Excitotoxiques stimulation de Microslices cerveau comme un In vitro Modèle de l'AVC

L’objectif global de cette procédure est d’appliquer une stimulation cytotoxique à des micro-tranches de cerveau pour créer un modèle d’AVC in vitro. Ceci est accompli en préparant d’abord des micro-tranches à partir d’un cerveau fraîchement isolé. La deuxième étape consiste à équilibrer les micro-tranches par une légère agitation.

Une fois équilibrées, les micro-tranches sont prêtes à recevoir une variété de manipulations expérimentales. En fin de compte, les résultats montrent que les micro-tranches sont viables pendant au moins deux heures après la génération. Le principal avantage de notre technique par rapport à d’autres techniques existantes, telles que les cultures embryonnaires primaires et neuronales, est que notre technique utilise des tranches de tissu cérébral mature, qui contiennent plus d’un type de cellule, et sont donc plus représentatives du tissu cérébral intact.

La première étape consiste à obtenir du tissu cérébral frais. Trempez le cerveau dans une petite quantité de tampon Krebs chaud. Pour enlever tout résidu de peau, de fourrure ou de sang, préparez un hachoir à macle wain avec deux feuilles de papier filtre humidifiées avec un tampon Krebs chaud.

Lorsque vous êtes prêt, placez le cerveau sur la platine de l’hélicoptère. Gardez le cerveau et le papier filtre humides avec un tampon à crebs chaud pendant que vous travaillez pour empêcher le cerveau de glisser. Évitez de laisser trop de liquide s’accumuler à la surface.

Découpez le cerveau en sections coronales de 250 micromètres. Ensuite, tournez la platine de 90 degrés et créez des tranches sagittales de 250 micromètres. Après cette étape, les sections du cerveau sont appelées micro-tranches.

Placez les micro-tranches dans un fond rond avec deux avec 10 à 15 millilitres de tampon à crêpes chaudes. Agitez doucement le tube jusqu’à ce que des micro-tranches individuelles soient suspendues, puis laissez-les se déposer sous l’effet de la gravité. Retirez soigneusement le surnageant, qui sera trouble en raison des débris de cellules en suspension, et ajoutez 10 millilitres de tampon frais et chaud dans le tube.

Répétez la procédure de lavage quatre fois pour éliminer la majorité des débris une fois soigneusement lavés. Équilibrez les micro-tranches à 37 degrés Celsius en les secouant doucement ou en les inversant, et changez le tampon Krebs toutes les 15 minutes pendant une heure au total. Après ce temps, ajoutez deux millilitres de tampon Krebs frais à 37 degrés Celsius et transférez 15 à 20 micro-tranches dans un tube de polystyrène à fond plat de cinq millilitres.

À l’aide d’une pointe de pipette à alésage extra large avec des bords lisses, répartissez uniformément les micro-tranches sur la base du tube en une seule couche afin que chaque micro-tranche ne soit pas à plus de quelques millimètres de l’atmosphère oxygénée. Une fois correctement disposées, incubez les micro-tranches dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pour fournir une bonne oxygénation aux micro-tranches. Passez continuellement le carbogène sur la suspension des micro-tranches avec les positions de la conduite de gaz juste au-dessus de la surface pour éviter la perturbation mécanique des micro-tranches pour un contact direct avec le gaz Pour les meilleurs résultats.

Il est essentiel que les micro-tranches soient correctement aérées. Il est important que la conduite de gaz soit placée à la bonne distance de la surface de la suspension du microsite. Plusieurs lignes peuvent être fusionnées pour permettre à plusieurs stimulations de se produire.

Dans le même temps, une variété de stimuli peut être utilisée. Dans cet exemple, les micro-tranches subissent une stimulation AMPA. Traitez les micro-tranches avec un stimulus cytotoxique ou un tampon Krebs seul.

Pour un contrôle sur groupe stimulé. Retirez la solution d’incubation à différents moments après la stimulation et remplacez-la par 300 microlitres de tampon d’homogénéisation glacé au moment souhaité. Après la stimulation, homogénéisez les micro-tranches sur de la glace à l’aide d’un homogénéisateur en verre de téflon et stockez l’homogénéisateur à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt pour une analyse plus approfondie.

Les taux de respiration montrent que les micro-tranches prélevées sur le cerveau antérieur du poulet sont viables jusqu’à deux heures après la génération. Les niveaux élevés d’A TP et de faible A DP trouvés dans les micro-tranches sont également caractéristiques des cellules viables. Dans cet exemple, la teneur en potassium des tissus a été mesurée et s’est avérée être juste au-dessus du bruit de fond après dissection, mais pour avoir augmenté lors de l’incubation avec le tampon Krebs, l’ajout de WABE et d’EGTA a entraîné une diminution de la teneur en potassium des tissus, démontrant que les micro-tranches pompent normalement activement le potassium et que les niveaux ne sont pas dus au potassium piégé dans les tissus morts ou les espaces interstitiels.

Ici, des micro-tranches ont été générées à partir du striatum et du cortex sensoriel de rats mâles et dépolarisées à l’aide d’un tampon de crebs à haute teneur en potassium. Le taux de phosphorylation de la colle N deux B variait entre le cortex et le striatum, tandis que le taux de phosphorylation de la colle a un était similaire entre les deux zones. Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en environ deux heures si elle est exécutée correctement.