Faisant preuve d'une multi-résistante Mycobacterium tuberculosis Amplification de puces à ADN

L’objectif global de l’expérience suivante est de génotyper une microbacterium tuberculose multirésistante aux médicaments, à l’aide d’une puce à amplification. Ceci est réalisé en effectuant une PCR asymétrique multiplex sur le dessus d’une micropuce à l’intérieur d’une seule chambre de réaction microfluidique. Là, l’échantillon est simultanément amplifié, la taille étiquetée sélectionnée, rendue simple brin et hybridée à la puce.

Ensuite, après avoir lavé la puce à micropuce, un lecteur indique si Microbacterium tuberculosis est présent et s’il contient une mutation de l’ADN connue pour conférer une résistance à la rifampicine iso, au niazi éthambutol ou à la streptomycine. L’avantage de cette méthode par rapport aux méthodes existantes de sonde linéaire ou d’hybridation d’acides nucléiques est qu’une puce à amplification simplifie considérablement l’interaction de l’utilisateur avec le test. Néanmoins, tout en offrant la sensibilité analytique de la PCR et la capacité de multiplexage d’une puce à ADN Pour cette procédure, ayez un espace de travail propre essuyé avec une solution de décontamination et ayez des acides nucléiques suffisamment purs pour la PCR multiplexe.

Après avoir décongelé et mélangé toutes les solutions mères, assemblez le mélange maître PCR. Lors de la préparation de ce mélange, préparez au moins un volume supplémentaire de mélange pour le test de tuberculose illustré ici. Ajoutez également de la T polymérase supplémentaire au mélange principal.

En plus de la quantité d’adhérence fournie avec les réactifs de base, un microlitre d’aliquotes d’ADN de l’échantillon pour 49 microlitres de mélange maître. Ajoutez soigneusement 48 microlitres de chaque mélange réactionnel au centre de la puce appropriée. Ne touchez pas la puce elle-même.

Ensuite, couvrez soigneusement et scellez la puce de manière incorrecte. L’application de la lamelle peut introduire des bulles qui peuvent entraîner des artefacts, une évaporation, une mauvaise amplification ou une hybridation non uniforme. N’importe laquelle de ces conditions peut conduire à un résultat erroné.

Ensuite, chargez le micro-taux dans le thermocycleur. Avec les substrats contre le bloc thermique, l’option de couvercle chauffant doit être désactivée. Pour les laboratoires qui suivent les précautions universelles de PCR, il est plus efficace d’inclure plusieurs microréseaux d’amplification par lame et de traiter plusieurs tests simultanément.

Maintenant, exécutez le programme de cycle thermique approprié. Ce programme comporte 50 cycles d’amplification, ce qui peut sembler élevé mais nécessaire en raison de la population d’amplicon principalement simple brin créée par la réaction. Une fois la réaction terminée, retirez les microréseaux et éteignez le thermocycleur.

Ouvrez soigneusement la chambre de la puce à l’aide d’une pince plate et d’une pince. Retirez la glisse, le couvercle et le joint. La puce à ADN peut être endommagée par cette étape, alors soyez prudent de manière inappropriée.

Le retrait de l’ensemble de joint peut entraîner des dommages physiques à la puce. Veillez à ne pas plier ou fléchir la lamelle et faites très attention à ne pas rayer la surface de la puce avec la pince, transférez maintenant les substrats de la puce dans un porte-lames d’histologie. Baignez les supports dans le tampon de lavage pendant 10 minutes à température ambiante avec une agitation douce, suivez le bain de solution de lavage avec deux ou trois autres lavages, le tout dans de l’eau déminéralisée.

Séchez les microréseaux avant de passer à l’imagerie. Un léger courant d’air comprimé peut être utilisé à cet effet dans cette démonstration, les paramètres sont spécifiques au test MDR TB et à un imageur portable de terrain Econ DX 2100. Un voyant bleu sur l’imageur indique qu’il est prêt.

Allumez l’ordinateur. Ouvrez le logiciel système fourni par un conni et attendez que le logiciel annonce qu’il a établi une connexion avec l’appareil photo. Ensuite, insérez la puce séchée dans l’imageur.

Avec la puce vers l’objectif et loin de l’utilisateur. Le logiciel fournira désormais une image d’aperçu à partir du menu déroulant. Sélectionnez le script d’analyse de la tuberculose MDR.

Entrez un temps d’exposition compris entre 100 et 500 millisecondes. Les pixels surexposés seront lus. Ajustez l’exposition pour les minimiser.

Lorsque la saturation est réglée pour minimiser la surexposition, lancez l’analyse. Le logiciel place une grille de TB MDRT sur les scores d’image, les échantillons et les intensités de fond, puis rapporte les résultats de résistance aux médicaments et de génotypage. Une fois l’analyse terminée et enregistrée, retirez la puce de l’imageur et démarrez une nouvelle session d’analyse pour analyser le tableau suivant.

Poursuivez l’analyse pour chacune des puces traitées. Sauvegarde des données à chaque fois. L’analyse qualitative d’images peut fournir des informations sur les sources de bruit ou de variabilité expérimentales difficiles à identifier dans les tableaux de données générés par les logiciels d’analyse d’images automatisés.

Un réseau de haute qualité sans artefacts est visible ici. Plusieurs artefacts peuvent conduire à l’introduction de bulles qui créent des halos. Malgré les artefacts de tableau, le logiciel récupère toujours les valeurs de l’analyse.

Un algorithme de rapport de diagnostic, bien qu’il obtienne des valeurs, reconnaîtrait ce tableau comme non valide. Une série de dilution d’ADN génomique sauvage de type H 37 RA a été utilisée sur un modèle PCR de microréseau à 6,25 picogrammes, soit l’équivalent de 1 250 cellules. Toutes les sondes ont été détectées.

Une valeur SNR supérieure à trois est un résultat positif, et les valeurs enregistrées étaient beaucoup plus élevées. Ensuite, les isolats de référence de l’Organisation mondiale de la Santé ont été génotypés. Les polymorphismes mononucléotidiques présents sur la puce ont été détectés comme la mutation correspondante dans le génome de la tuberculose multirésistante.

Plusieurs exemples de détection de mutations proches voisines étaient également évidents. Une discussion est prévue dans le protocole de texte. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures et demie à six heures et demie environ, en fonction de la concentration d’ADN, du dosage spécifique, de l’efficacité et de l’uniformité du thermocycleur, ainsi que de la sensibilité et de la spécificité analytiques ou cliniques souhaitées.

De plus, le nombre de cycles d’amplification et les temps d’hybridation post-amplification peuvent être facilement raccourcis ou allongés pour obtenir les caractéristiques de performance souhaitées.