Séquentiel In vivo Imagerie des cellules souches / progénitrices ostéogéniques lors de la réparation de la fracture

L’objectif global de cette procédure est de suivre et de quantifier séquentiellement la migration, la prolifération et la différenciation des cellules souches ostéogéniques endogènes et des cellules progénitrices dans la réparation des fractures osseuses. Ceci est accompli en marquant d’abord le virus mixo, la résistance au virus de la grippe, une ou MX une cellule positive in vivo par injection d’acide poly cynique poly cytonique, puis en éliminant les cellules hématopoïétiques résidentes MX 1 positives par irradiation. Dans un deuxième temps, des cellules de moelle osseuse de type sauvage sont systématiquement administrées aux souris irradiées.

Ensuite, des micro-fractures sont générées dans la zone Cal de la souris par le perçage de l’aiguille. Enfin, une imagerie séquentielle intra-flaconnale de la réparation de la micro-fracture est réalisée. En fin de compte, ces images intravitales peuvent être utilisées pour évaluer la dynamique de l’afflux et de l’expansion des cellules souches et progénitrices ostéogéniques dans les sites de fracture.

Le principal avantage de cette technique est donc qu’elle permet une imagerie répétitive in vivo des cellules souches ostéogéniques et des cellules progénitrices au cours de la cicatrisation des fractures. L’implication de cette technique s’est étendue à la thérapie de la cicatrisation des fractures et de l’ostéoporose. Comme cette méthode offre un nouvel outil pour le suivi des cellules souches progénitrices ostéogéniques endogènes dans la régénération et la réparation osseuses.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car une génération de la microfracture avec des lésions tissulaires minimales et l’imagerie in vivo répétée de la blessure de fracture sans induire de formation de cicatrices graves sont importantes pour la méthode et techniquement difficiles Pour marquer MX une cellule positive in vivo, commencez par injecter 200 microlitres d’acide poly cyto-ilique polyacide pour 20 grammes de MX un poids de souris rapporteure Cree intrapéritonéale une fois tous les deux jours pendant 10 jours. Ensuite, pour éliminer le MX résident, une cellule hématopoïétique positive irradie les souris injectées avec une dose unique de 9,5 gras. Après 24 heures, transplantez une fois 10 cellules de moelle osseuse de type sauvage par voie intraveineuse par souris.

Quatre à six semaines plus tard, anesthésie la souris par injection intrapéritonéale avec 50 microlitres de kétamine xylazine Après avoir confirmé la sédation par pincement de l’orteil, coupez la paire de cuir chevelu de la souris transplantée de cellules de moelle osseuse, puis stérilisez la peau exposée avec un tampon d’alcool à 70 %. Appliquez du gel lacrymal pour prévenir la déshydratation de la cornée, puis faites une incision transversale de moins d’un centimètre de long sur le cuir chevelu, en commençant par une oreille et en terminant par l’autre. Ensuite, tournez l’animal d’environ 60 degrés et continuez l’incision jusqu’à ce qu’il atteigne environ deux à trois millimètres du nez à l’aide d’une pince.

Tirez le lambeau de tissu vers les côtés de l’animal pour séparer la peau, les os frontaux et l’intersection des sutures sagittales et coronales doivent maintenant être clairement exposés. Rincez la surface ouverte avec du PBS stérile, puis essuyez doucement les poils résiduels avec des cotons-tiges. Ensuite, pour générer des microfractures sur le veau, tenez la tête de souris d’une main et une aiguille de calibre 30 de l’autre.

Utilisez la pointe de l’aiguille de calibre 30 pour percer doucement une micro-ponction d’un côté des os frontaux près de l’intersection des sutures sagittales et coronales. Pour éviter de pénétrer dans le cerveau, passez à un calibre plus grand et tournez la nouvelle aiguille pour élargir le trou de perforation à environ 0,5 millimètre de diamètre. Après avoir généré une deuxième ponction sur l’os frontal controlatéral, déposez continuellement du PBS dans chaque essuyage ponctuel jusqu’à ce que le saignement cesse.

Ensuite, pour éviter le dessèchement, appliquez une goutte suffisante de solution saline physiologique stérile sur le crâne pour couvrir entièrement la zone permettant d’acquérir les images Vidal. Allumez d’abord le scanner laser polygonal pour permettre l’acquisition simultanée d’images multicanaux à une fréquence vidéo de 30 images par seconde. Ensuite, allumez le laser saphir titane femtoseconde pour l’imagerie multiphotonique.

Réglez la puissance et la longueur d’onde à 880 nanomètres pour l’imagerie de génération de seconde harmonique de l’os calvarial à 440 nanomètres pour l’excitation de la tomate GFP et TD, allumez les lasers à semi-conducteurs de 491 nanomètres et 561 nanomètres. Ensuite, allumez les détecteurs à tube photomultiplicateur pour chaque signal : un filtre passe-bande de 435 plus ou moins 20 nanomètres pour la génération de secondes harmoniques, un filtre passe-bande de 528 plus ou moins 19 nanomètres pour GFP et un filtre passe-bande de 590 plus ou moins 20 nanomètres pour la tomate TD. Maintenant, placez l’animal sur une platine de microscope motorisée de l’axe XYZ au-dessus d’un coussin chauffant électrique réglé à 37 degrés Celsius.

Utilisez du ruban adhésif pour maintenir la souris en position, puis appliquez une goutte de gel chaud à base de méthylcellulose à 2 % sur le crâne. Pour éviter le dessèchement, placez une vitre de protection sur la zone d’imagerie. Utilisez ensuite un objectif à immersion dans l’eau 30 x avec une ouverture numérique de 0,9 et le contrôleur des axes XY et Z pour détecter le signal SHG des os.

Pour trouver la surface du calver, identifiez un point de repère crucial tel que l’intersection entre les sutures sagittales et les sutures coronales, et acquérez une image. Marquez les coordonnées XY et Z du point de repère, puis continuez à chercher l’emplacement de la blessure en utilisant le SHG et les signaux fluorescents comme guides. Lorsque chaque région d’intérêt est trouvée, acquérez une image du meilleur plan focal contenant le SHG et les signaux fluorescents des cellules d’intérêt.

Enregistrez les coordonnées XY, Z et la distance jusqu’à l’intersection des sutures sagittale et coronale afin de définir leur emplacement précis pour la prochaine série d’imagerie. Ensuite, pour collecter les structures cellulaires et osseuses 3D de la blessure de fracture. Enregistrez des images à des intervalles d’empilement en Z d’environ deux à cinq microns avec une profondeur d’environ 100 microns à partir de la surface de l’os endo.

Enfin, après l’imagerie, les deux sites de blessure utilisent plusieurs gouttes de solution saline stérile pour éliminer le gel de méthylcellulose à 2 % du crâne. Maintenant, enduisez la surface d’antibiotiques et couvrez le crâne avec les lambeaux cutanés, refermez le cuir chevelu avec un fil de suture hypoallergénique et maintenez l’animal dans une chambre de récupération chaude jusqu’à ce qu’il retrouve une conscience suffisante. Après trois à cinq jours, répétez les étapes d’imagerie intravitale pour suivre le changement cellulaire pendant la cicatrisation de la fracture.

Dans cette expérience représentative, deux microfractures ont été générées sur les os frontaux de l’ostéocalcine de tomate gène MX one, des souris GFP après irradiation et remplacement de la moelle osseuse l’imagerie intra vitale séquentielle 3D des micro-fractures a montré une relocalisation des cellules souches ostéogéniques et progénitrices positives à la tomate dans le site de la fracture au deuxième jour, ainsi que leur expansion au cinquième jour. Bien qu’aucun ostéoblaste positif à la GFP n’ait été détecté à ce moment-là, le jour 12, un sous-ensemble d’ostéoprogéniteurs près de la surface de la fracture a initié la différenciation des ostéoblastes positifs à la GFP positive à la tomate, comme l’indique la flèche, l’accumulation de nouveaux ostéoblastes et la formation de nouveaux os au jour 21 indiquent que la migration et la prolifération des cellules progénitrices ostéogéniques étaient un mécanisme majeur pour fournir de nouveaux ostéoblastes pour guérir la fracture. Pour vérifier si cette méthode fournit un résultat cohérent et quantitatif du nombre d’ostéogéniteurs pendant la cicatrisation des fractures, les cellules souches et progénitrices ostéogéniques positives MX one YFP ont été suivies pendant 14 jours après la blessure.

Un petit nombre de progéniteurs ont été détectés de façon constante sur le site de la blessure au bout de trois jours. Le nombre de cellules n’a cessé d’augmenter au septième jour, atteignant un pic de population au 10e jour qui s’est maintenu au 14e jour. La cinétique de la génération des progéniteurs ostéo-vitaux a été quantifiée en mesurant l’intensité du signal YFP au cours du temps, et corrélée avec celle observée par microscopie intra-vitale.

Les progéniteurs ont été observés pour la première fois le troisième jour, ont atteint un pic le 10e jour et sont restés à une intensité tout aussi élevée jusqu’au 14e jour. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que des techniques de suture qualifiées et un saignement minimal peuvent réduire la formation de cicatrices et diminuer l’autofluorescence de fond. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’imager et de suivre la migration, la prolifération et la différenciation des cellules souches progénitrices ostéogéniques endogènes dans le processus de réparation des fractures.