Imagerie épines dendritiques des neurones de l'hippocampe de rat primaire utilisant structuré Illumination Microscopy

L’objectif global de cette procédure est d’imager les épines dendritiques en super résolution. Ceci est accompli en préparant d’abord un hippocampe primaire de rat appelé la deuxième étape consiste à visualiser les épines dendritiques au moyen de la transfection et de la coloration GFP. Ensuite, l’acquisition d’épines dendritiques marquées à la GFP est réalisée en super résolution à l’aide d’un microscope SIM.

La dernière étape consiste à reconstruire les données d’image brutes en 3D, prêtes pour l’analyse ultérieure de l’image. En fin de compte, la GFP exprimant les neurones primaires de l’hippocampe imagés en super résolution est utilisée pour montrer des changements subtils dans la morphologie de la colonne vertébrale dendritique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la microscopie confocale conventionnelle, est qu’elle permet d’étudier plus en détail la morphologie de la colonne dendritique.

Cette méthode peut aider à examiner des questions clés en cours en neurosciences, telles que les altérations moléculaires et pharmacologiques dépendantes de la forme des épines dendritiques. La microscopie à élimination structurée est basée sur la projection de motifs linéaires sur l’échantillon, ce qui donne des informations supplémentaires qui peuvent être extraites par un programme informatique et donne des images très nettes et qui vous permet d’observer les mitochondries MI et d’autres petites structures dans la cellule. Une démonstration visuelle de cette méthode est importante afin d’obtenir une reconstruction valide d’une image SIM est cruciale pour passer par les étapes qui vous donnent une bonne qualité des données brutes.

Une étape préparatoire importante consiste à enduire les lamelles de protection, en travaillant dans un capot laminaire stérile. À l’aide d’une petite pince stérile, placez les lamelles individuelles dans les puits simples d’une plaque à 12 puits. Ajoutez ensuite 500 microlitres de solution de polylysine dans chaque puits pour immerger les lamelles.

Après avoir lavé les puits, ajoutez un millilitre de milieu de placage et laissez les lamelles dans l’incubateur de culture tissulaire jusqu’à 24 heures avant de plaquer les cellules. La procédure sera démontrée par HU est SH, un étudiant au doctorat de notre groupe. Après avoir isolé l’embryon d’un rat, utilisez des pinces fines pour retirer et jeter le cervelet du cerveau.

Séparez les deux hémisphères en faisant une coupe sagittale le long de la ligne médiane sous un microscope à dissection, utilisez une paire de petites pinces pour tenir doucement le mésencéphale et retirez le mésencéphale. Avec une autre paire de pinces, laissez intact le reste de l’hémisphère contenant le cortex et l’hippocampe. Ensuite, retirez soigneusement les méninges, réorientez le tissu de manière à ce que l’hippocampe soit tourné vers le haut.

L’hippocampe peut être identifié par sa structure caractéristique en forme de CS. À l’aide d’une pince fine, disséquez l’hippocampe et placez-le dans une nouvelle parabole de 30 millimètres contenant un X-H-B-S-S frais et froid. Après avoir retiré les hippopotames de tous les embryons, comptez le nombre total de hippopotames et coupez-les en petits morceaux.

Recueillez les morceaux dans un tube à centrifuger de 15 millilitres contenant trois millilitres d’un X-H-B-S-S. Après avoir centrifugé et éliminé le surnageant, ajoutez six microlitres de trypsine par hippocampe. Après avoir incubé et lavé les fragments d’hippocampe comme décrit dans le protocole de texte, tâtez lentement les fragments 30 fois avec une pipette de pasteur polie au feu jusqu’à ce que tous les morceaux de tissu soient dispersés de manière homogène en cellules uniques.

Prenez soin d’éviter tout bulle. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de milieu de placage, prévenu à 37 degrés Celsius. Après avoir compté les cellules à l’aide d’une graine de coloration vitale bleu trian, 50 000 cellules par puits d’une plaque de 12 puits dans un millilitre de milieu de placage pour un volume total de deux millilitres.

Après avoir basculé la plaque pour répartir uniformément les cellules, incubez les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone. Après deux à trois jours, remplacez 0,5 millilitre de milieu de placage par un milieu de culture contenant 10 micromolaires de FUDR. Pour transfecter, les neurones ajoutent une lipectomie.

Mélanger goutte à goutte à un mélange d’ADN et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Dans une hotte à flux laminaire, 10 minutes avant la fin de la lipectomie d’ADN de 30 minutes mélange, incubation, pipette le milieu conditionné de la plaque d’origine ou de la première plaque de culture à une seconde 12. Placez cette plaque et conservez cette plaque à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone dans la première plaque de culture.

Remplacez rapidement le milieu conditionné par un millilitre de milieu d’incubation préchauffé pour éviter que les cellules ne se dessèchent. Remettez les deux plaques dans l’incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone. À la fin de l’incubation de 30 minutes de la lipectomie d’ADN, le mélange de lipectomie d’ADN est prêt à être ajouté aux cellules.

Ajoutez doucement 200 microlitres du mélange de lipectomie à ADN dans chaque puits et incubez pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone. Après l’incubation de 45 minutes, utilisez de petites pinces pour soulever les lamelles qui retiennent les neurones. Rincez-les en les trempant dans un plat de trois centimètres contenant du milieu neurobasal frais et chaud et placez-les dans un puits.

Dans le second 12, plaque de puits contenant le milieu conditionné. Ensuite, incubez les neurones transfectés à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures. Pour vous préparer à l’immuno-coloration, aspirez doucement le fluide à partir des puits contenant les lamelles.

Ajoutez ensuite soigneusement 500 microlitres de PFA chaud à 4 % pour éviter d’endommager les dendrites. Après avoir incubé et lavé le bloc cellulaire avec une solution à 1 % T-B-S-B-S-A à température ambiante pendant 30 minutes après le lavage à nouveau, ajoutez l’anticorps primaire dilué dans l’incubation, mélangez et incubez à température ambiante pendant une heure. Ensuite, incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius en secouant doucement.

Le lendemain matin, retirez l’anticorps primaire et lavez-le à nouveau à partir de maintenant, gardez les lamelles à l’abri de la lumière. Ensuite, ajoutez l’anticorps conjugué fluorescent secondaire dilué en incubation. Mélangez et incubez à température ambiante pendant deux heures.

Retirez ensuite l’anticorps secondaire et lavez les cellules à l’aide d’une pince à épiler fine. Retirez les lamelles des puits et séchez tout excès de TBS avec un mouchoir en papier. Enfin, montez les lamelles à l’aide d’un support de montage et scellez-les avec du vernis à ongles.

Pour commencer l’imagerie SIM, allumez le laser de 488 nanomètres, la lampe au mercure, le contrôleur de scène, le contrôleur pizo et la lampe halogène pour la lumière transmise. Démarrez le logiciel SIM en mode et ou pour nsim. Après avoir mis une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif, vérifiez qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la goutte d’huile.

Placez la lamelle avec les neurones de l’hippocampe sur la platine du microscope. Déplacez l’objectif vers le haut jusqu’à ce que l’huile touche l’échantillon. N’oubliez pas de placer un couvercle sur la platine pendant la procédure d’acquisition pour protéger l’échantillon de la lumière ambiante et tamiser autant que possible la lumière dans la pièce.

Dans le logiciel SIM, sélectionnez la configuration optique IFI et sélectionnez un bloc de filtre vide pour une inspection visuelle avec mise au point de l’échantillon de réglage de la lumière blanche. Éteignez ensuite la lumière blanche et allumez la lampe au mercure. Ouvrez l’obturateur et sélectionnez le filtre vert pour rechercher une dendrite suffisamment lumineuse.

Lorsque vous rencontrez une dendrite d’intérêt suffisamment brillante et que vous centrez un segment d’intérêt dans le champ de vision, fermez l’obturateur. Réglez le logiciel sur la configuration optique 3D SIM 4 88 et les paramètres de l’appareil photo comme suit. Réglez le mode de lecture sur em.

Gagnez un mégahertz 16 bits. Réglez le temps d’exposition à 100 millisecondes. Réglez la puissance laser sur 5 %Réglez le gain EM sur 200.

Avec la vitesse de mise au point réglée sur extra fine, faites la mise au point sur l’objet d’intérêt. Ajustez rapidement les paramètres de l’appareil photo comme suit. Pour obtenir une valeur d’intensité comprise entre 30 040 5 000, réglez la puissance du laser sur 0 % à 20 %Réglez le temps d’exposition sur 50 millisecondes à deux secondes.

Réglez le mode de lecture sur em. Gagnez un mégahertz 16 bits. Réglez le gain EM sur zéro à 300.

Réglez le gain de conversion sur un x à 5,1 x. Réglez le format pour live sur no Benning. Définissez le format de capture sur aucun Benning.

Ensuite, configurez les paramètres de la pile des trois DZ dans le panneau de séquence ND comme suit, définissez la plage sur deux microns. Réglez la taille du pas sur 120 nanomètres et cliquez sur la position d’origine. Sélectionnez ensuite la configuration optique, 3D SIM 4 88 dans la section lambda.

Après avoir sélectionné la carte SIM 3D comme mode d’acquisition, exécutez l’acquisition de la séquence ND et enregistrez les données brutes. Les acquisitions ont été reconstruites à partir d’images confocales et SIM. Les dendrites ont été tracées et les épines ont été classées automatiquement avec le logiciel après avoir ajusté les paramètres principaux tels que la longueur du cou, le diamètre du cou et le diamètre de la tête.

Les zones encadrées montrent une épine dendritique individuelle imagée par microscopie confocale et sim et reconstruite à partir de leurs piles Z correspondantes, représentant les différences de résolution et de précision des reconstructions 3D résultantes. Selon l’analyse quantitative à plus haute résolution de SIM, le diamètre de la tête et du cou a révélé que la microscopie sim mesure des dimensions significativement plus petites que la microscopie confocale pour les mêmes épines dendritiques, ce qui indique que la SIM est capable de détecter des changements plus petits dans la morphologie de la colonne dendritique. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’acquérir des images brutes de haute qualité pour une reconstruction ultérieure plus valable de la même image.

La microscopie à éclairage structuré peut également être efficace pour l’imagerie de cellules vivantes, permettant d’étudier la dynamique de cellules telles que les cellules Hela, les neurones ou les bactéries E coli. Après avoir regardé cette vidéo, on devrait avoir une bonne compréhension de la façon de préparer, de visualiser et d’expliquer l’image standard des neurones primaires de l’hippocampe dans une super résolution.