Name: Profilage de microARN œstrogène réglementés dans les cellules du cancer du sein (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 24 s
Description: Découvrez le profilage des microARN régulés par l'œstrogène dans les cellules du cancer du sein. Cette méthode utilise des microarrays microfluidiques et des sondes doublement marquées pour identifier les microARN régulés par les récepteurs œstrogéniques.

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Nous sommes reconnaissants au Dr Xiaolian Gao, de l&#39;Université de Houston, de fournir des conseils à la plate-forme de puces à ADN LC Sciences miARN, le Dr Karin Edvardsson, Institut Karolinska, en Suède, et le Dr Eylem Aydogdu, Université de Houston, pour partager leur expertise miARN . Recherche présentée dans cette publication a été soutenue par le National Cancer Institute des National Institutes of Health en vertu Prix Nombre R01CA172437. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health. Ce travail a également été soutenu par des subventions du Texas Emerging Technology Fund, sous accord pas. 300-9-1958.

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Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Déterminer le mécanisme de la régulation hormonale de miARN dans les cellules de cancer du sein peut fournir une plate-forme pour la compréhension de cette maladie et peut fournir un traitement potentiel pour le cancer du sein. Culture de ces cellules pour fournir la condition optimale pour l&#39;action de l&#39;hormone est très important. Ici, un protocole qui permet de s&#39;assurer que l&#39;hormone d&#39;intérêt (œstrogène) a été exclue avant le traitement et que la dose optimale de l&#39;E2 a été utilisé pour un moment approprié au cours du traitement a été décrite. D&#39;autres effets hormonaux et des facteurs de croissance ont été maintenus à un minimum en diminuant progressivement les niveaux de sérum et en utilisant DCC-FBS, ce qui est FBS qui ont été dépouillé de la plupart de ses hormones, cytokines et facteurs de croissance. Phénol support exempt de rouge a été en outre utilisé pour minimiser d&#39;autres effets non hormonaux, étant donné que le rouge de phénol a été rapporté pour avoir une activité oestrogénique et affecter certaines fonctions dans des lignées cellulaires 20,21. Le temps d&#39;exposition des cellules à l&#39;hormone est d&#39;une grande importance. Pour la régulation de l&#39;oestrogène associé à des gènes, il a été précédemment montré que 24 hrexposure produire une réponse significative de gènes cibles directs dans des cellules de cancer du sein 1,18. Depuis miARN sont transcrits par l&#39;ARN polymérase II, comme ARNm, il est concevable que c&#39;est un point de temps convenable pour détecter la réglementation directe également des miARN. Il est encore à déterminer si et comment ces miRNAs affectent l&#39;expression de ces cibles connues ER dans les cellules cancéreuses du sein. miRNA profilage de l&#39;expression peut être difficile en raison de la taille relativement petite de la miRNA, le fait que la séquence miRNA mature peut être trouvé aussi dans le pri-miARN et la pré-miARN, et en raison de l&#39;hétérogénéité de leur teneur en GC 22. Plusieurs techniques de profilage et de compositions chimiques ont été utilisées pour remédier à cette difficulté. Parmi ceux-ci sont des approches différentes de puces à ADN et l&#39;analyse qPCR (Figure 2). Bien microréseau est largement accepté pour anal du génome entierlyse, il peut fournir des faux négatifs et il existe des différences entre les plates-formes disponibles, allant de la chimie de la technologie d&#39;impression 23. De plus, le processus de normalisation constitue un défi lors de l&#39;analyse relativement peu de gènes de miARN, qui sont comptés en milliers par rapport aux dizaines de milliers de transcrits d&#39;ARNm. qPCR, d&#39;autre part, est plus sensible, et est mieux appliqué lorsque moins de gènes doivent être considérés. Cependant, lorsqu&#39;elle est effectuée dans de grandes plaques de 384 puits, avec seulement une technique répliquée par plaque, plusieurs plaques doivent être analysés pour chaque échantillon, ce qui rend l&#39;analyse coûteux. Aussi, dans nos mains, de nombreux résultats plus faux négatifs ont été obtenus en utilisant l&#39;analyse DLP-LDA par rapport à la puce. Étant donné que la séquence de miARN mature est présente dans le pri-miARN et les séquences de pré-miARN, il est intéressant de faire la différence entre ces transcrits à l&#39;aide de techniques de PCR 24. sondes de DLP sont également disponibles pour pré-miARN, et spamorces ecific peuvent également être conçus pour exclure différente mature ou précurseur variantes utilisant cyanine technologie qPCR. qPCR est une norme d&#39;or pour la validation de l&#39;expression différentielle de résultats du profilage. L&#39;efficacité de la PCR quantitative, cependant, dépend de plusieurs paramètres, y compris l&#39;extraction de l&#39;ARN, de l&#39;intégrité de l&#39;ARN (de la qualité), la synthèse d&#39;ADNc, la conception d&#39;amorce, le procédé de détection (de la chimie), et le gène de référence pour la normalisation des données 1,22,25. Les options pour la conception d&#39;amorce pour l&#39;analyse des miARN est très limitée, car la courte durée de la séquence miRNA ne donne pas de place pour beaucoup la conception d&#39;amorce de remplacement, et seulement une amorce peuvent être hébergeaient dans cette courte séquence. Par conséquent, la nécessité de manipulations de substitution comme illustré sur la figure 2. Réplicats techniques sont importantes pour valider la robustesse de la méthode d&#39;amplification et le procédé mis en oeuvre. Répétitions biologiques sont nécessaires pour une représentation de la variatio biologique généralen, y compris la réponse variable à ligand traitement, et de montrer que les effets constatés dans une cellule sont reproductibles. Basé sur notre expérience, les variations dans l&#39;expression des miRNA entre les cultures cellulaires peuvent se produire. Habituellement, ces différences sont moins de 1,3 fois, et la moyenne des valeurs et SD correspondant identifie la variation naturelle et technologique. Cette variation peut résulter de divers facteurs, notamment, la densité cellulaire et le fait que les fonctions cellulaires peuvent changer de passage de passage. Pour identifier statistiquement significatives expressions résultant du traitement de ligand, une signification largement admise est lorsque la valeur de p inférieure à 0,05. Ici, le test t de l&#39;élève sur les répétitions biologiques et techniques à l&#39;aide de la distribution bilatérale et deux échantillons paramètres de variance inégales ont été utilisés. D&#39;autres paramètres du test t existent, et le choix dépend de la configuration expérimentale 26. Un protocole détaillé dans l&#39;évaluation des régulations hormonales de maturité miRNA dans des cellules de cancer du sein a été fournie. Technologies importantes et de la chimie dans le profilage et la validation de ces miARN expressions ont été clairement expliqué. La technologie choisie pour les études de miARN dans les cellules de cancer du sein dépend finalement de ce qui est exactement à l&#39;étude.

L&#39;œstrogène est une hormone qui est important lors du développement de la glande mammaire. L&#39;œstrogène joue également un rôle important dans le développement, la maintenance, le risque et le traitement du cancer du sein 1. L&#39;œstrogène exerce sa fonction en se liant à des RE, qui sont des facteurs de transcription et réguler les gènes cibles spécifiques. Sur les deux variantes du récepteur, ERa est essentiel pour l&#39;oestrogène-dépendante la prolifération des cellules du cancer du sein. La plupart des cancers du sein sont ERa-positif et dépend de l&#39;oestrogène pour la croissance. Cela a rendu la signalisation des oestrogènes et ERa une cible pour le traitement de l&#39;hormone-récepteur de cancer du sein positif. Comprendre le mécanisme sous-jacent de ERa est important d&#39;améliorer les résultats du traitement, vaincre la résistance au traitement, et de comprendre comment le cancer du sein se développe. miARN jouent un rôle essentiel dans les fonctions cellulaires en raison de leur impact majeur dans la régulation génique post-transcriptionnelle. miARN sont 19-24 nucléotides courte, simple brin, Non codantes des ARN qui sont d&#39;abord transcrits par l&#39;ARN polymérase II dans les transcriptions primaires miARN (pri-miARN). Elles sont traitées dans le noyau par Drosha en précurseurs-miARN courts en épingle à cheveux (pré-miARN) et ensuite traitées par Dicer et séparés en simples brins pour former miARN matures dans le cytoplasme. Les miARN matures simple brin sont transférés à des protéines Argonaute pour former un complexe RISC. Ensuite, les miARN peuvent s&#39;hybrider aux régions 3 &#39;non traduites (3&#39; UTR) d&#39;un ARNm cible, conduisant à la régulation post-transcriptionnelle par blocage de la traduction ou dégrader les ARNm cible 2. En raison du rôle important que jouent les œstrogènes et miARN dans la progression tumorale, l&#39;identification des miARN associés à la signalisation des oestrogènes normale ou perturbée est important afin d&#39;améliorer notre compréhension du développement et de l&#39;amélioration du traitement du cancer du sein. Bien qu&#39;il y ait une bonne compréhension de la façon dont ERa régule les gènes codant pour des protéines, l&#39;extensionet les détails de la réglementation non codantes de l&#39;ARN reste à une enquête approfondie. Les premières études visant à élucider la réglementation ERa de miARN dans les lignes cancers du sein de cellules ont donné des résultats contradictoires, même lorsque la même lignée cellulaire a été analysé 3-6. Cela peut être le résultat de traitements différents, les variations biologiques, l&#39;utilisation de différentes techniques, et le fait que la petite taille du miARN rendre difficile à analyser. Ici, un protocole qui contrôle les variations et les artefacts méthode est décrite. Pour identifier les miARN sont régies par les œstrogènes, le profilage d&#39;un modèle de cancer du sein bien défini de l&#39;activité ERa est une première étape. Plusieurs lignées cellulaires ont été générées à partir de tumeurs de cancer du sein humain ERa-positives, qui sont dépendants de l&#39;œstrogène similaire à la majorité des cancers du sein cliniques. Les propriétés moléculaires des deux de ces lignées cellulaires, T47D et MCF7, y compris l&#39;expression de ERa et sa cible en aval,le récepteur d&#39;hormone de progestérone (PR), un manque d&#39;expression de récepteur membranaire HER2, en même temps que l&#39;expression de gènes de différenciation oestrogène-sensibles et luminales-épithéliale, les rendent appropriés en tant que modèles pour le sous-type luminal des tumeurs du sein 7-10. 17β-estradiol (E2) est la forme dominante de l&#39;oestrogène, et les concentrations et les points de temps pour l&#39;activation de la transcription optimale de ERa ont été caractérisées dans plusieurs études. Dans ce protocole, 10 nM traitement E2 pendant 24 heures est utilisé et T47D et MCF7 comme modèles pour l&#39;activité ERa dans les cellules de cancer du sein 1. En outre, les règlements de miRNA dépendant du temps peuvent être analysés en particulier dans un intervalle de temps, par exemple de 1-72 h. Deuxièmement, l&#39;analyse des miRNA a des défis distincts, en partie en raison de leurs tailles courtes. miARN ne sont pas bien conservés dans la préparation de l&#39;ARN total lorsque réguliers guanidinium thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol précipitations d&#39;ARN sont effectuées, ou lorsque rpurifications de colonne Andard sont utilisés. Précautions particulières doivent être prises pour maintenir ou enrichir pour la plus petite fraction d&#39;ARN. En augmentant le volume d&#39;isopropanol, l&#39;abaissement de la température avant la centrifugation (80 ° C), et en omettant le lavage à l&#39;éthanol à 70%, la rétention des miARN peut être accrue au cours de la précipitation. Ou, colonnes et des tampons spécifiques pour une préparation de haute qualité et robuste de l&#39;ARN total contenant miARN peuvent être utilisés. Aussi pour l&#39;analyse elle-même, leurs tailles courtes créent des défis. Pour le dépistage du miRNA génome, il ya trois miARN communes profilage techniques au choix: microarrays, qPCR, et le séquençage de prochaine génération. Chaque technique peut être réalisée en utilisant de multiples plates-formes différentes, et les différentes préparations d&#39;échantillons sont requis, chacun avec des risques d&#39;introduction d&#39;artefacts. En miRNA microréseau, une diapositive est repéré ou synthétisé avec des milliers d&#39;oligonucléotides. Ces oligonucléotides sont utilisés en tant que sondes, et chacune de la sondes est conçu pour s&#39;hybrider à une séquence de miARN particulier. La préparation des échantillons pour les microarrays, telle que pratiquée dans cette étude, enrichit d&#39;abord pour miARN puis introduit Cy5 et Cy3 étiquetage sur les miARN. Biopuces donne l&#39;occasion d&#39;observer les niveaux d&#39;expression relatifs d&#39;un grand nombre de gènes simultanément, c&#39;est rapide et appropriée pour le dépistage d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons, mais ne peut analyser les séquences présentes sur la puce et par exemple ne pas détecter les changements dans inconnu ou muté miARN. analyse de puces à ADN telle que pratiquée dans ce protocole exige également des quantités relativement importantes, environ 5 ug, de l&#39;ARN total par échantillon pour analyse. De basse densité qPCR miRNA profilage nécessite moins de matière (700 ng / échantillon et reproduire), et permet la détection et la quantification de miARN. niveaux de transcription peuvent être déterminées, et la quantité peut être une valeur absolue ou une quantité relative. analyse qPCR nécessite d&#39;abord la conversion des miRNA en ADNc, ici en utilisant une boucleamorce pour chaque miARN spécifiques assurant l&#39;analyse de seulement mûrir miARN. Cela génère un modèle plus qui peuvent être amplifiée en utilisant une amorce sens spécifique de miARN et une amorce universelle inverse complémentaire de la séquence en boucle, et peut abriter l&#39;insertion d&#39;une sonde à double spécificité pour étiqueté. qPCR peut être utilisée dans un format à faible densité où des centaines de miARN peuvent être détectées en parallèle en utilisant une ou plusieurs plaques de 384 puits avec différentes paires d&#39;amorces dans chaque puits 11. Séquençage de nouvelle génération, d&#39;autre part, est la seule de ces techniques qui permettent à la découverte de nouvelles, miARN mutées ou modifiées, comme tous les ARN dans un échantillon peuvent être séquencés 11. Cette technique, cependant, nécessite de multiples étapes pour enrichir petits ARN et de produire une petite bibliothèque d&#39;ARN en utilisant plusieurs étapes de ligature des lieurs et des purifications ultérieures avec risques accrus de moduler les niveaux d&#39;expression relatifs entre les échantillons. Elle exige également bioinformati importantsanalyse cs. Compte tenu des diverses techniques de profilage miRNA, la technique la plus appropriée dépend des applications. Les puces à ADN sont les plus appropriés lorsque le matériel est relativement abondante et l&#39;intérêt est de définir l&#39;expression différentielle des miARN déjà connus. Faible densité des réseaux qPCR sont les plus appropriés quand une quantité limitée de l&#39;échantillon est disponible et une sensibilité élevée de miARN peu exprimé est nécessaire. Le séquençage est le mieux adapté pour l&#39;analyse des miARN inconnus, des mutants ou des différentes isoformes d&#39;une miARN est nécessaire. Dans l&#39;étude de miARN régulés par les œstrogènes dans le cancer du sein, deux modèles de lignées cellulaires sont utilisés, T47D et MCF7, où de grandes quantités d&#39;ARN sont facilement disponibles. Chaque lignée cellulaire a été analysée dans des cultures de cellules répliquées à l&#39;aide de différents passages, chacun dans réplicats techniques de traitement. Cela permet la détection robuste de manière reproductible, miARN ERa réglementés. Les niveaux relatifs d&#39;expression des miRNA ont été comparées en utilisant deux miARN microarray etSondes double labellisés - tableaux de faible densité (DLP-LDA) et validé les résultats de qPCR spécifique utilisant à la fois cyanine et de la chimie de DLP. règlements de miARN ont ensuite été analysées plus loin dans les séries chronologiques de définir leur régulation exacte dans le temps, ce qui peut aider à différencier des variations aléatoires ou circadiens de la réglementation induite par les oestrogènes, et indiquer des effets primaires de effets secondaires. Comparaisons bioinformatiques des études de la chromatine liaison de ERa peuvent favoriser l&#39;aide à la différenciation de l&#39;enseignement primaire par rapport à des effets secondaires. L&#39;analyse a donné lieu à une évaluation fiable de la réglementation miARN où il a pu être établi que, après traitement de l&#39;E2 24 h transcriptions codant pour des protéines ont été facilement réglementés mais miARN matures n&#39;ont pas été affectées 1. Cependant, il est possible que les miARN sont réglementés au plus tard points dans le temps, comme le montre l&#39;analyse des séries chronologiques des miARN sélectionnés 1. Les détails doivent encore être explorées et le protocole présenté ici fournit une robust moyen d&#39;étudier la régulation hormonale des miARN matures dans des lignées cellulaires de cancer du sein.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Life Technologies</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine Life</td><td>Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sans rouge de phénol DMEM&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>Eau ultrapure</td><td>EMD Millipore</td><td>Équipement</td><td></td>spécifique</tr><tr><td>DCC-FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6765-500ML</td><td></td></tr><tr><td>100x L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>PBS comprimé</td><td>Medicago, Accurate Chemicals</td><td>Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)</td><td></td></tr><tr><td>17&beta ;- œstradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td></td></tr><tr><td>ICI 182,780&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4409</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-600ML</td><td></td></tr><tr><td>Lignées cellulaires T47D ou MCF7</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>T47D (ATCC HTB-133) et MCF7 (ATCC HTB-22)</td><td></td></tr><tr><td>Fiole T-75&nbsp ;</td><td>VWR International LLC</td><td>BD353136 (bouchon ventilé)</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique</td><td>VWR International LLC</td><td>53300. Pour 5mL (53300-421)</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage de cellules Countess</td><td>Life Technologies</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé Countess</td><td>Life</td> Technologies <td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de 100 mm&nbsp ;</td><td>VWR International LLC</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>Solution de thiocyanate-phénol de guanidinium (TRizol)</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Racleur de cellules en caoutchouc&nbsp ;</td><td>VWR International LLC</td><td>82050-470</td><td></td></tr><tr><td>Méthode du thiocyanate-phénol-chloroforme de guanidinium (miRNeasy Mini Kit/Trizol)</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Kit de DNase sans RNase (dégradation de l’ADN)</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans RNase (eau sans nucléase)</td><td>Thermoscientific</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000 Spectrophotometer&nbsp ;</td><td>Thermoscientifique</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Assay kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1512</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2938C et pour logiciel (G2946)</td><td></td></tr><tr><td>Toutes les amorces (sauf les amorces TaqMan)</td><td>Technologies ADN</td><td>intégrées Spécifique par ordre pour chaque gène/miARN</td><td></td></tr><tr><td>Tampon premier brin, DTT, dNTP, exposant III (kit de synthèse d’ADNc en exposant III)&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast à 96 puits, plaque réactionnelle</td><td></td><td>L’adhésif</td> optique rapide Life Technologies 4346906 <td></td></tr><tr><td>couvre</td><td>Life Technologies</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>2x SYBR green PCR master mix (colorant cyanine)</td><td>Life Technologies</td><td>4385612</td><td></td></tr><tr><td>7500 Système et logiciel de PCR rapide en temps réel</td><td>Life Technologies</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>&mu ; Technologie de biopuce microfluidique Paraflo&nbsp ;</td><td>LCSciences</td><td>MRA-1001 et AS-2001(pour l’analyse des résultats)</td><td></td></tr><tr><td>DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (amorces Rt/ensemble de piscines humaines)</td><td>Life Technologies</td><td>4400928</td><td></td></tr><tr><td>Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700 Thermocycleur</td><td>Life Technologies</td><td>4310899</td><td></td></tr><tr><td>sondes à double marquage (TaqMan) 2x Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG</td><td>Life Technologies</td><td>4324018</td><td></td></tr><tr><td>7900HT Système de PCR rapide en temps réel</td><td>Life Technologies</td><td>4329001</td><td></td></tr><tr><td>Logiciels de gestion de SDS et RQ</td> Life <td>Technologies</td><td></td><td></td>4444202</tr><tr><td>NCode miRNA First-Strand Synthèse d’ADNc et qRT-PCR Kit</td><td>Life Technologies</td><td>MIRC-50</td><td></td></tr><tr><td>10x DPL (TaqMan) RT amorces</td> Life <td>Technologies</td><td>Spécifique pour chaque miARN</td><td></td></tr><tr><td>20x DPL (TaqMan) amorce de test en temps réel&nbsp ;</td><td>Technologies de la vie</td><td>spécifiques à chaque miARN</td><td></td></tr></tbody></table>

profilage de microarn œstrogène réglementés dans les cellules du cancer du sein

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

L&#39;œstrogène joue un rôle vital dans le développement de la glande mammaire et la progression du cancer du sein. Il assure la médiation de la fonction de liaison à et activation des récepteurs des oestrogènes (RE), ERa et ERß,. ERa est souvent régulé à la hausse dans le cancer du sein et entraîne la prolifération de cellules cancéreuses du sein. Les salles d&#39;urgence fonctionnent comme des facteurs de transcription et réguler l&#39;expression des gènes. Considérant que le règlement de ERa de gènes codant pour des protéines est bien établi, la réglementation des non codantes microRNA (miRNA) est moins exploré. miARN jouent un rôle majeur dans la régulation post-transcriptionnelle de gènes, en inhibant leur traduction ou leur dégradation de l&#39;ARNm. miARN peuvent fonctionner comme des oncogènes ou des gènes suppresseurs de tumeur et sont également biomarqueurs prometteurs. Parmi les essais de miRNA disponibles, puces à ADN et en temps réel la réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR) ont été largement utilisés pour détecter et quantifier les niveaux de miARN. Pour identifier les miARN réglementés par la signalisation des oestrogènes dans le cancer du sein, eeir expression dans des lignées cellulaires de cancer du sein ERa-positives ont été comparés avant et après activation à l&#39;aide des œstrogènes à la fois les microarrays μParaflo-microfluidiques et des sondes marquées double-matrices de faible densité. Les résultats ont été validés à l&#39;aide des analyses qPCR spécifiques, en appliquant à la fois cyanine à base de colorants et double étiqueté chimie à base de sondes. En outre, une analyse temps-points a été utilisée pour identifier des règlements au fil du temps. Avantages de l&#39;approche d&#39;analyse des miRNA utilisée dans cette étude est qu&#39;elle permet un dépistage rapide de la réglementation maturité miRNA dans de nombreux échantillons, même avec des quantités d&#39;échantillons limités. La mise en page, y compris les conditions spécifiques pour la culture cellulaire et le traitement d&#39;oestrogène, répétitions biologiques et techniques, et un dépistage à grande échelle suivie confirmations en profondeur en utilisant des techniques distinctes, assure une détection robuste de réglementation miARN, et élimine les faux positifs et d&#39;autres artefacts. Cependant, miARN mutés ou inconnus, ou des règlements à la leve de transcription primaire et précurseurl, ne sera pas détecté. La méthode présentée ici représente une enquête approfondie de la réglementation des miRNA oestrogène médiation.

Une vue d&#39;ensemble de cette approche est présentée dans la figure 1 et une comparaison entre les différents exemples de préparations et de modifications d&#39;acides nucléiques nécessaires pour chaque technique est visualisé sur la figure 2. La condition et l&#39;environnement des cellules avant traitement avec une hormone est important pour déterminer les effets réels de l&#39;hormone 16. Certains milieu et sérum contiennent des facteurs de croissance qui peuvent affecter les résultats, de sorte que les cellules sont privées de sérum afin de s&#39;assurer que tous les effets hormonaux ont été réduits à un minimum. Par conséquent, lorsque le traitement avec E2, il ya plus de certitude que les effets observés sont E2-associés. Un facteur important est la confluence des cellules, ce qui influe sur le contact et des comportements tels que la signalisation cellule-cellule et cellule-prolifération cellulaire. Les cellules ont été autorisées à être confluentes à 80% (Figure 3A) et bien fixés pour permettre la croissance et d&#39;éviter une perte de cellules pendant le lavage et le support subséquent change. Les conditions pendant l&#39;extraction et le stockage de l&#39;ARN sont importantes pour la qualité de l&#39;ARN et l&#39;analyse ultérieure. Il est également connu que le nombre de cellules, la méthode d&#39;extraction, et la teneur en GC de l&#39;miARN peuvent affecter le rendement et la qualité des deux ARNm et 17 miARN. Ainsi, il est nécessaire de procéder à l&#39;extraction de l&#39;ARN dans des conditions RNase-libres et de vérifier la qualité de l&#39;ARN avant de procéder à des expériences. Après extraction, la quantification de l&#39;ARN donne des informations sur la concentration de l&#39;ARN total (contenant à la fois des ARNm et miARN), qui permet l&#39;observation de rendement. Il fournit également une représentation graphique des résultats comme on le voit sur ​​la figure 3B, ce qui permet l&#39;observation de la pureté de l&#39;échantillon (généralement indiquée par une crête, panneau supérieur). Mauvais rendement de l&#39;ARN produirait pas d&#39;absorption spécifique à 260 nm (figure 3B, panneau inférieur). Pour déterminer si l&#39;ARN est de haute qualité, de l&#39;ARNintégrité a été mesurée. Un certain nombre d&#39;intégrité de l&#39;ARN (RIN) comprise entre 9-10 en sorte que l&#39;ARN n&#39;est pas dégradé et est d&#39;une qualité optimale. En outre, la représentation graphique de l&#39;ARN doit être observée, et l&#39;ARNr 28S et 18S devrait avoir des pics comme le montre la figure 4 (panneau du milieu). La comparaison avec l&#39;échelle (figure 4, panneau supérieur) identifie la taille des pics. Un ARN dégradé aurait pics moins claires et une quantité relative réduite de la 18S et 28S ARNr (figure 4, panneau inférieur). La fraction de petits ARN peut en outre être assurée à l&#39;aide du petit ARN Kit Agilent. Il est recommandé de valider la réponse de l&#39;oestrogène après traitement, dans les conditions expérimentales spécifiées, avant de procéder au dépistage des miARN. Une PCR quantitative peut être effectuée sur un gène cible ER connu tel que pS2 ou SPINK4 18, utilisant une matrice d&#39;ADNc. De tels gènes sont régulés à la hausse à l&#39;intérieur généralement de 1 à 24 h après traitement E2. Une fois que la qualité de l&#39;ARN et de la réponse aux oestrogènesa été évalué, autre expérience peut être réalisée. Microréseau est encore une technique largement utilisée pour le dépistage à grande échelle pour l&#39;expression des miARN dans les cellules. Par exemple, une fois que la puce à ADN miRNA utilisé contenait 894 miARN matures et 50 contrôles des sondes uniques dans une quadruplés. Les hybridations ont été effectuées en double avec colorant procédure d&#39;échange. Les résultats de puces à ADN miRNA sont habituellement représentés graphiquement par des cartes de chaleur. Figure 5A montre une carte de la chaleur, ce qui représente des données d&#39;une comparaison des biopuces miARN entre le véhicule et les échantillons traités E2. Le rouge indique que le miARN est régulée positivement dans l&#39;échantillon E2-traitée (expression élevée), tandis que le vert indique une régulation négative de la miRNA (Expression faible). La sélection miRNA dépend généralement de leur importance dans l&#39;expression, et généralement d&#39;une valeur de p inférieure à 0,05 est considérée comme significative. Les miARN qui sont indiqués pour être exprimé de manière différentielle devraient être encore validés wvec qPCR, pour les distinguer des faux positifs. Le tableau DLP-LDA, d&#39;autre part, utilise une méthode basée sur la PCR quantitative pour le dépistage de miARN réglementés dans un format de 384 puits. Habituellement deux plaques à 384 puits (cartes) sont fournis, piscines A et B. Groupe A contient généralement mieux caractérisé et plus fortement exprimés miARN de la piscine B. Le niveau relatif de chaque miARN sont déterminés par qPCR, où un miRNA est analysé par bien (figure 5B). Une valeur Ct élevé indique moindre expression de miARN. Tout comme la puce miARN, les résultats obtenus à partir de la DLP-LDA doivent encore être validé pour assurer l&#39;exactitude. Validations peuvent être effectuées en utilisant qPCR. Ici, deux méthodes de détection qPCR sont données pour éviter biais de la méthode et à permettre de confirmation approfondie et de l&#39;enquête de la réglementation miARN. La chimie de détection à base de colorant Cyanine fonctionne différente de DLP que le profilage DLP-LDA est basé sur, et est adapté pour confirmerfins ation. Il peut être moins précis car il détecte tout l&#39;ADN double brin amplifié, mais l&#39;homogénéité de l&#39;échantillon peut être évaluée en effectuant une analyse de courbe de fusion. Figure 6A (panneau de gauche) montre l&#39;analyse de courbe de fusion d&#39;un miRNA, et un pic uniforme clairement défini peut être vu. Des pics multiples seraient observés si l&#39;amorce est montants non spécifiques ou significatifs de l&#39;amorce-dimère est formé (figure 6A, panneau de droite). Dosages DLP miARN, d&#39;autre part, est plus précis que seule l&#39;amplification de la cible de miARN est détectée. graphes d&#39;amplification de chacune des cibles de miARN peuvent être observées, comme le montre la figure 6B. La possibilité de contrôler l&#39;apparition de multiples produits d&#39;amplification en utilisant l&#39;analyse de la courbe de fusion est, cependant, pas disponible avec cette chimie et colorant cyanine qPCR est moins coûteux. colorant cyanine et DLP qPCR essais peuvent parfois généré des résultats légèrement différents. Pour les deux essais de qPCR, par rapport à un réfégène de rence est nécessaire pour déterminer l&#39;expression relative de gènes entre deux échantillons. Le gène de référence, également dénommé gène de ménage, devrait être un gène dont l&#39;expression n&#39;est pas modifié et qui est exprimée à des niveaux similaires à celles du gène d&#39;intérêt. Un exemple d&#39;un gène de référence appropriée dans ces lignées cellulaires de cancer du sein est ARHGDIA, une dissociation Rho GDP-inhibiteur qui fonctionne réactions des protéines Rho d&#39;échange GDP / GTP. Comme observé sur la figure 6C (en haut), le niveau d&#39;ARNm de ARHGDIA n&#39;est pas modifiée entre le véhicule et les échantillons de ligands traités. Le 18S peut également être utilisé, mais son expression élevée nécessite une dilution de 1:500 séparée de l&#39;ADNc stock et qu&#39;il est donc moins approprié. Pour l&#39;analyse des miRNA, il ya encore un débat sur un gène de référence bien définis. Jusqu&#39;à présent, le U6 snRNA est un gène de référence qui est largement acceptée pour l&#39;analyse des miRNA. U6 snRNA est le ~ 110 nucléotides de long, non codantes petit ARN nucléaire qui fonctionne dans le nucléaire spl pré-ARNmgivrage 19. Comme observé sur la figure 6C (en bas), les niveaux d&#39;expression de U6 sont sur ​​la même dans tous les échantillons présentés, permettant ainsi des calculs des niveaux variables de miARN. Une représentation graphique d&#39;un résultat miRNA qPCR pour une comparaison entre le véhicule et les cellules E2-traités qui ont été normalisée à l&#39;U6 de référence peut être observé sur la figure 6D. Ceci illustre un miRNA qui ont été détecté comme non réglementés après le traitement 24 heures de E2, mais qui recèle ER sites de chromatine liaison à proximité de son emplacement génomique, et l&#39;analyse des séries chronologiques identifié réglementation importante 72 heures après le traitement. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig1.jpg" /> Figure 1. Un aperçu de l&#39;approche utilisée pour la détection de la régulation hormonale de miARN dans les cellules cancéreuses du sein. </strong&gt; processus commence avec la culture et le traitement cellulaire, suivie à grande échelle miRNA profilage pour identifier les miARN éventuellement exprimés de manière différentielle, et se termine par des validations qRT-PCR des résultats de tableau. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig2.jpg" /> Figure 2. La comparaison des diverses préparations de l&#39;échantillon et les manipulations d&#39;acide nucléique pour chaque technique de détection de miARN. (A) microréseau miARN en utilisant la méthode de la technologie μParaflo comprend enrichissement, le poly-A de queue et l&#39;étiquetage de ligature (B). Technologie DLP préparation de l&#39;échantillon et de la méthode de détection comprend une synthèse de l&#39;ADNc amorce en boucle qui s&#39;étend après l&#39;étape de dénaturation et fournit un fragment plus long portant l&#39; préparation de l&#39;échantillon amorce inverse et la séquence de la sonde. (C) la technologie de teinture de cyanineet la méthode de détection comprend poly A-tailing, et la synthèse de l&#39;ADNc avec des amorces oligo-dT, y compris une séquence universelle 5. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig3.jpg" /> Figure 3. La culture cellulaire et l&#39;extraction d&#39;ARN. (A) Les cellules cultivées pour illustrer 80% de confluence nécessaire avant le traitement avec le ligand. (B) Représentation graphique de la concentration en ARN et la pureté après extraction. Chaque pic représente un échantillon et un processus d&#39;extraction réussie donne ARN pur (en haut). Un ARN mal extrait ne montre aucun pic d&#39;absorption nette à 260 nm (panneau du bas). <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig4.jpg" /> Figure 4. &amp; #160; ARN contrôle de la qualité des résultats de l&#39;analyse de l&#39;intégrité de l&#39;ARN montrant représentation graphique de l&#39;échelle (en haut), un ARN de bonne qualité (au milieu) et un échantillon d&#39;ARN dégradé (en bas).. <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig5.jpg" /> Figure 5. Une illustration des résultats de profilage miARN. (A) Une représentation de la carte de chaleur des résultats de puces miRNA pour miARN exprimés de manière différentielle. miR-A, B, C sont régulés à la hausse dans le traitement d&#39;échantillons E2 comme indiqué en rouge, tandis que miR-D, E, F, G sont régulés à la baisse dans l&#39;échantillon E2 traité comme indiqué dans le vert. (B) graphes d&#39;amplification pour chaque miRNA des résultats DLP-LDA. miRNA détectés sont amplifiés comme indiqué par augmentation de la valeur Rn. <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51285/51285fig6highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51285/51285fig6.jpg&quot; /&gt; Figure 6. analyse qPCR de la réglementation miARN. (A) de l&#39;analyse de fusion-courbe pour un miRNA analysé en utilisant la détection de colorant de cyanine, montrant l&#39;homogénéité de tous les échantillons testés (à gauche) et l&#39;amplification de fragments multiples (à droite). (B) parcelles d&#39;amplification pour chaque échantillon pour un miARN. Il peut s&#39;agir de cyanine ou DLP de méthodes de détection. (C) la représentation graphique à barres de gènes de référence appropriés pour l&#39;ARNm analyse ARHGDIA (en haut) et pour miRNA analyse snRNA U6 (en bas), ne montrant aucune expression différentielle importante entre les échantillons. (D) résultats miRNA qPCR pour illustrer la comparaison des niveaux relatifs d&#39;expression de miR-135a sur un parcours de temps. Figure 6D est tiré à part de Katchy et al. 1 avec la permission d&#39;Elsevier. Les valeurs sont généralement la moyenne des exper séparéeriences (doublons biologiques) ± SD. Test t de Student est utilisé pour démontrer la signification: * p &lt;0,05.

Moléculaire de signalisation par des œstrogènes et les microARN sont essentiels dans le développement du cancer du sein et de la croissance. L&#39;œstrogène active les récepteurs d&#39;oestrogène, qui sont des facteurs de transcription. De nombreux facteurs de transcription peuvent réguler l&#39;expression de microARN, et microARN régulés par les œstrogènes peuvent être profilée en utilisant différentes techniques de grande envergure.

Profilage de microARN œstrogène réglementés dans les cellules du cancer du sein

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

L'objectif général de cette procédure est de définir les microARN que les récepteurs aux œstrogènes pourraient réguler. Cela est réalisé en premier lieu en préparant les cellules pour une réponse maximale aux œstrogènes, en les cultivant jusqu'à une confluence optimale et en éliminant toute activité œstrogénique. La deuxième étape consiste à induire l'activité transcriptionnelle des récepteurs aux œstrogènes par un traitement à l'estradiol pendant le nombre requis de points temporels.Des contrôles appropriés sont inclus pour les comparaisons. Ensuite, l'ARN, y compris la population de micro-ARN, est extrait et converti en ADNc. Les gènes cibles régulés par les œstrogènes sont ensuite mesurés par PCR quantitative afin de confirmer que le protocole de traitement a été couronné de succès.La dernière étape consiste à déterminer le profil d'expression des microARN à l'échelle du génome à l'aide de technologies de criblage à grande échelle. Enfin, une analyse de confirmation par QPCR est réalisée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine du cancer du sein, comme de savoir si et comment les œstrogènes influencent l'expression des microARN.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le cancer du sein, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme d'autres types de cancer ou de cellules exprimant soit le récepteur des œstrogènes alpha soit bitter. Les cellules MC seven utilisées dans cette étude sont préparées cinq jours avant le traitement dans une hotte stérile. Retirer le milieu du flacon T 75 à l’aide d’une pipette Pasteur stérile reliée à un vide.Lavez doucement les cellules attachées deux fois avec du PBS et détachez les cellules par la trypsine. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire selon le protocole du fabricant. Étiquetez six plaques de 100 millilitres et ajoutez 10 millilitres de milieu dans chaque plaque.Plaquez environ 2 millions de cellules par plaque et répartissez les cellules en agitant doucement la plaque. Incubez les cellules pendant 24 à 48 heures à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence d'environ 80 %. Deux à quatre jours plus tard, retirez les cellules de l'incubateur à 37 degrés Celsius et observez-les au microscope pour vous assurer qu'elles présentent une confluence d'environ 80 %.La confluence cellulaire est un facteur important car elle influence le contact entre les cellules ainsi que des comportements tels que la signalisation intercellulaire et la prolifération. Lavez les cellules deux fois avec du PBS, puis ajoutez le milieu approprié contenant 5 % de FBS qui a été filtré afin d'éliminer les composés œstrogéniques. Incubez les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de CO₂ le jour suivant dans un FBS traité au charbon actif désactivé (D-C-C-F-B-S).Lavez les cellules deux fois avec du PBS et ajoutez le milieu 0,5 %D-C-C-F-B-S approprié. Incubez les cellules pendant 48 heures supplémentaires le jour du traitement. Préparez les réactifs pour le traitement des cellules dans un tube conique de 50 millilitres. Ajoutez d'abord 30 millilitres du milieu 0,5 %D-C-C-F-B-S approprié, puis trois microlitres d'une solution mère de ligand E deux à 0,1 millimolaire. Lavez les cellules deux fois avec du PBS.Veillez à éliminer autant que possible le PBS. Mélangez délicatement le contenu de chaque tube et ajoutez 10 millilitres aux cellules de chaque plaque. Il doit y avoir un ligand par plaque.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 %CO2 pendant une durée choisie comprise entre zéro et 72 heures. Remplacer le milieu si nécessaire après l'achèvement du traitement pendant la période souhaitée. Retirer les plaques de l'incubateur et les transporter sous une hotte. Étant donné que cette procédure utilise une solution toxique de thiocyanate de guanidium et de phénol, portez des équipements de protection individuelle appropriés, puis lavez les cellules deux fois avec du PBS. Ajoutez ensuite un à deux millilitres de solution de thiocyanate de guanidium et de phénol aux cellules de chaque plaque. Veillez à ce que le volume des cellules ne dépasse pas 10 % du volume de la solution de thiocyanate de guanidium et de phénol, et à ce que la plaque soit entièrement recouverte par la solution.Laisser les cellules reposer pendant une minute. Ensuite, utiliser un racloir en caoutchouc pour détacher les cellules et les transférer dans un microcentrifugeur. Les cellules en suspension peuvent être conservées dans cette solution à moins 80 degrés Celsius pendant plusieurs semaines.L'extraction d'ARN de haute qualité est très importante pour la réussite de cette procédure. Par conséquent, les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions sans RNase. Pour extraire l'ARN total à partir de chaque traitement, agiter brièvement le mélange cellulaire dans un vortex pendant une minute, puis centrifuger rapidement.Ajouter 200 microlitres de chloroforme par millilitre de solution de guanidium thiocyanate-phénol. Vortexer pendant 15 secondes, puis incuber de deux à trois minutes à température ambiante. Centrifuger à 11 000 tr/min et 4 degrés Celsius pendant 15 minutes. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube micro-centrifuge.Ajoutez 1,5 volume d'éthanol à 100 % et mélangez à l'aide d'une pipette. Transférez la solution vers une colonne de centrifugation et purifiez l'ARN par purification sur colonne de micro-ARN, suivie d'une dégradation de l'ADN 1D selon le protocole du fabricant. Ensuite, remettez l'ARN en suspension dans 60 microlitres d'eau sans ARNase, prélevez un à deux microlitres d'ARN pour la quantification et l'analyse de qualité, puis stockez le reste de l'ARN à moins 80 degrés Celsius.Après avoir confirmé que le traitement des cellules entraîne la régulation de cibles connues sensibles aux œstrogènes, telles que les ARNm, le profilage des microARN est effectué à l'aide du microfluidique micropower flow, de micropuces, de sondes doublement marquées et de puces à faible densité ou D-L-P-L-D-A, afin d'effectuer le profilage des microARN en utilisant la D-L-P-L-D-A. Retirer les plaques D-L-P-L-D-A du réfrigérateur et les laisser atteindre la température ambiante pendant l'exécution de la réaction de transcription inverse afin de générer de l'ADNc à partir des échantillons d'ARN. Lorsque les plaques D-L-P-L-D-A ont atteint la température ambiante, charger 100 microlitres d'ADNc mélangé aux sondes doublement marquées et au mélange maître PCR dans chacun des huit orifices de remplissage d'une plaque.Centrifuger les plaques de puces. Ouvrir brièvement le système Q-R-T-P-C-R et vérifier que le bloc est destiné à une plaque de 384 puits. Préparer l'analyse.À l'aide du logiciel SDS, sélectionnez la quantification relative. Sélectionnez le numéro de puits et le type de matrice, puis saisissez les descriptions des échantillons pour définir les puits. Exécutez la matrice en utilisant les conditions par défaut de cyclage thermique.Lorsque l'analyse est terminée, enregistrez les résultats, exportez-les vers Microsoft Excel et sauvegardez-les pour une analyse ultérieure. Une méthode permettant de confirmer les régulations des micro ARN consiste à effectuer une analyse cyanure D-Q-P-C-R. La première étape consiste à concevoir des amorces en se basant sur la séquence du micro ARN mature, dont l'amorce directe peut être obtenue sur merebased.org.Convertissez ensuite tous les UES en ts, préparez le CD NA en plaçant un microgramme d'ARN total dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Incluez un témoin négatif avec de l'eau à la place de l'ARN total. Suivez les instructions pour l'ajout de la queue poly A et la synthèse du premier brin de CD NA.Synthèse d'ARN micro à partir d'une synthèse d'ADN complémentaire de première chaîne d'ARN micro et protocole Q-R-T-P-C-R. Diluer l'ADNc résultant au 1/10 avec de l'eau purifiée et conserver à moins 20 degrés Celsius. Se procurer une plaque de réaction de 96 puits.Préparez le mélange maître A-Q-P-C-R. Pour chaque puits de mélange maître micro A-R-N-Q-P-C-R, ajoutez deux picomoles de chaque amorce spécifique sens et de l'amorce universelle. Cinq microlitres de mélange maître deux X-Q-P-C-R et de l'eau purifiée.Prélevez des aliquotes du mélange dans chaque puits. Ajoutez enfin 16 nanogrammes de poly a CD NA pour chaque échantillon et incluez des témoins négatifs. Le volume final de réaction doit être de 10 microlitres par puits. Veillez à prévoir des puits en triple pour chaque échantillon, pour chaque micro ARN, afin d'obtenir des réplicats techniques, ainsi que pour les témoins négatifs.En outre, incluez un ou plusieurs gènes de référence, généralement U six s nrp, ARN et/ou un micro ARN qui n'est pas modifié sur le logiciel du système Q-R-T-P-C-R. Attribuez le marqueur rapporteur et la cible. Saisissez le volume de réaction. Sélectionnez la méthode du cycle seuil comparatif et définissez les puits d'échantillons.Exécutez les plaques en utilisant les paramètres par défaut du cycle. Assurez-vous qu'une analyse de courbe de fusion est effectuée pour tous les cycles utilisant le colorant cyan à la fin du cycle. Enregistrez les résultats et exportez toutes les données, y compris les valeurs de CT, vers Microsoft Excel.L'extraction efficace d'ARN de haute qualité à partir des échantillons est un facteur important pour la réussite de cette étude. Après l'extraction, les concentrations d'ARN sont mesurées à l'aide d'un spectrophotomètre, comme indiqué dans ce résultat représentatif. Chaque pic illustré dans le panneau supérieur représente un échantillon et un processus d'extraction réussi produisant de l'ARN pur.En revanche, un ARN mal extrait, illustré dans le panneau inférieur, ne montre aucun pic d'absorption net à 260 nanomètres. Pour le contrôle qualité de l'ARN, l'intégrité de l'ARN a été mesurée et les résultats comparés à une règle moléculaire d'ARN. Les ARN 18 S et 28 S doivent présenter des pics dans un échantillon d'ARN de bonne qualité, comme indiqué ici.Un échantillon d'ARN dégradé présenterait des pics moins nets et une quantité relative réduite d'ARN 18 S et 28 S, comme illustré ici. L'analyse de la population de microARN peut être effectuée séparément. Les résultats de la puce à microARN, issus d'une comparaison entre les échantillons traités au véhicule et à l'E2, sont représentés graphiquement par cette carte thermique.La mère A, la mère B et la mère C sont surexprimées dans les échantillons traités E deux, comme indiqué en rouge, tandis que la mère D, la mère E, la mère F et la mère G sont sous-exprimées dans l'échantillon traité E deux, comme indiqué en vert. La sélection des microARN dépend de leur seuil de significativité et de leur niveau d'expression. Une valeur P inférieure à 0,05 est généralement considérée comme significative et doit être retenue pour une validation ultérieure par QPCR.Les puces à sondes doublement marquées utilisent la méthode fondée sur A-Q-P-C-R pour dépister les microARN régulés. Ici, on présente les courbes d'amplification en format 384 puits pour les microARN issus des résultats de D-L-P-L-D-A. L'amplification des microARN exprimés est indiquée par une augmentation des valeurs de RN.Les validations peuvent être effectuées à l'aide de deux méthodes de détection QPCR afin d'éviter les biais méthodologiques et de permettre une confirmation et une analyse approfondies des régulations des micro ARN. La première méthode utilise une détection par colorant cyané pour analyser la courbe de fusion d'un micro ARN, servant ainsi de contrôle pour l'amplification. Spécificité. L'amplification du fragment ciblé produira un pic net, uniforme et bien défini, comme illustré dans le panneau de gauche.Plusieurs pics seraient observés si l'amorce est non spécifique ou si des quantités spécifiques de dimère d'amorce se forment, comme illustré par le panneau de droite. Si cela se produit, les données ne peuvent pas être utilisées pour l'analyse d'expression. La deuxième méthode, utilisant des sondes doublement marquées, l'analyse de PCR quantitative, est plus spécifique, car seule l'amplification de l'ARN microcible est détectée sur les courbes d'amplification de chaque cible.Les microARN peuvent être observés comme illustré ici pour les deux dosages de PCRq. Une comparaison avec un gène de référence est nécessaire pour déterminer l'expression relative des gènes entre deux échantillons. Un exemple de gène de référence approprié dans ces lignées cellulaires de cancer du sein est A-R-H-G-D-I-A-A RO inhibiteur de dissociation GDP.Comme observé sur cette figure, le niveau d'ARNm de A-R-H-G-D-I-A n'est pas modifié entre les échantillons traités au véhicule et ceux traités au ligand. Un gène de référence largement accepté pour l'analyse des micro-ARN est U six snrp, ARN. L'ARN nucléaire petit non codant d'environ 110 nucléotides qui fonctionne dans le pré-mRNA nucléaire.Un épissage comme observé sur cette figure montre que les niveaux d'expression de U six sont à peu près identiques dans les échantillons présentés, permettant ainsi le calcul des niveaux variables de micro ARN. Cette dernière figure présente une représentation graphique des résultats de qPCR d'ARN micro-ARN à partir de cellules traitées au véhicule et à l'E deux, comparant les niveaux d'expression relatifs d'un micro ARN spécifique, le mer 135 A, au cours du temps. Ce micro ARN a été détecté comme non régulé jusqu'à 24 heures après le traitement à l'E deux, mais une régulation significative a été observée 72 heures après le traitement selon cette procédure.D'autres méthodes, comme l'immunoprécipitation de la chromatine du récepteur N SDR, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que savoir si le microARN est directement régulé par le récepteur par liaison à des régions cis-régulatrices de la chromatine. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'analyser de façon rigoureuse la régulation des microARNs médiée par les œstrogènes. Il est très important de réaliser les différents contrôles et de répliquer les étapes telles que décrites dans ce protocole afin de s'assurer que vous détectez de véritables régulations et non des variations biologiques ou techniques.

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