Name: Mise en place dun In Vitro Modèle de Rat barrière hémato-encéphalique (BHE): un regard sur le Bureau imperméabilité et de transport médié par le récepteur (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 26 s
Description: Apprenez à établir un modèle in vitro de barrière hémato-encéphalique chez le rat par co-culture de cellules endothéliales et d'astrocytes. Cette méthode permet d'évaluer l'intégrité de la barrière et les mécanismes de transport pour la recherche en pharmacologie.

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Le soutien financier à VECT-HORUS est reconnu dans le Fonds Unique Interministériel (projet FUI / MEDUL) et à Vect-Horus et le laboratoire UMR7259 de l&#39;Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, l&#39;ADHOC et des projets de collaboration PREVENTAD) . Le laboratoire UMR7259 reconnaît également le soutien financier du CNRS et de l&#39;Université d&#39;Aix-Marseille.

1. Production de Rat astrocytes Pour chaque préparation utiliser 10 rats Wistar néonatale de l&#39;autre sexe. <ol><li> Sacrifier les rats par des têtes de coupe avec une paire de ciseaux et de les transférer immédiatement dans une boîte de Pétri sec sous une hotte à flux laminaire. Retirer le cerveau du crâne sans le cervelet et les transférer immédiatement dans une boîte de Pétri contenant un tampon de dissection froid: HBSS complété avec 1% de sérum-albumine bovine (niveau bas d&#39;endotoxine BSA), de la pénicilline à 100 unités / ml et streptomycine 100 pg / ml. </li><li> Couper le cerveau en deux, pour séparer les deux hémisphères cérébraux et les transférer dans une boîte de Pétri propre avec un tampon de dissection sur la glace. Couper le nerf optique et retirez les méninges sous un stéréomicroscope. </li><li> Laver les morceaux corticales largement dans 50 ml de tampon de dissection froide. </li><li> Placez les morceaux corticales de 3 cerveaux dans un tube Falcon de 15 ml et dissocier par aspiration et refoulement d&#39;un couple de fois avec une pipette jetable de 10 ml équipé d&#39;une pointe bleue dans 6 ml de trypsine à 0,05% - EDTA 0,02% pendant 5 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 24 ml de DMEM supplémenté avec 10% de FBS et des antibiotiques suivants pénicilline, 100 unités / ml et streptomycine 100 pg / ml, un milieu appelé milieu cellulaire gliale (MCG), et centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Lots de FBS ont été sélectionnés et validés pour la croissance et la survie de cutures d&#39;astrocytes. </li><li> Reprendre le culot contenant les cellules dissociées dans 10 ml GCM et la plaque en 75 cm 2 T-ballon (T75). Changer le support le lendemain pour enlever les débris de cellules et de l&#39;ADN. Remplacez le support de culture deux fois par semaine. </li><li> Après 1 semaine de la prolifération, secouez doucement les cellules gliales avec un agitateur orbital à 60 rpm pendant 24 heures à 37 ° C dans GCM. Si le T75 ne peut pas être placé dans un incubateur avec 5% de CO 2/95% d&#39;air à 37 ° C atmosphère humidifiée, compléter les médias mM HEPES 5. Laver les cellules deux fois pour rEDéplacez les cellules microgliales non-adhérentes. </li><li> Trois semaines après le semis, laver les cellules deux fois avec DPBS sans calcium et magnésium. Ajouter 3 ml de trypsine chaud 0,05%-EDTA 0,02%, incuber à 37 ° C et attendre jusqu&#39;à ce que la couche de cellules est dispersée (généralement 5 min). Inhiber l&#39;activité de la trypsine en ajoutant 10 ml de GCM, transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et Falcon à 120 g pendant 8 min. </li><li> Reprendre le culot des astrocytes dans 90% de FBS - 10% de DMSO, les transférer dans des cryotubes (2 x 10 6 cellules par tube cryogénique) et magasin dans l&#39;azote liquide. </li></ol> 2. Isolement des microvaisseaux du cerveau de rat Nos procédures expérimentales sont approuvés par le comité d&#39;éthique de la faculté de médecine de Marseille et sont conformes aux réglementations nationales et européennes (directive européenne n ° 86/609). Tous les efforts ont été faits pour réduire au minimum la souffrance des animaux et de réduire le nombre d&#39;animaux utilisés. <ol><li> Pour chaque préparation et pour un experimenter, utiliser 3 vieilles cinq semaines des rats Wistar. </li><li> Lundi de la première semaine, de préparer deux flacons T75 par revêtement avec du collagène de type IV et de la fibronectine, à la fois à 1 pg / cm 2 dans l&#39;eau de culture stérile (10 ml par T75). Laisser adhérer à 37 ° C jusqu&#39;à ce que microvaisseaux semis. </li><li> Mercredi matin de la première semaine, euthanasier les rats sous un flux croissant de CO 2 pour induire la somnolence, la perte de la posture et la respiration interruption, suivie d&#39;une dislocation cervicale. Vaporiser les têtes avec 70% d&#39;éthanol. Couper les têtes avec une paire de ciseaux et de les transférer dans une boîte de Pétri sec sous une hotte à flux laminaire. </li><li> Retirer le cerveau du crâne sans le cervelet et les nerfs optiques, puis de les transférer dans une boîte de Pétri refroidi sur de la glace et rempli avec du tampon de dissection froide (HBSS complété avec 1% de BSA, de la pénicilline à 100 unités / ml et streptomycine 100 pg / ml) . </li><li> Couper le cerveau en deux pour séparer les deux hémisphères cérébraux et le mésencéphale séparée de pourebrain. Transférer les forebrains dans une boîte de Petri propre sur la glace avec un tampon de dissection. </li><li> Prenez quelques hémisphères dans une nouvelle boîte de Pétri avec un tampon de dissection froide pour enlever soigneusement les méninges des forebrains sous un stéréomicroscope avec N ° 5 des pinces courbes. Ensuite, nettoyer l&#39;intérieur du cerveau pour enlever la couette de la myéline et obtenir une enveloppe de cortex. Ces mesures ne devraient pas prendre plus de 2 heures pour la préservation des tissus et la survie cellulaire. </li><li> Dissocier le cortex du cerveau en 3 6 ml de tampon de dissection froide dans un 7 ml DOUNCE homogénéisation par 10 de haut en bas coups avec chacun des deux pilons de différents jeux, 71 pm suivie par 20 um. </li><li> Diviser la suspension pour obtenir l&#39;équivalent d&#39;une cortex dans 1 ml d&#39;un tube Falcon de 50 ml et centrifuger à 1000 g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant. </li><li> Digérer la suspension de 1 cortex avec 1 ml d&#39;une solution enzymatique contenant un mélange de collagénase / dispase (60 ug / ml R11; 0,3 U / ml), la DNase de type I (35 ug / ml - 20 K unités / ml) et de la gentamicine (50 pg / ml) dans un agitateur pendant 30 minutes à 37 ° C. </li><li> Mélanger le 1 ml de digérer 1 cortex avec 10 ml de 25% de BSA / HBSS 1X et séparé par centrifugation dépend de la densité à 3600 g pendant 15 min à température ambiante. Transférer délicatement le disque supérieur (la myéline et le parenchyme cérébral) et le surnageant dans un 50 ml tube Falcon propre et répéter la centrifugation. Gardez le culot obtenu contenant les microvaisseaux du cerveau à 4 ° C. </li><li> Prenez soin de le disque supérieur et le surnageant. Reprendre les culots résultants contenant les microvaisseaux du cerveau avec 1 ml de HBSS 1X froid et transférer dans un 50 ml tube Falcon propre. </li><li> Laver les microvaisseaux par addition de 20 ml de HBSS 1X froid et centrifuger à 1000 g pendant 5 min. Jeter le surnageant. </li><li> Digérer en outre les microvaisseaux du cortex une avec 1 ml de la même solution enzymatique telle que décrite dans l&#39;étape 2.9 pendant 1 heure à 37 ° C dans un shAker. </li><li> Ensuite, mélanger les microvaisseaux digérés à partir de chacun des trois cortex dans un tube et en outre séparer en deux 50 ml tubes Falcon pour obtenir des microvaisseaux extraites à partir de l&#39;équivalent d&#39;une fois et demie (1,5) cortex par tube. Ajouter 30 ml de tampon de dissection froid et centrifuger à 1000 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension le culot de microvaisseaux dans 10 ml de DMEM/F12 supplémenté avec 20% de plaquettes bovine plasma pauvre en sérum dérivé, fibroblastes facteur de croissance basique (bFGF, 2 ng / ml), de l&#39;héparine (100 ug / ml), de la gentamicine (50 pg / ml) et HEPES (2,5 mM), du nom de support de cellules endotheliales (ECM) supplémenté avec de la puromycine à 4 pg / ml. </li><li> Prendre les deux flacons T75 revêtues de l&#39;incubateur, aspirer l&#39;excès de revêtement et de la plaque les microvaisseaux de chaque tube dans un flacon T75 (des microvaisseaux extraits de cortex 1,5 par flacon T75). </li></ol> 3. Purification et la prolifération des RBEC Primocultures <ol><li> Purification: du mercredi au vendredi, ajouter puromycin à 4 pg / ml de milieu de culture. Changer le support le jeudi. Le vendredi, laver les cellules et ajouter puromycine à 2 pg / ml jusqu&#39;à lundi. </li><li> Prolifération: le lundi de la deuxième semaine, laver les cellules et ajouter de l&#39;insuline, de la transferrine et le supplément de sélénite de sodium pour les milieux de culture jusqu&#39;à ce que les cultures atteignent 90% de confluence le mercredi de la deuxième semaine. </li></ol> . 4 Différenciation: Mise en place du modèle in vitro du Bureau <ol><li> Lundi de la deuxième semaine, préparer filtres (polyéthylène, 12 puits, la taille des pores 1,0 um) par enrobage avec un mélange de collagène de type IV et de la fibronectine à la fois à 0.5μg/cm 2 dans l&#39;eau de culture stérile (500 pi de mélange dans le compartiment supérieur et 1,5 ml d&#39;eau stérile de culture dans le compartiment inférieur). Laisser adhérer à 37 ° C jusqu&#39;à ce que RBEC semis. </li><li> Lundi de la deuxième semaine, cinq jours avant la création de la co-culture, dégeler les astrocytes de cryotubes à 37 ° C et le transfertdans 15 ml Falcon avec 10 ml GCM. Centrifuger la suspension à 120 g pendant 8 min à température ambiante. </li><li> Reprendre le culot dans des astrocytes et GCM plaque à une densité de 30 x 10 3 cellules par cm 2 dans des plaques à 12 puits. </li><li> Mercredi de la deuxième semaine, juste avant la dissociation de RBEC avec de la trypsine, laver deux fois le filtre de pré-enduit avec du milieu DMEM/F12. Pré-remplir les chambres avec ECM: 1,5 ml dans le compartiment inférieur et 0,5 ml dans le compartiment supérieur. </li><li> Mercredi de la deuxième semaine, laver deux fois avec du DPBS RBEC sans calcium et magnésium. Ajouter 4 ml de trypsine 0,05% chaud - EDTA solution de 0,02% à 37 ° C par flacon T75 pendant 30 secondes exactement. Ensuite, retirer 3,5 ml de solution de trypsine et observer au microscope. Lorsque la couche de cellules commence à se détacher de la matrice, les aider à en tapotant doucement le bord du flacon T75 jusqu&#39;à ce que toutes les cellules sont flottantes. </li><li> Ajouter 9 ml d&#39;ECM par flacon T75 et transférer dans un tube Falcon de 15 ml. Très dissocier doucement la cellulesuspension par pipetage de haut en bas quatre fois avec une pipette de 10 ml, muni d&#39;un embout jaune (éviter la production de bulles dans la solution). Compter les cellules dans la suspension (environ 3 x 10 6 cells/T75) et de la plaque immédiatement sur ​​des filtres de pré-revêtues et pré-remplis à haute densité (160 x 10 3 cellules / filtre donc environ 18 filters/T75) (Figure 8 ). Le lendemain (jeudi), changer deux fois la moyenne du compartiment supérieur pour éliminer les débris cellulaires. </li><li> Jeudi de la deuxième semaine, la veille de la création de la co-culture, remplacer le milieu de culture des astrocytes par 1,5 ml de milieu de différenciation (ECM avec hydrocortisone à 500 nM) qui peuvent être complétés par des tiers milieu conditionné du compartiment basal d&#39;une précédente co-culture (3 jours de contact entre les cellules endothéliales et les astrocytes). </li><li> Vendredi de la deuxième semaine est défini comme le jour 0 de différenciation; remplacer le milieu de culture à partir de la conta filtresining la RBEC avec les médias de différenciation. Transférer les filtres de RBEC dans les puits contenant les astrocytes. Dans ces conditions, des modèles in vitro se différencient et expriment des protéines liées à jonction-dans les 3 jours. </li><li> Les modèles gardent leur différenciation optimale pendant 3 jours, entre le lundi et le mercredi de la troisième semaine. </li></ol>

Michel Khrestchatisky est directeur du laboratoire UMR7259, co-fondateur et conseiller scientifique de la société de biotechnologie VECT-HORUS.

De nombreux médicaments développés pour traiter le système nerveux central (SNC) ne parviennent pas à le parenchyme cérébral à des concentrations thérapeutiques pertinentes. La BHE protège les tissus nerveux du cerveau à partir de la fluctuation de la composition du plasma, à partir d&#39;agents pathogènes, et maintient l&#39;homéostasie du parenchyme cérébral, en limitant le flux non spécifique des ions, des peptides, des protéines et même des cellules dans et hors du cerveau 1. Caractéristiques BBB sont induite et maintenue par la proximité intime et la diaphonie entre les classes spécialisées des cellules endothéliales des microvaisseaux cérébraux et des éléments voisins de l&#39;unité neuro-glie-vasculaire (NGVU) comme les neurones, les cellules gliales (plus précisément astrocytes fin-pieds), et péricytes ensheathed dans la membrane basale, qui se compose essentiellement de collagène de type IV, la fibronectine, la laminine et les protéoglycanes 2,3. Péricytes couvrent environ 22 - 32% de l&#39;endothélium au niveau des capillaires et jouent un rôle importantrôle dans la régulation de l&#39;endothélium prolifération, l&#39;angiogenèse et des processus inflammatoires. Les cellules endotheliales forment une nappe continue couvrant la surface interne des capillaires. Ils sont reliés entre eux par JT, qui forment une structure en forme de bande à la région apicale et qui contribuent à la cellule de polarisation. Les astrocytes régulent les propriétés et BBB sont des sources de facteurs de régulation importants tels que le TGF-β, du GDNF, du bFGF et de l&#39;IL-6. Astrocytes déficientes en GFAP avec des fonctionnalités incomplètes ne sont pas en mesure de réglementer BBB propriétés 4. Les neurones ne sont pas directement impliqués dans la formation de structure de la BHE, mais également des aspects importants de réguler l&#39;expression des protéines et les fonctions BBB 5. Afin d&#39;étudier davantage la structure, la physiologie et la pathologie du Bureau, des modèles in vitro du Bureau ont été développées comme outils de recherche. les cellules endothéliales de cerveau ont été extraits de diverses espèces de mettre en oeuvre dans les modèles in vitro basé BBBde faibles cultures primaires de passage de bovin 6,7, 8,9 porcine, rat 10,11,12, 13 souris et aussi humain 14,15. Ces modèles sont connus pour imiter le Bureau vivo dans, en particulier lorsqu&#39;ils sont co-cultivées avec des cellules gliales de rat ou de souris et / ou de péricytes, 16,12 et / ou des astrocytes dérivées de cellules progénitrices neurales 17 et / ou 18 neurones. Les modèles &quot;de laboratoire&quot; en sont souvent fabriqués à partir de rongeurs car ils permettent à des expériences in vitro et des comparaisons et / ou l&#39;étude des cellules endothéliales de cerveau produites à partir de modèles transgéniques / 19 in vivo. Nouvellement développé des modèles in vitro BBB ont également été conçus pour aider à prévoir cerveau absorption de médicaments potentiels SNC candidats avant le test in vivo 15,20,21,3,6,22,11,23. Modèles in vitro BBB sont généralement utilisés pour comparer le transport de la drogue avec: i) la pénétration connu dans le SNC ou avec low perméabilité à travers la barrière hématoencéphalique et aucun des effets centraux, et ii) la Pe apparente des mêmes médicaments mesurées dans des modèles animaux de la même espèce. Les médicaments qui passent facilement la BBB sont principalement lipophiles et traversent les membranes des cellules endothéliales du cerveau par diffusion libre médiée par un lipide (caféine, la carbamazépine, etc.) Les médicaments transportés négativement tels que la digoxine, le vérapamil ou la cyclosporine A sont activement extrudées par endothéliales cérébrales transporteurs d&#39;efflux telles que la P-gp. Cependant, la plupart des molécules thérapeutiques nouvellement développés sont produits biopharmaceutiques, tels que les protéines recombinantes, siRNA ou des anticorps monoclonaux. La plupart d&#39;entre eux ne traversent pas la BBB en raison de: i) l&#39;absence de transporteurs spécifiques, et ii) la couche serrées des cellules endotheliales, qui empêchent les molécules de poids moléculaire élevé de subir passage paracellulaire. Avec ces limites, les stratégies &quot;Troie de cheval&quot; ont été mis en œuvre en utilisant des vecteurs (anticorps, peptides) contre les récepteurs connus au Bureau, impliqués in médiée par le récepteur du transport ou de transcytose (RMT), tels que la transferrine (Tf) récepteur (TfR), le récepteur de l&#39;insuline (IR), ou des membres du récepteur des LDL (LDLR), liés à la famille du récepteur (LDLR, LRP1). Ces récepteurs ont été trouvés sur isolés capillaires du cerveau et dans le Bureau in vivo 24,25. Les profils de transcription pour ces récepteurs, en particulier ceux de la famille LDLR, ont été analysés et comparés entre les cellules endothéliales cérébrales et cellules endothéliales cérébrales co-cultivées avec des astrocytes ou des capillaires du cerveau directement après leur extraction à partir de cerveau 26. Pardridge 24 a ouvert le champ avec l&#39;anticorps OX-26 contre le récepteur de la transferrine (TfR), suivis par des anticorps dirigés contre le récepteur de l&#39;insuline et le récepteur du facteur de croissance de type insuline 27,28. Avec ces vecteurs de base d&#39;anticorps, ArmaGen Technologies a développé un cheval de Troie moléculaire technologie de plate-forme de cheval du Bureau pour fournir des médicaments, y compris les protéines, à travers le Bureau 29. Lalittérature est riche en données montrant l&#39;expression de LRP1 dans des cellules endothéliales de cerveau et de son rôle en tant que récepteur d&#39;endocytose / scavenger puissant. L&#39;analyse Western blot a suggéré que LRP1 est exprimée en fractions enrichies dans des capillaires du cerveau et dans le cerveau de rat cellules endothéliales capillaires 30. Des sociétés telles que AngioChem cible LRP1 avec des vecteurs peptidiques dérivées de l&#39;aprotinine qui favorisent efficace afflux de drogues à travers le Bureau 31. Cependant, LRP1 est également impliquée dans le transport actif de Aß et son efflux / jeu de parenchyme cérébral à sang 32. Ces données impliquent LRP1 dans un transport bidirectionnel à travers le Bureau en fonction de ses ligands. biOasis développe la technologie de Transcend utilisant un mélanotransferrine de protéine pour le transport de produits biologiques tels que des enzymes lysosomales et des anticorps à travers la BHE 33 tandis que VECT-HORUS développe des vecteurs peptidiques qui ciblent le LDLR 34. Il données suggère que le PRL et LDLR peuvent être utilisés pour le transport de diffmolécules érents tels que les enzymes lysosomales 35,36 ou complexes de nanoparticules à travers la BHE 37. Notre champ d&#39;intérêt est l&#39;administration de médicaments pour le système nerveux central en utilisant des molécules de vecteur et de candidats-médicaments vectorisés pour le traitement des maladies du système nerveux central. En particulier, l&#39;administration de médicaments à travers la BHE doit être considérée dans le contexte de la neuro-inflammation, un processus qui peut varier dans son étendue, mais qui est probablement commun à toutes les lésions et les maladies du système nerveux central, y compris l&#39;encéphalite, la sclérose en plaques, la maladie d&#39;Alzheimer, etc Neuroinflammation est associée à l&#39;inflammation du Bureau et potentiellement à des changements dans la physiologie du Bureau et de la perméabilité paracellulaire et considérant que le transport transcellulaire peuvent être amplifiés dans des conditions pathologiques 38,39,40,41,42,43. Par exemple, le TNF-α, tordre, et d&#39;autres cytokines modulent l&#39;inflammation, et des expériences avec des modèles in vitro à BBB ont montré qu&#39;ils peuvent modifier les propriétés de paracellulaires ee monocouche de cellules endothéliales 38,39,40 et que le TNF-α conduit également à une augmentation du transport transcellulaire de LDL 41, holotransférrine 42 et 43 de la lactoferrine. Notre objectif était de développer et caractériser un optimisée et syngénique de rat hautement reproductible modèle du Bureau en utilisant des co-cultures de cellules primaires endothéliales cérébrales et les astrocytes. Nous avons utilisé cinq semaines vieux et néonatale rats Wistar pour la production de cellules endothéliale du cerveau et de la production des astrocytes respectivement. Un défi a été d&#39;établir un protocole permettant la production de modèles BBB &quot;hebdomadaire reproductibles». Pour atteindre cet objectif, chaque étape du protocole de production a été réalisée à des jours fixes de la semaine, à partir de la production cerveau des microvaisseaux le mercredi de la première semaine. Les dissections ont été réalisées presque chaque semaine au cours des 3 dernières années. Pour améliorer encore la reproductibilité des cultures, un système d&#39;assurance de la qualité a été créé. Tous Reagents et les produits chimiques ont été référencés dans une base de données (date d&#39;entrée, stock, la date d&#39;expiration, etc.) Le modèle a été caractérisée après un certain nombre de critères, tels que l&#39;organisation des cellules endothéliales et la pureté, TEER, LY perméabilité, la réponse aux agents pro-inflammatoires, l&#39;expression qualitative et quantitative des protéines TJ, la fonctionnalité des transporteurs d&#39;efflux telles que la P-gp, et les récepteurs impliqués dans la transcytose à travers la monocouche de cellules endotheliales tels que le TfR ou le LDLR.

<table><tbody><tr><td>BSA fraction V faible teneur en endotoxine</td><td>PAA</td><td>K45-011-500g</td><td>4 &deg ; C&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122-20</td> <td>&deg ; C</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054-20</td> <td>&deg ; C</td></tr><tr><td>DMEM hyperglucose</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td>4 &deg ; C&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Invitrogen</td><td>10270-098-20</td> <td>&deg ; C / 1 an</td></tr><tr><td>T75 flacons</td><td>Becton Dickinson Falcon</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer (1 M)</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>4 &deg ; C / 1 an</td></tr><tr><td>Collagène de type IV souris (10 x 1 mg)</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>356233-20 &deg ; C / 1 mois</td></tr><tr><td>Fibronectine plasma humain (5 mg)</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>356008-20 &deg ; C / 1 mois</td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort Vannas, droits (9 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux, droits (9 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont #5/45 (11 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps, largeur de pointe 0,8 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps, courbe largeur de pointe 0,8 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Collagénases / dispase mix (2 x 5 mg)</td><td>Roche Diagnostics</td><td>05 401 054 001-20</td> <td>&deg ; C / 3 mois</td></tr><tr><td>DNase I (100 mg / 569 KU / mg)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25-100</td> <td>mg-20 &deg ; C / 1 an</td></tr><tr><td>Gentamicine (10 mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15710-049</td><td>4 &deg ; C / 1 an</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>31331-028</td><td>4 &deg ; C&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sérum bovin à partir de plasma pauvre en plaquettes (500 ml)</td><td>Clinisciences</td><td>BT-214-100-20</td> <td>&deg ; C / 1 an</td></tr><tr><td>bFGF (10 &micro ; g)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029-20</td> <td>&deg ; C / 6 mois</td></tr><tr><td>Sel d’héparine Na de muqueuse porcine Grade I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td>4 &deg ; C / 1 an</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833-10</td> <td>mg-20 &deg ; C / 6 mois</td></tr><tr><td>ITSX</td><td>Invitrogen</td><td>51500-056</td><td>4 &deg ; C / 1 an</td></tr><tr><td>Insert de cellule suspendue en polyéthylène pour plaques à 12 puits</td><td>Millipore</td><td>PIRP15R48</td><td>Porosité : 1 & micro ; m Surface : 1,1 cm2</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888-1</td> <td>g-20 &deg ; C / 1 an</td></tr><tr><td>Souris anti-CD31 / PECAM&nbsp ;</td><td>Chemicon</td><td>MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL)</td><td>1/200 - fixation PFA 4 %</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Von Willebrand</td><td>Chemicon</td><td>AB7356</td><td>1/200 - fixation PFA 4 %</td></tr><tr><td>Souris anti-Desmine</td><td>Chemicon</td><td>MAB3430</td><td>1/200 - fixation PFA 4 %</td></tr><tr><td>Souris anti-Vimentine</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>08-0052 clone V9, (58 &micro ; g/ml)&nbsp ;</td><td>1/50 - fixation PFA 4 %</td></tr><tr><td>Souris anti-Claudin-5</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>35-2500, (500 &micro ; g/ml)</td><td>1/200 - fixation PFA 4 %</td></tr><tr><td>Lapin anti-ZO-1</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>61-7300 (250 &micro ; g/ml)</td><td>1/200 - fixation PFA 4 %</td></tr><tr><td>Anti-Occludine pour lapin&nbsp ;</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>71-1500 (250 & micro ; g/ml)</td><td>1/200 - fixation PFA 4 %</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488, 594 anticorps secondaires conjugués</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>1/800</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH, sel de dilithium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L0259-20</td> <td>&deg ; C</td></tr><tr><td>TNF-alpha humain</td><td>PeproTech</td><td>300-01A-20</td> <td>&deg ; C</td></tr><tr><td>Rat MCP-1 Kit ELISA</td><td>PeproTech</td><td>900-K59</td><td>4 &deg ; C / -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Souris anti-glycoprotéine P</td><td>Covance, Eurogentec</td><td>SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL)</td><td>1/400 - fixation PFA 4 % 1/200 (western blot)</td></tr><tr><td>Lapin anti-GLT-1</td><td>Abcam</td><td>ab41621</td><td>1/1,000 (western blot)</td></tr><tr><td>Rhodamine 123</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83702</td><td>4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de vérapamil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V4629</td><td>4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Cyclosporine A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30024</td><td>4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Récepteur monoclonal de la macroglobuline anti-a2 (CD91, LRP1) contre la chaîne b de l’acide aminé 4291-4344 dans une répétition de l’EGF</td><td>American Diagnostica</td><td>3501 (100 &micro ; g/ml)</td><td>1/5 - fixation PFA 4 %</td></tr><tr><td>Souris anti-LDLR</td><td>R& D systems</td><td>AF2255 (200 & micro ; g/ml)</td><td>1/50 - fixation PFA 4 %</td></tr><tr><td>Rat transferrin-Cy3</td><td>Gentaur</td><td>JOR160050</td><td>4 &deg ; C</td></tr><tr><td>DiILDL</td><td>Invitrogen</td><td>L-3482</td><td>4 &deg ; L</td></tr></tbody></table>

mise en place d&#39;un<em&gt; in vitro</em&gt; modèle de rat barrière hémato-encéphalique (bhe): un regard sur le bureau imperméabilité et de transport médié par le récepteur

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

La barrière hémato-encéphalique (BBB) ​​régule spécifiquement flux moléculaire et cellulaire entre le sang et le tissu nerveux. Notre objectif était de développer et de caractériser un syngénique de rat hautement reproductible modèle in vitro de la BHE en utilisant des co-cultures de cellules endothéliales de cerveau de rat primaires (RBEC) et les astrocytes pour étudier les récepteurs impliqués dans la transcytose à travers la monocouche de cellules endothéliales. Les astrocytes ont été isolés par dissection mécanique après digestion de la trypsine et ont été gelés pour la co-culture plus tard. RBEC ont été isolés à partir de 5 semaines d&#39;âge cortex de rat. Les cerveaux ont été nettoyés des méninges et de la substance blanche, et dissociées mécaniquement après digestion enzymatique. Ensuite, l&#39;homogénat a été centrifugé dans les tissus de l&#39;albumine de sérum bovin pour séparer les fragments de vaisseaux à partir de tissu nerveux. Les fragments de navires ont subi une deuxième digestion enzymatique des cellules endothéliales libres de leur matrice extracellulaire. Les cellules contaminantes restantes telles que les pericytes ont été Futres éliminé par l&#39;étalement des fragments de microvaisseaux dans un milieu contenant la puromycine. Elles ont ensuite été soumises à des passages sur des filtres pour la co-culture avec des astrocytes cultivés sur le fond des puits. RBEC exprimé des niveaux élevés de jonctions serrées (TJ) des protéines telles que occludine, claudine-5 et ZO-1 avec une localisation typique aux frontières cellulaires. La résistance électrique transendothéliale (TEER) de cerveau monocouches endothéliales, indiquant l&#39;étanchéité du JT atteint 300 ohms · cm 2 en moyenne. Les coefficients de perméabilité endothéliale (Pe) pour le jaune lucifer (LY) était très reproductible avec une moyenne de 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. les cellules endothéliales de cerveau organisés en monocouches ont exprimé le transporteur d&#39;efflux P-glycoprotéine (P-gp), ont montré un transport polarisé de la rhodamine 123, un ligand de P-gp, et ont montré transport spécifique de la transferrine-Cy3 et DiILDL à travers la monocouche de cellules endothéliales. En conclusion, nous proposons un protocole pour la mise en place in vitroModèle du Bureau qui est hautement reproductible en raison des méthodes d&#39;assurance de la qualité, et qui est approprié pour la recherche sur les transporteurs et les récepteurs BBB.

Le but de la présente étude était de valider la reproductibilité d&#39;un modèle in vitro du Bureau impliquant un rat syngénique de co-culture de cellules endotheliales et les astrocytes. La monocouche de cellules endothéliales présenté TEER haute et basse perméabilité LY. L&#39;expression de protéines spécifiques TJ, les réponses fonctionnelles de l&#39;inflammation et de la fonctionnalité des transporteurs et récepteurs ont été évalués.

Mise en place d&#39;un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle de Rat barrière hémato-encéphalique (BHE): un regard sur le Bureau imperméabilité et de transport médié par le récepteur

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

L'objectif général de cette procédure est de mettre en place un modèle in vitro hautement reproductible de la barrière hémato-encéphalique de rat. Cette étape est réalisée en retirant les nerfs optiques, le cervelet et les méninges au microscope stéréo, puis en séparant les deux hémisphères cérébraux et en les disséquant afin d'obtenir un fragment de cortex pur. La deuxième étape consiste à isoler les microvaisseaux du cortex par un traitement enzymatique et une centrifugation selon la densité.Ensuite, les microvaisseaux sont ensemencés et incubés avec de la puromycine afin de purifier les cellules endothéliales en éliminant les cellules contaminantes telles que les parasites. Les cultures pures de cellules endothéliales cérébrales prolifèrent jusqu'à ce que les cellules atteignent une confluence de 90 %. La dernière étape consiste à induire la différenciation des cellules endothéliales cérébrales de rat en plaçant les cellules dans la chambre supérieure des filtres à inserts et en les cultivant en co-culture avec des astrocytes de rat préalablement préparés et ensemencés.En fin de compte, la monocouche de cellules endothéliales cérébrales différenciées peut être caractérisée par l'expression de protéines spécifiques des jonctions serrées et par l'indice de perméabilité d'un composé de référence à travers la monocouche de cellules endothéliales depuis le compartiment supérieur. Les modèles in vitro de la BHE, tels que celui présenté ici, sont utiles pour explorer la distribution cellulaire de molécules clés et pour élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires fondamentaux du fonctionnement de la BHE. En particulier, de tels modèles permettent d'étudier les récepteurs de la BHE et leur implication dans le trafic endocytique et la transcytose, dans notre cas.Les modèles in vitro de la BHE sont principalement utilisés pour étudier le ciblage de récepteurs spécifiques à l'aide de vecteurs peptidiques que nous développons. Afin de faciliter la distribution de médicaments vers le SNC à travers la BHE, nous utilisons un processus appelé transcytose médiée par récepteur, également connu sous le nom d'approche du cheval de Troie. La description visuelle est essentielle, car les personnes novices dans cette méthode devront posséder des compétences en dissection et disposer d'un microscope suffisamment rapide et précis pour assurer la survie des tissus durant le processus de production cellulaire.Un autre point essentiel est la fin prématurée de la zone fragile et de la région du saumon téléostéen afin d'éviter l'ouverture de la barrière pendant les expérimentations. Enfin, cette approche mettra en évidence les détails du protocole qui feront la différence entre des protocoles rouges et visualisés, démontrant que la procédure sera réalisée par mes soins et par mon collègue. Commencez cette procédure en recouvrant deux flacons T75 de collagène de type IV et de fibronectine à une concentration d'un microgramme par centimètre carré dans de l'eau de culture stérile, puis laissez-les adhérer dans l'incubateur à 37 degrés Celsius jusqu'au semis des microvaisseaux.Deux jours plus tard, retirer le cerveau du crâne de trois rats Vista âgés de cinq semaines et transférer les cerveaux dans une boîte de Pétri remplie de tampon de dissection froid placée sur de la glace. Dissecter les cerveaux en enlevant le cervelet et les nerfs optiques. Ensuite, couper chaque cerveau en deux pour séparer les deux hémisphères cérébraux sous un microscope stéréo.Effectuez une autre incision pour retirer le mésencéphale et transférez les quatre cerveaux dans une boîte de Pétri propre placée sur de la glace avec du tampon de dissection. Ensuite, transférez un prosencéphale dans une nouvelle boîte de Pétri remplie de tampon de dissection froid. Maintenez-le avec une pince et détachez soigneusement les méninges des bords du prosencéphale.Ensuite, retournez le cerveau antérieur et retirez soigneusement les méninges sans les déchirer. Assurez-vous que le cerveau antérieur est entièrement débarrassé des méninges, puis sectionnez la partie restante des nerfs optiques. L'objectif de cette étape est d'éliminer la couche de substance blanche afin d'obtenir une enveloppe de cortex.Commencez par pincer le cerveau antérieur sur le bord, puis faites glisser délicatement la pince le long de la surface, en prenant soin de ne pas déchirer la surface du cortex. Ensuite, vérifiez que le cerveau est débarrassé des méninges en le retournant pour vous assurer qu’il ne reste aucune méninge résiduelle ni aucun gros vaisseau sanguin en surface. Ensuite, à compter de l’extraction des trois cerveaux de leur crâne, la durée totale de la dissection ne doit pas dépasser deux heures afin de préserver les tissus et assurer la survie cellulaire.Transférez les corticaux de trois cerveaux dans six millilitres de tampon de dissection froid dans un homogénéisateur en verre de sept millilitres, puis dissociez les corticaux à l’aide de 10 mouvements verticaux avec le premier pilon à jeu plus large, suivis de 10 mouvements verticaux avec le second pilon à jeu plus étroit. Ensuite, transférez six millilitres de la suspension dans un nouveau tube Falcon de 50 millilitres et rincez l’homogénéisateur en verre avec 24 millilitres de tampon de dissection froid. Répartissez la suspension en trois tubes Falcon afin d’obtenir l’équivalent d’un cortex par tube. Par la suite, centrifugez à 1000 G pendant cinq minutes à température ambiante.L'observation du culot montre un gradient de couleur rose, qui représente la partie des microvaisseaux des corticales. À présent, jeter le surnageant et homogénéiser le culot d'une corticale avec un millilitre de solution enzymatique contenant un mélange de collagénases Dyse, d'ADN de type I et de gentamicine. Placer les tubes dans un agitateur pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.Ensuite, mélanger un millilitre de digest avec 10 millilitres de BSA-HBSS 25 % à une concentration 1 X, puis vortexer doucement les tubes avant de les séparer par centrifugation de gradient de densité à 3 600 ×g pendant 15 minutes à température ambiante. Après la centrifugation dépendante de la densité, le culot contient les microvaisseaux et le disque supérieur contient la myéline, le parenchyme cérébral et les microvaisseaux résiduels. Transférer soigneusement le disque supérieur et le surnageant dans des tubes Falcon propres de 50 millilitres.Veillez à ne pas aspirer le culot de microvaisseaux ; vortexez délicatement le tube et répétez la centrifugation selon la densité lors de la deuxième centrifugation. Conservez le culot obtenu contenant les microvaisseaux à quatre degrés Celsius. Après la deuxième centrifugation selon la densité, éliminez soigneusement le disque supérieur et le mélange surnageant, puis resuspendez les culots obtenus contenant les microvaisseaux provenant des deux centrifugations dans un millilitre de HBSS froid une fois.Ensuite, lavez les microvaisseaux avec 20 millilitres de HBSS froid une fois et centrifugez à 1000 g pendant cinq minutes. Puis jetez le surnageant en prenant soin de ne pas perdre les microvaisseaux. Homogénéisez le culot de microvaisseaux provenant d'un cortex avec un millilitre de la même solution enzymatique, après un vortex doux des tubes.Poursuivre la digestion des microvaisseaux pendant une heure à 37 degrés Celsius dans un agitateur. Ensuite, mélanger les microvaisseaux digérés provenant des trois cortex dans un seul tube. Répartir à nouveau le mélange dans deux tubes Falcon de 50 millilitres afin d'obtenir les microvaisseaux extraits de l'équivalent d'un cortex et demi par tube.Ensuite, centrifuger à 1 000 G pendant cinq minutes. À température ambiante, juste avant de semer les microvaisseaux, sortir deux flacons T75 revêtus de l’incubateur et aspirer l’excès de revêtement. Jeter le surnageant et resuspendre le culot de microvaisseaux dans un millilitre de MEC, puis compléter chaque tube à 10 millilitres avec du MEC supplémenté de quatre microgrammes par millilitre.Pur mycine pour commencer le processus de purification et ensemencer les microvaisseaux dans le flacon. Ensuite, placer les flacons dans l'incubateur à 37 degrés Celsius et 5 %CO₂ afin de permettre l'adhésion des microvaisseaux à la matrice de collagène et de fibronectine, puis poursuivre le processus de purification. Vingt-quatre heures après l'ensemencement des microvaisseaux, rincer les débris cellulaires avec un milieu ECM frais et remplacer le milieu de culture par du milieu ECM supplémenté avec quatre microgrammes par millilitre de pur mycine jusqu'au jour cinq, dans l'incubateur à 37 degrés Celsius et 5 %CO₂. Vingt-quatre heures après l'ensemencement des microvaisseaux, les cellules endothéliales commencent à migrer et à s'étendre sur la matrice de collagène et de fibronectine. Au jour cinq, pour terminer le processus de purification, rincer les débris cellulaires avec un milieu ECM frais et remplacer le milieu de culture par du milieu ECM supplémenté avec deux microgrammes par millilitre.Puramycine pendant trois jours supplémentaires pour la prolifération. Au huitième jour, lavez les cellules et ajoutez de l'insuline, de la transferrine et du sélénite de sodium. Complétez le milieu de culture jusqu'à ce que les cultures atteignent une confluence de 90 % au dixième jour.Le huitième jour, préparez les filtres de trois plaques de 12 puits en les recouvrant d'un mélange de collagène de type IV et de fibronectine, chacun à une concentration de 0,5 microgramme par centimètre carré, dans de l'eau de culture stérile. Commencez par ajouter 1,5 millilitre d'eau de culture stérile dans le compartiment inférieur.Ensuite, ajouter 0,5 millilitre de mélange dans le compartiment supérieur. Laisser la matrice adhérer à 37 degrés Celsius jusqu'à la mise en culture des cellules endothéliales le même jour, cinq jours avant l'établissement de la co-culture. Décongeler les astrocytes à partir des cryotubes à 37 degrés Celsius et transférer les cellules dans un tube conique de 15 millilitres contenant 10 millilitres de GCM centrifugé.Suspendre à 120 G pendant huit minutes à température ambiante. Ensuite, resuspendre le culot d'astrocytes dans du milieu de culture glial (GCM) et ensemencer à une densité de 30 000 cellules par centimètre carré. Placer les plaques 12 puits dans l'incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % CO2, au jour 10, juste avant la dissociation des cellules endothéliales cérébrales (RBEC) par la trypsine.Lavez le filtre pré-codé avec du milieu DMM F 12, pré-remplissez les chambres avec de la MEC et replacez-les dans l’incubateur jusqu’au moment du semis des RBEC le même jour. Lavez les RBEC deux fois avec du DPBS sans calcium ni magnésium. Ajoutez quatre millilitres de solution de trypsine-EDTA tiède par flacon T 75 à 37 degrés Celsius pendant exactement 30 secondes, puis retirez 3,5 millilitres de la solution de trypsine-EDTA.Veiller à ce qu'une couche de trypsine-EDTA recouvre toujours les cellules endothéliales. Ensuite, suivre le détachement des cellules par observation au microscope. Lorsque la couche cellulaire commence à se détacher de la matrice, tapoter doucement le bord du flacon T 75 jusqu'à ce que toutes les cellules flottent. Ajouter trois millilitres de milieu ECM dans chaque flacon T 75 et transférer dans un tube Falcon de 50 millilitres. Répéter cette étape deux fois, en rinçant le milieu pour récupérer toutes les cellules.Dissocier très doucement la suspension cellulaire en aspirant et en expulsant quatre fois à l’aide d’une pipette de 10 millilitres équipée d’une pointe jaune. Compter les cellules dans la suspension et les ensemencer immédiatement le jour suivant à forte densité sur les filtres pré-codés et pré-remplis. Changer deux fois le milieu du compartiment supérieur afin d’éliminer les débris cellulaires et ainsi éviter toute perturbation de la monocouche cellulaire lors du remplacement du milieu. Inclinez légèrement la plaque et ne rapprochez jamais la pipette d'aspiration jusqu'à ce qu'il reste toujours un peu de milieu au-dessus de la monocouche cellulaire, afin d'éviter le dessèchement de la monocouche cellulaire lors du remplacement du milieu. Lavez uniquement six inserts à la fois. Vingt-quatre heures après le semis, la monocouche cellulaire doit être confluentes.Ensuite, le même jour et un jour avant la mise en place de la co-culture, remplacer le milieu de culture des astrocytes par 1,5 millilitre de milieu de différenciation supplémenté au jour 12, considéré comme le premier jour de différenciation. Remplacer le milieu de culture des filtres contenant les RBEC par du milieu de différenciation. Puis transférer les filtres RBEC dans les puits contenant les astrocytes dans ces conditions.Les modèles in vitro différencient et expriment des protéines liées aux jonctions en trois jours, et la différenciation optimale persiste pendant trois jours supplémentaires. Ici, la monocouche cellulaire a été immunomarquée à l’aide de menton afin de révéler une monocouche confluente de cellules endothéliales cérébrales présentant une morphologie sans recouvrement, des cellules typiquement en fuseau avec une morphologie endothéliale, ainsi que l’expression de protéines des jonctions serrées, notamment ZO-1 et occludine. L’intégrité de la monocouche dans le modèle de BBB à 12 puits a été évaluée en mesurant le transport du jaune de lucifère.Les résultats sont exprimés en perméabilité ou PE en 10 à la puissance moins trois centimètres par minute, et la barrière est considérée comme perméable ou ouverte lorsque le PE du LY est supérieur à 0,6 × 10⁻³ cm/min. Au cours des dernières décennies, de nombreuses publications et revues ont fourni des informations sur les modèles in vitro statiques et dynamiques de BBB provenant de différentes espèces. Toutefois, ces modèles restent difficiles à manipuler, et la reproductibilité de la qualité de la barrière demeure un objectif majeur à atteindre.Après avoir visionné cette vidéo, les scientifiques devraient bien comprendre comment produire et caractériser un modèle in vitro de la BHE.

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