Name: Faisant preuve dune multi-résistante Mycobacterium tuberculosis Amplification de puces à ADN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Découvrez la méthode de microarray d'amplification pour le génotypage de Mycobacterium tuberculosis multirésistant. Cette technique combine PCR asymétrique et hybridation en une seule chambre, simplifiant le diagnostic dans les environnements à ressources limitées.

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Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (NIH) sous subvention RC3 AI089106. Acides nucléiques de MDR-TB ont été fournis par le Fonds / développement des Nations Unies Programme / Banque mondiale / Organisation mondiale de la Santé Programme spécial des Nations Unies pour l&#39;enfance pour la recherche et la formation concernant les maladies tropicales (TDR), Genève, Suisse. Nous remercions le Dr Tom Shinnick des US Centers for Disease Control and Prevention des indications sur les gènes et les mutations spécifiques à inclure dans le test de prototype.

Pour les laboratoires qui suivent les consignes de PCR universelle, il est opérationnel plus efficace d&#39;inclure plusieurs puces d&#39;amplification et joints par substrat et laver tous les puces d&#39;amplification simultanément dans un conteneur, comme décrit ici. Formats consommables sont disponibles pour effectuer des post-amplification microarray étapes de lavage dans un test d&#39;amplicon fermée entièrement scellé, comme rapporté ailleurs 30,33. 1. Configuration <ol><li> Extraire et de purifier des acides nucléiques à partir de l&#39;échantillon dans des conditions de sécurité biologique appropriées avec une méthode de choix. L&#39;exigence est que les acides nucléiques être d&#39;une pureté suffisante pour asymétrique amplification, PCR multiplex. </li><li> Préparer l&#39;espace de travail en essuyant les surfaces et l&#39;équipement avec des solutions de décontamination. </li><li> Placer les réactifs d&#39;amplification sur la glace ou bloc froid. </li><li> Etiqueter un tube de 1,5 ml centrifuger stérile pour le mélange maître d&#39;amplification, et étiqueter un stérile de 0,2 ml centrifuger tusoit pour chaque échantillon. </li><li> Après réactifs sont décongelées, vortex brièvement et de recueillir le contenu au fond du tube avec une impulsion de spin dans une mini-centrifugeuse. Ne pas vortex la Taq polymérase. Tapotez doucement le tube pour mélanger et de suivre avec une impulsion de spin dans la mini-centrifugeuse. </li><li> Préparer un mélange maître d&#39;amplification en utilisant les volumes par-échantillon réactionnelles indiquées dans le tableau 1. Afin de tenir compte des imprécisions possibles de pipetage, préparer au moins un volume de réaction de plus que le nombre total d&#39;échantillons en cours de traitement. Notez que le mélange maître contient plus Taq polymérase, au-delà de ce qui est prévu avec le tampon muliplex PCR. Seulement ajouter le contrôle d&#39;amplification / d&#39;inhibition au mélange maître après tous les autres réactifs sont combinés, et les tubes stock réactifs renvoyée au stockage. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Volume par-échantillon (pl) </td><td> &lt;strong&gt; Finale [] </td></tr><tr><td> PCR Buffer Mulitplex avec HotStar Taq plus </td><td> 25 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> albumine de sérum bovin (BSA) </td><td> 0,55 </td><td> 0,6 mg / ml </td></tr><tr><td> Formamide </td><td> 3.8 </td><td> 7,6% </td></tr><tr><td> Taq polymérase supplémentaires </td><td> 0,8 </td><td> unités / pl (4 unités au total) </td></tr><tr><td> MDR-TB mélange d&#39;amorces </td><td> 15.75 </td><td> - </td></tr><tr><td> RNase-H 2 O </td><td> 2.1 </td><td> - </td></tr><tr><td> Amplification / Contrôle inhibition </td><td> 1 </td><td> 5.0 fg / pl </td></tr><tr><td> Total </td><td> 49 </td><td></td></tr></tbody></table> La composition du mélange tableau 1. MDR-TB amplification microarray maître. <ol start="7"><li> Vortex le mélange maître et de recueillir le contenu au fond du tube avec une impulsion de spin dans une mini-centrifugeuse. </li><li> Mélanger 49 pi de mélange maître et 1 pl de M. ADN de la tuberculose à chacun des tubes échantillons issus de l&#39;étape 1.4 ci-dessus. Pour une externe, pas de contrôle de modèle (NTC), utiliser une pi d&#39;eau moléculaire de qualité de biologie à la place de la M. tuberculose échantillon d&#39;ADN. Vortex et impulsion de spin tube (s) lorsque vous avez terminé. </li></ol> 2. Chargez amplification puces à ADN <ol><li> Ajouter 48 ul de chaque Master Mix / échantillon sur le centre de leurs puces respectives, en faisant attention de ne pas toucher la puce elle-même. </li><li> Placez une lamelle sur le dessus de la garniture de puces à ADN et le joint, en faisant attention à ne pas coincer les bulles d&#39;air dans la chambre de puces à ADN. Des bulles d&#39;air peuvent affecter négativement l&#39;efficacité d&#39;amplificationet peut créer des artefacts ou de bruit dans l&#39;image de puces à ADN ultérieure. </li></ol> 3. Cycle thermique <ol><li> Une fois toutes les puces sont chargés de l&#39;échantillon, le lieu substrats sur le cycleur thermique de bloc plat. Assurez-vous que l&#39;option chauffée de couvercle est en position &quot;Off&quot;. Équipement obtenu de Akonni Biosystems sera déjà préqualifiés pour utilisation. Sinon, il est très important de vérifier que le cycleur thermique de bloc plat (s) donne (nt) uniforme, chauffage uniforme dans tous les supports de puces à ADN. </li><li> Ouvrez le logiciel de cycleur thermique, sélectionnez le programme approprié, entrez &quot;50 pl&quot; pour le volume de réaction, et de lancer la course. Le protocole de cyclage thermique décrit ici se compose de: <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Thermiques étapes à vélo </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 88 ° C </td><td> 5 min </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 88 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 55 ° C </td><td> 1 min </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 65 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Répétez les étapes (2-4) pendant 50 cycles </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 65 ° C </td><td> 3 min </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 55 ° C </td><td> 3 heures </td></tr></tbody></table></li><li> Le nombre total de cycles thermiques et 55 ° C l&#39;après-amplification temps d&#39;attente sont des variables indépendantes que l&#39;utilisateur peut modifier, si nécessaire ou approprié pour l&#39;expérience spécifique. Parce que le mélange maître TB-MR crée asymétriques amplicons (principalement simple brin), il est généralement utile d&#39;inclure des cycles thermiques plus que, autrement, pourraient être utilisés pour un protocole d&#39;amplification exponentielle classique, PCR. </li><li> Lorsque le programme de cyclisme et l&#39;hybridation thermique est terminée, la fin du programme, retirez les puces d&#39;amplification, fermez le logiciel, et éteignez le cycleur (s) thermique.</li></ol> 4. Laver et sécher <ol><li> Pour le lavage jusqu&#39;à 24 substrats simultanément, préparer au moins 250 ml 1x SSPE - 0,1% de Triton X-100 du tampon de lavage, et deux conteneurs avec au moins 250 ml d&#39;eau désionisée ou de qualité Milli-Q chacun. Le tampon de lavage peut être préparé à l&#39;avance. </li><li> Retirez délicatement la lamelle et le joint de chaque chambre de microréseau d&#39;amplification en utilisant une pince plate-end. Cette étape est le moment où il est le plus grand risque de causer de blessures réseaux d&#39;éléments de gel. Utiliser les contrôles de contamination PCR appropriées pour prévenir la propagation des acides nucléiques amplifiés à l&#39;intérieur de l&#39;environnement de travail. </li><li> Placez substrats de puces à ADN dans un support histologie de diapositives, et placer toutes les diapositives dans le bac de lavage contenant le tampon de lavage. Couvrir le récipient avec un couvercle. </li><li> Laver microarrays pendant 10 min à température ambiante avec agitation douce. </li><li> Tremper les puces trois fois dans chacune des deux lavages successifs de déminéralisée ouEau de qualité Milli-Q, et l&#39;air sec. </li></ol> 5. Imaging Le mélange d&#39;amorces asymétrique MDR-TB génère amplicons Cy3 marqués. puces d&#39;éléments de gel peuvent être visualisés avec n&#39;importe quel imageur microarray norme capable de l&#39;imagerie Cy3. La procédure d&#39;imagerie suivante est spécifique pour le mélange maître TB-MR, domaine Dx2100 imageur portable et un logiciel d&#39;analyse automatisée fournie par Akonni. <ol><li> Assurez-vous que le câble Ethernet de l&#39;imageur est connecté à l&#39;ordinateur. </li><li> Tournez sur l&#39;imageur. L&#39;interrupteur d&#39;alimentation est situé sur le panneau arrière de l&#39;instrument. La LED bleue sur le devant de la caméra s&#39;allume lorsque imageur est sous tension. </li><li> Allumez l&#39;ordinateur. </li><li> Sur le bureau de l&#39;ordinateur, double-cliquez sur l&#39;icône du logiciel pour lancer le logiciel d&#39;analyse d&#39;image automatisée. </li><li> Attendez que le logiciel pour établir une connexion avec l&#39;appareil photo de l&#39;imageur. Une fois la connexion établie, le bouton Analyser devient disponible, et lamessage «Connexion réussie» apparaît dans le coin inférieur gauche de l&#39;écran. </li><li> Insérer la puce d&#39;amplification séché avec le microréseau opposé à l&#39;utilisateur, et en direction de la lentille d&#39;objectif. Si la puce n&#39;est pas correctement orientée par rapport à la lentille et de la caméra, le logiciel d&#39;analyse automatisé échoue à placer une grille sur l&#39;image de fluorescence. </li><li> Fermez la porte d&#39;accès. Un aperçu sera disponible sur l&#39;écran d&#39;ordinateur. </li><li> Sélectionnez le script d&#39;analyse de TB-MR dans le menu déroulant et entrez le temps de l&#39;exposition souhaitée (en millisecondes). Un point de départ typique pour élément de gel puces d&#39;amplification est 100-500 ms. </li><li> Pixels saturés seront affichés sur l&#39;image de prévisualisation en rouge. Ajuster le temps d&#39;exposition afin de minimiser le nombre de pixels à l&#39;intérieur de spots saturés individuels. </li><li> Cliquer Analyser à acquérir et à analyser l&#39;image de fluorescence. Le logiciel placera automatiquement uneMDR-TB réseau spécifique au test sur l&#39;image, extraire intensité intégrée et des valeurs de fond, et de faire rapport résistance aux médicaments et de génotypage des résultats. L&#39;analyse automatique prend généralement quelques secondes. Pour les images difficiles qui contiennent des rayures, de la poussière, des objets fluorescents ou des dommages physiques aux caractéristiques de puces à ADN, le logiciel peut nécessiter jusqu&#39;à 1 min pour compléter l&#39;analyse. </li><li> Une fois l&#39;analyse terminée, cliquez sur Enregistrer, sélectionnez le dossier de destination, tapez un nom de fichier, et cliquez sur OK. Données de biopuces sous-jacents sont enregistrées dans un fichier xls. Et peuvent être exportés pour des analyses hors ligne, si désiré. </li><li> Une fois l&#39;analyse terminée, retirez la puce d&#39;amplification de l&#39;imageur, et cliquez sur Nouveau pour lancer l&#39;analyse suivante. </li><li> Lorsque vous avez terminé la collecte de données, fermez le logiciel, éteignez l&#39;ordinateur, et d&#39;éteindre la caméra. </li></ol>

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<li>Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plastic%2C+disposable+microfluidic+flow+cell+for+coupled+on-chip+PCR+and+microarray+detection+of+infectious+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents.</a> Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).</li>
<li>Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplicon+secondary+structure+prevents+target+hybridization+to+oligonucleotide+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).</li>
<li>El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+sloppy+molecular+beacon+probes+for+identification+of+Mycobacterial+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).</li>
<li>Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+molecular+detection+of+tuberculosis+and+rifampin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

L&#39;étendue de multiplexage avec un microréseau d&#39;amplification est finalement dictée par l&#39;efficacité de la PCR multiplex asymétrique, et non le microréseau. Dans notre expérience, 10-12 paires d&#39;amorces uniques peuvent être facilement multiplexés dans un format amplification de puces à ADN. Critères d&#39;amorces et de conception de la sonde classiques s&#39;appliquent donc à de nouveaux essais, à l&#39;exception que l&#39;on doit aussi tenir compte des interactions potentielles entre les acides nucléiqu...

La détection précoce des cas et un traitement rapide sont considérés comme des stratégies de lutte les plus efficaces pour réduire Mycobacterium tuberculosis (MTB) transmission 1, et il est maintenant un large consensus dans la communauté de la tuberculose que d&#39;un point de service (PDS) ou près de test de POC pour diagnostiquer simultanément la tuberculose et la résistance aux médicaments (DR) est nécessaire. Les technologies telles que GeneXpert de Cepheid et autres tests d&#39;amplification des acides nucléiques de réduire le temps de diagnostic pour de nombreux patients atteints de tuberculose, et fournissent une lecture rapide indique la résistance à la rifampicine ou mutations sélectionnées conférant une résistance à d&#39;autres médicaments de première ou deuxième ligne 2. Bien que les tests d&#39;amplification en temps réel et de l&#39;acide nucléique isotherme sont conçus pour identifier les mutations de résistance aux médicaments qui mènent à la TB-MR, le spectre des mutations qu&#39;ils détectent est souvent insuffisante pour concevoir un schéma thérapeutique individualisé correspondant au profil de résistance aux médicaments du patient, et les contraintes techniques liéesà la diaphonie optique ou de la complexité de l&#39;amplification et de reporting chimiques 3 au 7 mai limiter le nombre de loci ou des mutations qui sont détectés. Ainsi, les technologies de détection avec une capacité de multiplexage élevé sont nécessaires pour combler les lacunes connues dans le diagnostic de TB-MR au PS. Les puces à ADN et les Hain essais de sonde de la ligne approuvée par l&#39;OMS peuvent répondre à la «gène multiple, multiples mutations&quot; défi de diagnostiquer la TB-MR 8-29. Malheureusement, ces plates-formes, de détection multiplex à base d&#39;hybridation utilisent plusieurs étapes, compliqué, et les protocoles ouverts amplicon qui exigent une formation importante et la maîtrise des techniques moléculaires. L&#39;amplification microréseau 30 a été conçu pour répondre à certaines de ces puces à ADN flux de travail et des problèmes opérationnels. Les principes fluidiques sont simplificatrices pour amplifier, s&#39;hybrident, et détecter des cibles d&#39;acides nucléiques dans une seule chambre microfluidique. L&#39;utilisateur introduit les acides nucléiques et d&#39;amplification master mélanger dans une chambre fluidique avec une pipette et commence le protocole de cycle thermique. Pour la méthode de traitement par lots représenté ici, les microréseaux sont ensuite lavées dans une solution en vrac, séchées et imagés. Cette étude démontre la fonctionnalité d&#39;un microréseau d&#39;amplification à l&#39;aide d&#39;un test de TB-MR microarray pour rpoB (30 mutations), katG (2 mutations), inhA (4 mutations), rpsL (2 mutations), embB (1 mutation), IS1245, IS6110 , et une amplification interne et de contrôle de l&#39;hybridation. Au moins une paire appariée de microréseau de sondes (type sauvage (WT) et mutantes de nucléotide unique (MU)) est inclus pour chaque mutation d&#39;intérêt. Acides nucléiques purifiés à partir de multi-drogue M. résistant la tuberculose sont de la souche TDR tuberculose 31 Banque. puces d&#39;éléments de gel sont fabriqués sur des substrats de verre par copolymérisation essentiellement comme décrit par ailleurs 32, sauf que nous utilisons 4% de monomère et 0,05 mM chaque sonde dans le polymérisablesmélange d&#39;ation. Les tableaux sont entourés d&#39;un joint de 50 ml avant l&#39;utilisation. Après cyclage thermique, hybridation et lavage étapes, les puces d&#39;amplification sont visualisés sur un analyseur portable Akonni. Fond corrigée, les intensités de signaux intégrés sont obtenus à partir de la première. Images tif en utilisant un algorithme de cercle fixe. Bruit pour chaque élément en gel est égale à trois fois l&#39;écart type des milieux de tache locales. cibles de gènes sont généralement considérés comme détectable pour le rapport signal sur bruit (SNR) des valeurs ≥ 3. Afin de déterminer la présence ou l&#39;absence d&#39;une mutation spécifique dans chaque gène ou codon, un rapport discriminant est calculée à partir des valeurs de SNR que (WT-MU) / (WT + MU). Ratios discriminants &lt;0 sont indicatifs d&#39;une mutation de résistance aux médicaments au niveau du locus, tandis que les ratios&gt; 0 sont indicatifs de la séquence de type sauvage.

<table><tbody><tr><td>Microréseaux d’amplification MDR-TB, avec joint d’étanchéité appliqué et lamelles de recouvrement prédécoupées</td><td>Akonni Biosystems</td><td>Inquire</td><td></td></tr><tr><td>Kit PCR multiplex, contenant un tampon PCR 2X avec HotStar Taq plus</td><td>Qiagen</td><td>#206143</td><td></td></tr><tr><td>Taq polymérase</td><td>Qiagen</td><td>#201207</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans RNAse</td><td>Qiagen</td><td>#206143&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#BP227-500</td><td></td></tr><tr><td>20 mg mL-1 albumine sérique bovine non acétlyée (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#3B6917</td><td></td></tr><tr><td>5X concentré MDR-TB primer mix</td><td>Akonni Biosystems</td><td>Inquire</td><td></td></tr><tr><td>500 fg uL-1 amplification et inhibition</td><td>Akonni Biosystems</td><td>Inquire</td><td></td></tr><tr><td>20X SSPE</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc. </td><td>#BP1328-4</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Spray désinfectant</td><td>Technologies actuelles, Inc.</td><td></td><td></td>#BRSPRAY128</tr><tr><td>Alcool isopropylique à 70 %</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>#8416</td><td></td></tr><tr><td>Imageur de microréseaux, avec logiciel d’analyse automatisée d’images et de données</td><td>Akonni Biosystems</td><td>100-20011</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur avec insert plat</td><td>Akonni Biosystems</td><td>100-10021</td><td></td></tr><tr><td>Station de lavage à haut débit et porte-lames</td><td>ArrayIt</td><td>HTW</td><td></td></tr><tr><td>Pince de dissection</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#10-300</td><td></td></tr><tr><td>Mini Vortexer</td><td>VWR</td><td>#3365040</td><td></td></tr><tr><td>Mini-centrifugeuse</td><td>VWR</td><td>#93000-196</td><td></td></tr><tr><td>Kit de compresseur d’aérographe</td><td>Pneumatique central</td><td>#95630</td><td></td></tr></tbody></table>

faisant preuve d&#39;une multi-résistante<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em&gt; amplification de puces à adn

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifier microarray flux de travail est une première étape nécessaire pour la création de MDR-TB diagnostic des biopuces qui peuvent être utilisées en routine dans des environnements à faibles ressources. Un microréseau d&#39;amplification combine amplification PCR asymétrique, la sélection de la taille de la cible, l&#39;étiquetage cible, et microarray hybridation dans une solution unique et dans une seule chambre microfluidique. Une méthode de traitement par lots est démontrée avec un mélange maître asymétrique 9 complexes et à faible densité élément de gel pour le génotypage microréseau multi-drogue Mycobacterium tuberculosis résistantes (MDR-TB). Le protocole décrit ici peut être complété en 6 heures et fournir correct génotypage d&#39;au moins 1 000 équivalents cellulaires d&#39;ADN génomique. L&#39;intégration sur puce des étapes de lavage est possible, qui se traduira par une méthode d&#39;amplicon entièrement clos et système. L&#39;étendue de multiplexage avec un microréseau d&#39;amplification est finalement limitée par le nombre de paires d&#39;amorces qui peuvent être combinés en un seul maître mix et encore obtenir une sensibilité désirée et des mesures de performance de spécificité, plutôt que le nombre de sondes qui sont immobilisées sur la matrice. De même, le temps total d&#39;analyse peut être raccourcie ou allongée en fonction de l&#39;utilisation spécifique prévue, question de recherche, et les limites souhaitées de détection. Néanmoins, l&#39;approche générale simplifie considérablement microarray flux de travail pour l&#39;utilisateur final en réduisant le nombre d&#39;étapes manuellement intensives et longues traitement, et fournit une voie biochimique et microfluidique simplifiée pour traduire diagnostic des biopuces dans la pratique clinique de routine.

Analyse d&#39;image qualitative peut donner un aperçu des sources de bruit ou de la variabilité expérimentale qui sont difficile à identifier dans les tableaux de données générés par un logiciel automatisé d&#39;analyse d&#39;image. Ainsi, il peut être utile de visuellement s&#39;assurer que 1) tous les éléments de gel sont intacts et en bon état, 2) le contexte mondial est sans artefacts fluorescents qui pourraient affecter signal individuel de bruit SNR) de valeurs (3) il n&#39;existe aucune preuve pour la formation d...

Un microréseau d&#39;amplification asymétrique combine l&#39;amplification par PCR et l&#39;hybridation microarray dans une seule chambre, qui simplifie considérablement microarray flux de travail pour l&#39;utilisateur final. Simplifier microarray flux de travail est une première étape nécessaire pour la création de diagnostics des biopuces qui peuvent être utilisées en routine dans des environnements à faibles ressources.

Faisant preuve d&#39;une multi-résistante<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplification de puces à ADN

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

L’objectif global de l’expérience suivante est de génotyper une microbacterium tuberculose multirésistante aux médicaments, à l’aide d’une puce à amplification. Ceci est réalisé en effectuant une PCR asymétrique multiplex sur le dessus d’une micropuce à l’intérieur d’une seule chambre de réaction microfluidique. Là, l’échantillon est simultanément amplifié, la taille étiquetée sélectionnée, rendue simple brin et hybridée à la puce.Ensuite, après avoir lavé la puce à micropuce, un lecteur indique si Microbacterium tuberculosis est présent et s’il contient une mutation de l’ADN connue pour conférer une résistance à la rifampicine iso, au niazi éthambutol ou à la streptomycine. L’avantage de cette méthode par rapport aux méthodes existantes de sonde linéaire ou d’hybridation d’acides nucléiques est qu’une puce à amplification simplifie considérablement l’interaction de l’utilisateur avec le test. Néanmoins, tout en offrant la sensibilité analytique de la PCR et la capacité de multiplexage d’une puce à ADN Pour cette procédure, ayez un espace de travail propre essuyé avec une solution de décontamination et ayez des acides nucléiques suffisamment purs pour la PCR multiplexe.Après avoir décongelé et mélangé toutes les solutions mères, assemblez le mélange maître PCR. Lors de la préparation de ce mélange, préparez au moins un volume supplémentaire de mélange pour le test de tuberculose illustré ici. Ajoutez également de la T polymérase supplémentaire au mélange principal.En plus de la quantité d’adhérence fournie avec les réactifs de base, un microlitre d’aliquotes d’ADN de l’échantillon pour 49 microlitres de mélange maître. Ajoutez soigneusement 48 microlitres de chaque mélange réactionnel au centre de la puce appropriée. Ne touchez pas la puce elle-même.Ensuite, couvrez soigneusement et scellez la puce de manière incorrecte. L’application de la lamelle peut introduire des bulles qui peuvent entraîner des artefacts, une évaporation, une mauvaise amplification ou une hybridation non uniforme. N’importe laquelle de ces conditions peut conduire à un résultat erroné.Ensuite, chargez le micro-taux dans le thermocycleur. Avec les substrats contre le bloc thermique, l’option de couvercle chauffant doit être désactivée. Pour les laboratoires qui suivent les précautions universelles de PCR, il est plus efficace d’inclure plusieurs microréseaux d’amplification par lame et de traiter plusieurs tests simultanément.Maintenant, exécutez le programme de cycle thermique approprié. Ce programme comporte 50 cycles d’amplification, ce qui peut sembler élevé mais nécessaire en raison de la population d’amplicon principalement simple brin créée par la réaction. Une fois la réaction terminée, retirez les microréseaux et éteignez le thermocycleur.Ouvrez soigneusement la chambre de la puce à l’aide d’une pince plate et d’une pince. Retirez la glisse, le couvercle et le joint. La puce à ADN peut être endommagée par cette étape, alors soyez prudent de manière inappropriée.Le retrait de l’ensemble de joint peut entraîner des dommages physiques à la puce. Veillez à ne pas plier ou fléchir la lamelle et faites très attention à ne pas rayer la surface de la puce avec la pince, transférez maintenant les substrats de la puce dans un porte-lames d’histologie. Baignez les supports dans le tampon de lavage pendant 10 minutes à température ambiante avec une agitation douce, suivez le bain de solution de lavage avec deux ou trois autres lavages, le tout dans de l’eau déminéralisée.Séchez les microréseaux avant de passer à l’imagerie. Un léger courant d’air comprimé peut être utilisé à cet effet dans cette démonstration, les paramètres sont spécifiques au test MDR TB et à un imageur portable de terrain Econ DX 2100. Un voyant bleu sur l’imageur indique qu’il est prêt.Allumez l’ordinateur. Ouvrez le logiciel système fourni par un conni et attendez que le logiciel annonce qu’il a établi une connexion avec l’appareil photo. Ensuite, insérez la puce séchée dans l’imageur.Avec la puce vers l’objectif et loin de l’utilisateur. Le logiciel fournira désormais une image d’aperçu à partir du menu déroulant. Sélectionnez le script d’analyse de la tuberculose MDR.Entrez un temps d’exposition compris entre 100 et 500 millisecondes. Les pixels surexposés seront lus. Ajustez l’exposition pour les minimiser.Lorsque la saturation est réglée pour minimiser la surexposition, lancez l’analyse. Le logiciel place une grille de TB MDRT sur les scores d’image, les échantillons et les intensités de fond, puis rapporte les résultats de résistance aux médicaments et de génotypage. Une fois l’analyse terminée et enregistrée, retirez la puce de l’imageur et démarrez une nouvelle session d’analyse pour analyser le tableau suivant.Poursuivez l’analyse pour chacune des puces traitées. Sauvegarde des données à chaque fois. L’analyse qualitative d’images peut fournir des informations sur les sources de bruit ou de variabilité expérimentales difficiles à identifier dans les tableaux de données générés par les logiciels d’analyse d’images automatisés.Un réseau de haute qualité sans artefacts est visible ici. Plusieurs artefacts peuvent conduire à l’introduction de bulles qui créent des halos. Malgré les artefacts de tableau, le logiciel récupère toujours les valeurs de l’analyse.Un algorithme de rapport de diagnostic, bien qu’il obtienne des valeurs, reconnaîtrait ce tableau comme non valide. Une série de dilution d’ADN génomique sauvage de type H 37 RA a été utilisée sur un modèle PCR de microréseau à 6,25 picogrammes, soit l’équivalent de 1 250 cellules. Toutes les sondes ont été détectées.Une valeur SNR supérieure à trois est un résultat positif, et les valeurs enregistrées étaient beaucoup plus élevées. Ensuite, les isolats de référence de l’Organisation mondiale de la Santé ont été génotypés. Les polymorphismes mononucléotidiques présents sur la puce ont été détectés comme la mutation correspondante dans le génome de la tuberculose multirésistante.Plusieurs exemples de détection de mutations proches voisines étaient également évidents. Une discussion est prévue dans le protocole de texte. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures et demie à six heures et demie environ, en fonction de la concentration d’ADN, du dosage spécifique, de l’efficacité et de l’uniformité du thermocycleur, ainsi que de la sensibilité et de la spécificité analytiques ou cliniques souhaitées.De plus, le nombre de cycles d’amplification et les temps d’hybridation post-amplification peuvent être facilement raccourcis ou allongés pour obtenir les caractéristiques de performance souhaitées.

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Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Antibiogramme de Mycobacterium tuberculosis est difficile mais essentiel pour les soins aux patients. Ce format microplaque offre des tests de 12 antimycobactériens et fournit la concentration minimale inhibitrice (CMI), qui aidera à un traitement approprié.

Test de sensibilité aux antimicrobiens du complexe Mycobacterium tuberculosis des drogues de première et deuxième par dilution en bouillon dans un format microplaque

Le test Xpert MTB/RIF intègre la décontamination des échantillons, un fonctionnement sans manipulation manuelle, un traitement intégré des échantillons et une PCR hémiconnée ultra-sensible pour la détection simultanée de Mycobacterium tuberculosis et de la résistance à la rifampicine, soit dans l'expectoration, soit dans les sédiments de crachats concentrés, en environ deux heures. L'analyse est standardisée et nécessite uniquement une infrastructure de laboratoire modeste ainsi qu'une...

Diagnostic de la tuberculose pulmonaire avec le Xpert MTB / RIF test

Cette vidéo présente un test permettant d’évaluer l’efficacité des médicaments contre l’infection à Mycobacterium tuberculosis (Mtb).  Un modèle d’infection in vitro contenant des agrégats de Mtb/macrophages est généré qui imite l’infection in vivo. Lors de l’introduction d’antibiotiques appropriés, leur efficacité est testée par dosage de la résuzarine pour surveiller la survie des bactéries avec des concentrations de médicament croissantes.

Un test pour évaluer l’efficacité d’un médicament contre un modèle d’infection à Mycobacterium tuberculosis

Ici, nous décrivons une analyse phénotypique applicable aux écrans à haut débit/à haute teneur de l’ARN synthétique de petit-interférent (siRNA), du composé chimique, et des bibliothèques mutantes de tuberculose de mycobactérie. Cette méthode repose sur la détection de Mycobacterium tuberculosis marqué par fluorescence dans une cellule hôte marqué par fluorescence à l’aide d’une microscopie confocale automatisée.

Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur

De nouveaux modèles et tests qui amélioreraient le processus de développement précoce des médicaments antituberculeux de nouvelle génération sont hautement souhaitables. Nous décrivons ici un test rapide, peu coûteux et compatible BSL-2 pour évaluer l’efficacité d’un médicament contre Mycobacterium tuberculosis qui peut être facilement adapté au criblage à haut débit.

Un haut-débit Assay Compatible pour évaluer l&#39;efficacité des médicaments contre Macrophage repiquées<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Nous décrivons un test d’essai moléculaire de charge bactérienne de la tuberculose effectué après l’inactivation de chaleur des expectorations. L’inactivation de la chaleur rend les échantillons d’expectorations non infectieux et évite la nécessité de laboratoires de confinement de niveau 3 pour les tests moléculaires de la tuberculose.

Un essai de charge bactérienne moléculaire de la tuberculose (TB-MBLA)

Cette étude a mis au point un test de criblage à haut débit contre Mycobacterium abscessus avec une souche à double rapporteur récemment créée, en utilisant la fluorescence et la luminescence pour évaluer rapidement la viabilité bactérienne. Ce protocole sera pertinent pour les chercheurs qui souhaitent cribler de nouveaux médicaments contre cette bactérie résistante aux médicaments.

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Préparation de l&#39;échantillon de<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extraits pour Magnétique Nucléaire études métabolomiques résonance

Mycobacterium tuberculosis forme des biofilms de drogues tolérantes quand elles sont cultivées dans certaines conditions. Nous décrivons ici les méthodes de culture, M. biofilms tuberculose et la détermination de la fréquence des persistants de drogue tolérante. Ces protocoles seront utiles pour d'autres études sur les mécanismes de la tolérance au médicament chez M. la tuberculose.

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