Profilage de microARN œstrogène réglementés dans les cellules du cancer du sein

Moléculaire de signalisation par des œstrogènes et les microARN sont essentiels dans le développement du cancer du sein et de la croissance. L'œstrogène active les récepteurs d'oestrogène, qui sont des facteurs de transcription. De nombreux facteurs de transcription peuvent réguler l'expression de microARN, et microARN régulés par les œstrogènes peuvent être profilée en utilisant différentes techniques de grande envergure.

L’objectif global de cette procédure est de définir les microARN que les récepteurs d’œstrogènes peuvent réguler. Ceci est accompli en préparant d’abord les cellules pour une réponse œstrogénique maximale par culture jusqu’à une confluence et un épuisement optimaux de l’activité œstrogénique. La deuxième étape consiste à induire l’activité transcriptionnelle des récepteurs d’œstrogènes par un traitement à l’œstradiol pendant le nombre requis de points temporels.

Des contrôles appropriés sont inclus pour les comparaisons. Ensuite, l’ARN, y compris la population de micro-ARN, est extrait et converti en CD NA connu régulé par l’œstrogène. Les gènes cibles sont ensuite mesurés à l’aide de la QPCR pour confirmer que le protocole de traitement a réussi.

La dernière étape consiste à déterminer le profil d’expression des micro-ARN à l’échelle du génome à l’aide de technologies de criblage à grande échelle. En fin de compte, une analyse de confirmation à l’aide de la QPCR est effectuée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer du sein, telles que si et comment l’œstrogène affecte l’expression des micro-ARN.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du cancer du sein, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que d’autres cancers ou types de cellules qui expriment le récepteur des œstrogènes alpha ou amers. Les sept cellules MC utilisées dans cette étude sont préparées cinq jours avant le traitement dans une hotte stérile. Prélever le milieu de la fiole T 75 à l’aide d’une pipette de pâturage stérile reliée à un vide.

Lavez doucement les cellules attachées deux fois avec du PBS et détachez les cellules avec de la trypsine. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules selon le protocole du fabricant. Étiquetez six plaques de 100 millilitres et ajoutez 10 millilitres de média à chaque plaque.

Plaquez environ 2 millions de cellules par plaque et répartissez les cellules en faisant tourner doucement la plaque. Incuber les cellules pendant 24 à 48 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à environ 80 %. Deux à quatre jours plus tard, sortez les cellules de l’incubateur à 37 degrés Celsius et observez-les au microscope pour vous assurer qu’elles sont confluentes à environ 80 %.

La confluence cellulaire est un facteur important car elle influence le contact entre cellules et les comportements tels que la signalisation et la prolifération de cellule à cellule. Lavez les cellules deux fois avec du PBS, puis ajoutez le média approprié avec 5 % de FBS qui a été filtré afin d’éliminer les composés œstrogéniques. Les cellules FBS ou D-C-C-F-B-S traitées au charbon de bois enrobé Dexter incubent des cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 le lendemain.

Lavez les cellules deux fois avec du PBS et ajoutez le milieu approprié à 0,5 % D-C-C-F-B-S et incubez les cellules pendant 48 heures supplémentaires le jour du traitement. Préparez les réactifs pour le traitement cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres. Tout d’abord, ajoutez 30 millilitres du milieu approprié à 0,5 % D-C-C-F-B-S, suivi de trois microlitres d’une cellule de lavage à deux ligands E de 0,1 millimolaire à deux reprises avec du PBS.

Assurez-vous d’enlever autant de PBS que possible. Mélangez doucement le contenu de chaque tube et ajoutez 10 millilitres dans les cellules de chaque plaque. Il devrait y avoir un ligand par plaque.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant une période de temps choisie entre zéro et 72 heures. Remplacez le média au besoin après la fin du traitement pendant la période de temps souhaitée. Retirez les plaques de l’incubateur et apportez-les dans une hotte.

Étant donné que cette procédure utilise une solution toxique de thiocyanate de guana dium phénol, utilisez un équipement de protection individuelle approprié, lavez les cellules deux fois avec du PBS. Ajoutez ensuite un à deux millilitres de solution de thiocyanate de phénol de guad dium dans les cellules de chaque plaque. Assurez-vous que le volume des cellules ne dépasse pas 10 % du volume de la solution de thiocyanate de méthyle et que la plaque est recouverte de la solution.

Laissez les cellules reposer pendant une minute. Ensuite, utilisez un grattoir en caoutchouc pour racler les cellules et transférez les cellules dans une micro-centrifugeuse. Les cellules tubulaires peuvent être stockées dans cette solution à moins 80 degrés Celsius pendant des semaines.

L’extraction d’ARN de haute qualité est très importante pour le succès de cette procédure. Par conséquent, les étapes suivantes doivent être effectuées sous ARN. Pour extraire l’ARN total de chaque traitement, vortex un mélange de cellules pendant une minute et tourner rapidement.

Ajouter 200 microlitres de chloroforme par millilitre de solution de thiocyanate de méthyle de gadium. Agitez le vortex pendant 15 secondes et incubez pendant deux à trois minutes dans une centrifugeuse à température ambiante à 11 000 tr/min et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Transférez la phase aqueuse supérieure dans un nouveau microtube de centrifugation.

Ajouter 1,5 volume d’éthanol à 100 % et mélanger par pipetage. Transférez la solution dans une colonne de spin et purifiez l’ARN par une purification en colonne de spin de micro-ARN, suivie d’une dégradation de l’ADN 1D NA selon le protocole du fabricant. Par la suite, l’ARN est mentionné dans 60 microlitres d’ARN aliquote d’eau libre, un à deux microlitres d’ARN pour la quantification et l’analyse de la qualité, et stocke le reste de l’ARN à moins 80 degrés Celsius.

Après avoir confirmé que le traitement des cellules a entraîné la régulation de cibles connues sensibles aux œstrogènes, telles que l’ARNm, le profilage des micro-ARN est effectué à l’aide de la microfluidique à flux de micropuissance, des microréseaux et des sondes à double marque, des réseaux à faible densité ou D-L-P-L-D-A pour effectuer le profilage des micro-ARN à l’aide de D-L-P-L-D-A, retirez les plaques D-L-P-L-D-A du réfrigérateur et laissez-les reposer à température ambiante pendant que la réaction de transcription inverse est exécutée pour générer de l’ADNC à partir des échantillons d’ARN. Lorsque les plaques D-L-P-L-D-A ont atteint la charge à température ambiante, 100 microlitres d’ADNC mélangés aux sondes à double marquage. Mélange maître PCR dans chacun des huit orifices de remplissage d’une plaque.

Centrifugez les plaques du réseau. Ouvrez brièvement le système Q-R-T-P-C-R et vérifiez que le bloc est destiné à une plaque à 384 puits. Configurez l’exécution.

À l’aide du logiciel SDS, sélectionnez la quantification relative. Sélectionnez le numéro de puits et le type de réseau, puis entrez des exemples de descriptions pour définir les puits. Exécutez la matrice en utilisant les conditions de cycle thermique par défaut.

Une fois l’exécution terminée, enregistrez les résultats, exportez-les vers Microsoft Excel et enregistrez-les pour une analyse plus approfondie. Une méthode pour confirmer la régulation des micro-ARN est l’analyse du cyanure D-Q-P-C-R. La première étape consiste à concevoir des amorces dont la séquence du micro ARN mature, qui équivaut à l’amorce directe peut être obtenue à partir de simples based.org.

Convertissez ensuite tous les UES en ts, préparez le CD NA, placez un microgramme d’ARN total et un tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Incluez un contrôle négatif avec de l’eau au lieu de l’ARN total. Suivre les instructions pour le filé poly A et le premier brin CD nna.

Synthèse de micro-ARN à partir d’un micro-ARN, synthèse d’ADNc premier brin et protocole Q-R-T-P-C-R. Diluez le CD NA obtenu de un à 10 avec de l’eau purifiée et conservez-le à moins 20 degrés Celsius. Obtenez une plaque de réaction de 1 96 puits.

Préparez le master mix A-Q-P-C-R. Pour chaque micro maître R-N-A-Q-P-C-R, ajoutez bien deux picaMoles de chacune des amorces avant spécifiques et de l’amorce universelle. Cinq microlitres de deux master-mix X-Q-P-C-R et de l’eau purifiée.

Aliquote le mélange dans chacun. Enfin, ajoutez 16 nanogrammes de poly a CD NA pour chaque échantillon et incluez des contrôles négatifs. Le volume final de la réaction doit être de 10 microlitres par puits. Assurez-vous qu’il y a des puits triples pour chaque échantillon, pour chaque microARN, pour les répétitions techniques ainsi que pour les témoins négatifs.

De plus, incluez un ou plusieurs gènes de référence, généralement U six s nrp, ARN et/ou un micro ARN qui n’est pas modifié sur le logiciel du système Q-R-T-P-C-R. Assignez le rapporteur et la cible Entrez le volume de réaction. Sélectionnez la méthode de cycle de seuil comparatif et définissez les puits d’échantillonnage.

Exécutez les plaques en utilisant les paramètres par défaut pour le cycle. Assurez-vous qu’une analyse de la courbe de fusion est effectuée pour tous les essais de matrice cyan à la fin de l’essai. Enregistrez les résultats et exportez toutes les données, y compris les valeurs CT vers Microsoft Excel.

L’extraction efficace d’ARN de haute qualité à partir des échantillons est un facteur important pour le succès de cette étude. Après l’extraction, les concentrations d’ARN sont mesurées à l’aide d’un spectrophotomètre, comme le montre ce résultat représentatif. Chaque pic illustré dans le panneau supérieur représente un échantillon et un processus d’extraction réussi produisant de l’ARN pur.

En revanche, un ARN mal extrait illustré dans le panneau inférieur ne montre pas de pic d’absorption clair à 260 nanomètres. Pour le contrôle de la qualité de l’ARN, l’intégrité de l’ARN a été mesurée et les résultats comparés à une échelle d’ARN. Les 18 s et 28 S-R-R-N-A doivent avoir des pics dans un échantillon d’ARN de bonne qualité, comme indiqué ici.

Un échantillon d’ARN dégradé aurait moins de pics clairs et une quantité relative réduite de 18 s et 28 S-R-R-N-A, comme indiqué ici. L’analyse de la population de micro-NA peut être effectuée séparément. Les résultats d’une comparaison entre le véhicule et E : deux échantillons traités sont représentés graphiquement par cette carte thermique.

Les échantillons traités E a, B et C sont régulés à la hausse dans les échantillons traités E deux comme indiqué en rouge, tandis que les échantillons traités E D, e, F et G sont régulés à la baisse dans l’échantillon traité E deux comme indiqué en vert. La sélection des micro-ARN dépend de leur signification et de leur expression. Une valeur P inférieure à 0,05 est généralement considérée comme significative et doit être sélectionnée pour une validation ultérieure par le QPCR.

Les réseaux à faible densité à sondes à double marquage utilisent une méthode basée sur A-Q-P-C-R pour détecter les microARN régulés. Dans un format de 384 puits, les graphiques d’amplification pour les micro-ARN à partir des résultats D-L-P-L-D-A sont présentés ici. L’amplification des microARN exprimés est indiquée par l’augmentation des valeurs RN.

Les validations peuvent être effectuées à l’aide de deux méthodes de détection QPCR afin d’éviter les biais de méthode et de permettre une confirmation et une enquête approfondies des réglementations micro NA. La première méthode utilise la détection de colorant cyanure pour analyser la courbe de fusion d’un micro-ARN comme contrôle de l’amplification. Spécificité. L’amplification du fragment prévu se traduira par un pic uniforme clairement défini, comme indiqué dans le panneau de gauche.

Plusieurs pics seraient observés si l’amorce n’est pas spécifique ou si des quantités spécifiques de dimères d’amorce sont formées, comme illustré par le panneau de droite. Si cela se produit, les données ne peuvent pas être utilisées pour l’analyse d’expression. La deuxième méthode, sondes à double marquage, l’analyse QPCR est plus spécifique car seule l’amplification du micro ARN cible est détectée dans les graphiques d’amplification de chaque cible.

Des micro-ARN peuvent être observés, comme indiqué ici, pour les deux tests QPCR. Une comparaison avec un gène de référence est nécessaire pour déterminer l’expression relative des gènes entre deux échantillons. Un exemple de gène de référence approprié dans ces lignées cellulaires de cancer du sein est l’inhibiteur de dissociation A-R-H-G-D-I-A-A RO.

Comme observé sur cette figure, le niveau d’ARNm de A-R-H-G-D-I-A n’est pas modifié entre les échantillons traités par le véhicule et le ligand. Un gène de référence largement accepté pour l’analyse des micro-ARN est l’ARN U six snrp. Le petit ARN nucléaire non codant d’environ 110 nucléotides de long qui fonctionne dans le prem nucléaire.

Un épissage tel qu’observé sur cette figure U six niveaux d’expression sont à peu près les mêmes dans les échantillons présentés, permettant ainsi de calculer les niveaux variables de micro-ARN. Cette dernière figure montre une représentation graphique des résultats du micro R-N-A-Q-P-C-R à partir de cellules traitées Vehicle et E deux, en comparant les niveaux d’expression relatifs d’un micro-ARN spécifique de seulement 135 A sur une période donnée. Ce micro-ARN a été détecté comme non régulé jusqu’à 24 heures après le traitement par E deux, mais une régulation significative a été détectée 72 heures après le traitement à la suite de cette procédure.

D’autres méthodes, telles que l’immunoprécipitation de la chromatine du récepteur N SDR, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la question de savoir si le microARN est directement régulé par le récepteur en se liant aux régions régulatrices de la chromatine CIS. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser la régulation des microARN médiée par les œstrogènes de manière robuste. Il est très important d’effectuer les différents contrôles et la réplication des étapes décrites dans ce protocole pour s’assurer que vous détectez de véritables réglementations et non des variations biologiques ou techniques.