitres. Prélever 600 microlitres par fraction et procéder au traitement des gradients d’échantillon à chaque fraction à 10 % SDS jusqu’à une concentration finale de 1 % SDS et bien mélanger. Isolez maintenant l’ARN à l’aide d’une extraction acide au phényl chloroforme.

Commencez par ajouter un volume de phénylchloroforme acide à température ambiante, puis chauffez les tubes à 65 degrés pendant 10 minutes. Ouvrez soigneusement les flacons dans une hotte après avoir chauffé pour relâcher la pression. Ensuite, centrifugez les fractions à 17 000 GS pendant 20 minutes à température ambiante et récupérez la phase aqueuse, qui peut être au-dessus ou en dessous du saccharose.

Ensuite, ajoutez un volume d’isopropanol, un neuvième volume d’acétate de sodium et un microlitre de bleu glyco. Faites précipiter l’ARN pendant au moins une heure à moins 80 degrés, puis granulez-le par centrifugation. Ensuite, lavez les granulés une fois avec de l’éthanol réfrigéré à 80 % et après avoir granulé l’ARN, séchez à nouveau les granulés à l’air, mettez-les en suspension dans l’eau et procédez à l’analyse en aval.

Alternativement, les échantillons peuvent être stockés à moins 80 degrés jusqu’à l’utilisation. Un gradient de saccharose à blanc montre une certaine absorption de fond à 260 nanomètres en raison de la présence de TNT. Ce bruit de fond peut être soustrait lors de l’analyse des données afin de normaliser les valeurs des échantillons, les profils du cerveau et de la moelle épinière, l’ARN montrent des courbes d’absorption caractéristiques Les ARNm liés à de petites sous-unités ribosomiques sédimentent à des fractions plus légères arrivant tôt sur le profil.

Ils sont suivis par la grande sous-unité ribosomique et les ARNm mono-liés, les ARNm liés à plusieurs ribosomes sédimentent à des fractions ultérieures. Le traitement des échantillons avec de l’EDTA a permis d’effondrer les pics de polyribosomes, démontrant que le profil de sédimentation était dû à la traduction. Des méthodes supplémentaires telles que l’attaque Ribot et le piège peuvent être couplées à cette technique afin d’effectuer des études spécifiques au type de cellule sur la traduction.

Après ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la neurobiologie pour explorer le rôle de la régulation de la traduction dans le développement des neurones et des maladies. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer le fractionnement des polysomes à partir de faibles quantités de tissu du SNC et de purifier l’ARN pour les applications ultérieures en aval de votre choix.