Name: Excitotoxiques stimulation de Microslices cerveau comme un In vitro Modèle de lAVC (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Apprenez à stimuler des microtranches cérébrales excitotoxiques pour modéliser l'AVC in vitro. Cette technique préserve le tissu cérébral mature et les interactions cellulaires tout en réduisant l'utilisation animale.

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Ce travail a été soutenu par des fonds de recherche du Conseil national de la santé et de recherche médicale de l&#39;Australie, le Hunter Medical Research Institute et l&#39;Université de Newcastle.

Toutes les procédures sont exécutées avec l&#39;approbation de l&#39;Université de Newcastle protection des animaux et de l&#39;éthique, ainsi que conformément aux directives et règlements pertinents, y compris la Loi NSW recherche sur les animaux, le règlement Animal Research NSW, et le Code australien de pratique pour la Entretien et utilisation des animaux à des fins scientifiques. Une. Dissection du tissu cérébral <ol><li> Sacrifiez vieux douze semaines chez les rats mâles par décapitation. Les rats peuvent soit être sacrifiés par décapitation et magnifique, ou peuvent être d&#39;abord anesthésiés avec de l&#39;isoflurane (5% induction, entretien 1,5-2%) dans 70% de N 2 et 30% O 2, puis décapités. </li><li> Retirez le cerveau du crâne aussi rapidement que possible (idéalement, ce devrait être réalisée en moins de 2 minutes). </li><li> Retirez le cortex par dissection main-libre. La dissection doit être effectuée dans le minimum de temps possible, avec le moins de dommages au cerveau que possible afin de Maintain l&#39;intégrité des tranches. </li><li> Pour enlever toute la peau résiduelle, la fourrure, le sang, etc, plonger le cerveau dans une petite quantité (3-5 ml) de 37 ° tampon C Krebs (chlorure 118 mM de sodium, 4,7 mM de chlorure de potassium, 1,3 mM de chlorure de calcium, 1,2 mM de dihydrogénophosphate de potassium, sulfate de magnésium 1,2 mM, du bicarbonate de sodium 25 mM, 11,7 mM de glucose, l&#39;acide éthylènediaminetétraacétique disodique mM 0,03 (EDTA), équilibrée avec 95% d&#39;oxygène / 5% de dioxyde de carbone (carbogène), pH 7,4). </li></ol> 2. Préparation de Microslices <ol><li> Placez le cerveau sur la scène d&#39;un hacheur McIlwain sur lequel deux tranches de papier filtre ont été placés et humidifié avec un tampon Krebs chaud. Gardez le cerveau et le papier filtre imbibé de tampon Krebs chaud, mais pas si humide qu&#39;il ya du liquide libre sur la surface du papier qui peut causer le cerveau à glisser autour. </li><li> Trancher le cerveau en 250 um coupes coronales. Comme les nutriments, l&#39;oxygène et les déchets eà normalement échangées avec l&#39;alimentation en sang sont échangés avec un fluide qui entoure le tissu dans le tissu neural d&#39;isolement, la taille des tranches ne doit pas être supérieure à 400 pm d&#39;épaisseur pour permettre l&#39;oxygénation et l&#39;échange des nutriments suffisants pour se produire. </li><li> Tourner la scène McIlwain 90 °. </li><li> Trancher cerveaux dans 250 um coupes sagittales. Ici, ces coupes de cerveau (250 um x 250 um tranches de longueur variable en fonction de l&#39;épaisseur du tissu) sont appelés microslices. </li><li> Placez les microslices dans un tube à fond rond avec 10-15 ml 37 ° C tampon Krebs (la quantité de tampon Krebs utilisée dépendra de la quantité de tissu). </li></ol> 3. L&#39;équilibrage de Microslices <ol><li> Agiter doucement jusqu&#39;à ce que microslices individuelles sont suspendues, et alors leur permettre de régler par gravité. </li><li> Retirez délicatement le surnageant, qui sera trouble en raison de débris de cellules en suspension, et ajouter 10 ml frais 37 ° CTampon de Krebs au tube. </li><li> Répéter cette opération de lavage quatre fois, ce qui se traduira par la suppression de la majorité des débris. </li><li> Suite à cela, équilibrer les microslices à 37 ° C avec agitation douce / inversion, et changer le tampon Krebs toutes les 15 min pendant 1 heure au total. </li><li> A ce moment, ajouter 2 ml de tampon 37 ° C Krebs frais, et transférer 15-20 microslices (150 pi de MicroSlice suspension) au polystyrène fond plat tubes de 5 ml en utilisant un large pourboire supplémentaire de la pipette d&#39;alésage avec angles arrondis (qui peuvent être créées par coupe ~ 2 mm de l&#39;extrémité d&#39;une pointe de P1000). Etaler les microslices uniforme sur le fond du tube en une seule couche, de sorte que chaque MicroSlice n&#39;est pas à plus de quelques millimètres de l&#39;atmosphère oxygénée. </li></ol> 4. Stimulation excitotoxiques <ol><li> Incuber les microslices à 37 ° C, et de passer sans cesse CARBOGEN sur la surface de la suspension de 150 pi de MicroSlice, en utilisant une conduite de gaz qui est la positioned juste au-dessus de la surface de la suspension de MicroSlice (pour éviter une rupture mécanique). </li><li> Traiter microslices soit avec mM glutamate 150 pi 5 + 100 uM de glycine dans du tampon Krebs (stimulus excitotoxic: concentration finale de 2,5 mM glutamate + 50 uM glycine) ou 150 pi de tampon Krebs seul (contrôle non stimulé). Une variété de stimuli peut être utilisé à cette étape (y compris, mais sans s&#39;y limiter, l&#39;AMPA, NMDA + glycine, KCl dépolarisation, et de l&#39;oxygène / privation de glucose). </li><li> Retirer la solution d&#39;incubation à différents moments post-stimulation (0, 30, 60, 90, 120 et 300 sec), et la remplacer par 300 ul d&#39;homogénéisation du tampon refroidi à la glace (Tris 30 mM, pH 7,4, 1 mM d&#39;éthylène glycol l&#39;acide tétra-acétique, 4 mM d&#39;EDTA, 100 pM de molybdate d&#39;ammonium, le pyrophosphate de sodium 5 mM, fluorure de sodium 25 mM, orthovanadate de sodium à 1 mM, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride, cocktail complet d&#39;inhibiteur de protease). </li><li> Homogénéiser microslices sur la glace, en utilisant un verre Téflon Dounce Homogenizer(20 coups; 700 rpm). </li><li> homogénats de conserver à -80 ° C, et diverses molécules de signalisation, des molécules de la mort, etc peuvent être mesurés par western blot. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont pas de conflit d&#39;intérêt concernant un quelconque des travaux menés dans ce manuscrit.

Ici, une technique in vitro pour la génération de microslices qui peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans l&#39;excitotoxicité et de mort cellulaire médiée par l&#39;ischémie dans un tissu de cerveau mature intact est décrite. Cette technique produit un tissu viable (figures 1-3), qui est métaboliquement semblable à de plus grandes tranches organotypiques 15. En outre, ce modèle de MicroSlice correspond étroitement à la réponse observée après ex...

La forme la plus courante d&#39;AVC est un accident ischémique cérébral, qui se produit quand un vaisseau sanguin cérébral devient occlus. L&#39;ischémie tissulaire qui résulte de l&#39;arrêt de la circulation sanguine provoque une dépolarisation des membranes généralisée, la libération des neurotransmetteurs excitateurs, et une élévation soutenue de calcium intracellulaire, qui conduit à l&#39;activation de la mort cellulaire cheminements de 1. Ce processus a été appelé «excitotoxicité», et est une voie commune impliqué dans la mort neuronale produite par une variété de pathologies, y compris la course 2. L&#39;inhibition des voies de signalisation impliquées dans l&#39;excitotoxicité et autres cascades de mort des cellules neuronales est une approche intéressante pour limiter les dégâts neuronale après un AVC. Identifier les mécanismes moléculaires précis impliqués dans l&#39;excitotoxicité et accident vasculaire cérébral ischémique peut être difficile lors de l&#39;utilisation des systèmes animaux entiers. En tant que tel, embryonnaire primaire et «neuronale comme &#39;(par exemple neuroblastoma et adénocarcinome lignées immortalisées) des systèmes de culture de cellules sont souvent utilisés. Les principaux avantages de ces modèles est qu&#39;ils sont faciles à manipuler, relativement rentable, et la mort cellulaire peuvent être facilement mesurés et quantifiés. Cependant, les voies de signalisation peuvent être modifiées par les conditions de culture utilisées, 3,4 et les neurones immatures et immortalisés lignes peuvent exprimer différents récepteurs et des molécules de signalisation par rapport à mûrir cerveau 5-8. En outre, des cultures de neurones permettent seulement l&#39;examen d&#39;un type de cellule (ou deux, si un système de co-culture est utilisée), tandis que le tissu cérébral intact est hétérogène, contenant une variété de types de cellules qui interagissent les uns avec les autres. Les systèmes de culture de tranches organotypiques minces (explants de tissu cérébral) sont également utilisés, et ces modèles permettent l&#39;étude de populations hétérogènes de cellules tels qu&#39;ils sont trouvés in vivo. Cependant, seule une quantité limitée de tissu peut être obtenue à partir de chaque animal pour l&#39;utilisation de cette technique, des tranches peutpas être cultivées pendant aussi longtemps que des lignées cellulaires immortalisées, et au milieu de culture à long terme peut conduire à des altérations dans les voies de signalisation des récepteurs et dans les tranches. Alors que le cerveau adulte peut être utilisé pour générer des tranches organotypiques, tranches de cerveau immature se prêtent mieux à la culture, et sont le plus souvent utilisés. Il est donc nécessaire de développer des modèles qui imitent ou représentent cerveau mature intacte, qui sont faciles à utiliser, dans laquelle les voies de signalisation neuronales peuvent être examinées. Ici, une technique in vitro portant sur ​​des tissus nerveux intact qui peut être utilisé pour élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans la mort cellulaire suite à une insulte excitotoxique ou ischémique est décrite. Cette technique permet de réduire le nombre d&#39;animaux requis pour effectuer une expérience, est reproductible, et génère des tissus viables qui se comporte d&#39;une manière similaire à métaboliquement plus grandes tranches organotypiques. En outre, le circuit neuronal, les interactions cellulaires, et co postsynaptiquempartment reste partiellement intact. Le tampon physiologique utilisé permet les membranes cellulaires pour «refermeture», et permet aux cellules de retrouver leur résistance de la membrane d&#39;origine 9. Ce modèle de tranche de cerveau est capable d&#39;imiter fidèlement réponses observées suivant excitotoxicité médiée par des lésions cérébrales 10, et peut être utilisé pour examiner les mécanismes moléculaires impliqués dans la course.

<table><tbody><tr><td>Guillotine</td><td></td><td></td><td>Utilisé pour décapiter des animaux</td></tr><tr><td>Matériel</td><td></td><td></td> chirurgical <td>Pinces, ciseaux, pinces à épiler, etc., pour l’ablation et la dissection du cerveau</td></tr><tr><td>Hélicoptère McIlwain</td><td>Les hélicoptères McIlwain sont fabriqués/distribués par une gamme d’entreprises, dont Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments et Ted Pella.</td><td></td><td>Utilisé pour générer 100-400 &#181 ; m sections cérébrales.</td></tr><tr><td>Tubes en plastique à fond rond</td><td>Greiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td></td><td></td><td>Pour maintenir le tissu à 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>Humidificateur/appareil</td><td></td><td></td><td>d’aération Utilisé pour conserver les microtranches dans un environnement humidifié et oxygéné</td></tr><tr><td>Tubes en polystyrène à fond plat</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dounce Homogénéisateur</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

excitotoxiques stimulation de microslices cerveau comme un<em&gt; in vitro</em&gt; modèle de l&#39;avc

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examiner les mécanismes moléculaires impliqués dans les conditions neuropathologiques, tels que l&#39;AVC ischémique, il peut être difficile lors de l&#39;utilisation des systèmes animaux entiers. Comme les systèmes de culture cellulaire »neuronale comme &#39;tel, primaire ou sont couramment utilisés. Bien que ces systèmes sont relativement faciles à travailler avec, et des systèmes de modèles utiles dans lequel divers résultats fonctionnels (tels que la mort cellulaire) peuvent être facilement quantifiés, les résultats examinés et les voies dans les neurones immatures cultivés (tels que voies de mort cellulaire excitotoxicité médiée) ne sont pas nécessairement les mêmes que ceux observés dans le cerveau mature, ou dans un tissu intact. Par conséquent, il est nécessaire de développer des modèles dans lesquels les mécanismes cellulaires dans les tissus nerveux matures peuvent être examinés. Nous avons mis au point une technique in vitro qui peut être utilisé pour étudier une variété de voies moléculaires dans le tissu nerveux intact. La technique décrite ici utilise le tissu cortical de rat, mais cette technique peut être adapté pour utiliser un tissuà partir d&#39;une variété d&#39;espèces (par exemple, la souris, le lapin, le cochon Guinée, et le poulet) ou des régions du cerveau (par exemple, l&#39;hippocampe, le striatum, etc.) En outre, une variété de stimulations / traitements peut être utilisée (par exemple, excitotoxique, l&#39;administration d&#39;inhibiteurs, etc.) En conclusion, le modèle de tranche de cerveau décrit ici peut être utilisé pour examiner une variété de mécanismes moléculaires impliqués dans les lésions cérébrales excitotoxicité médiée.

Microslices générés en utilisant cette procédure sont viables, et une variété d&#39;espèces (par exemple, le rat, la souris et le poulet) peuvent être utilisés pour produire microslices. Trois mesures indépendantes de viabilité ont été utilisés: le taux de respiration (Figure 1), les ratios de nucléotides adénine (figure 2), et la teneur en potassium des tissus (Figure 3). Grâce à ces mesures, il a été démontré que microslices restent viables pendant au moins 2 heures a...

Nous avons développé un modèle de tranche de cerveau qui peut être utilisé pour examiner les mécanismes moléculaires impliqués dans les lésions cérébrales excitotoxicité médiée. Cette technique génère tissu cerveau mature viable et réduit le nombre d&#39;animaux nécessaires à l&#39;expérimentation, tout en gardant la circuiterie neuronale, interactions cellulaires, et des compartiments post-synaptiques en partie intact.

Excitotoxiques stimulation de Microslices cerveau comme un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de l&#39;AVC

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

L'objectif général de cette procédure est d'appliquer une stimulation cytotoxique à des microtranches cérébrales afin de créer un modèle in vitro d'accident vasculaire cérébral. Cela est réalisé en préparant d'abord des microtranches à partir d'un cerveau fraîchement isolé. La deuxième étape consiste à équilibrer les microtranches avec une agitation douce.Une fois équilibrés, les microtranches sont prêts à subir diverses manipulations expérimentales. En fin de compte, les résultats montrent que les microtranches restent viables pendant au moins deux heures après leur préparation. Le principal avantage de notre technique par rapport aux autres techniques existantes, telles que les cultures primaires de neurones embryonnaires, est qu'elle utilise des tranches de tissu cérébral mature, contenant plus d'un type cellulaire, et qui sont donc plus représentatives du tissu cérébral intact.La première étape consiste à obtenir un tissu cérébral frais. Plongez le cerveau dans une petite quantité de tampon de Krebs tiède. Pour éliminer tout résidu de peau, de poils ou de sang, préparez un hachoir Macle Wain avec deux feuilles de papier filtre humidifiées au tampon de Krebs tiède.Lorsque vous ê

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Photothrombosis est une technique rapide, peu invasive pour induire petite et bien délimitée du myocarde dans les domaines d'intérêt de façon très reproductible. Il est particulièrement adapté pour étudier les réponses cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la plasticité du cerveau chez les souris transgéniques.

Ischémie Photothrombotic: A photochimique modèle de lésion corticale minimalement invasive et reproductible pour les études de course de souris

Un protocole pour la culture organotypique de tranche entorhino-hippocampique, ce qui permet la reproduction de nombreux aspects de la lésion cérébrale ischémique, est présentée. En étudiant les changements de la neurovasculaire en plus des changements dans les neurones, ce protocole est un outil polyvalent pour étudier les changements plastiques dans le tissu nerveux après une blessure.

L&#39;analyse de neurovasculaire Rénovation dans Entorhino-hippocampe cultures organotypique de tranche

Nous présentons ici une méthodologie pour la production d’un coup focal dans la substance blanche murine par injection locale d’un inhibiteur endothélial irréversible de l’oxyde nitrique synthase (eNOS) (L-Nio). Deux variantes stéréotaxiques sont présentées, le traçage neuronal rétrograde et le marquage et la dissection de tissus frais, qui élargissent les applications potentielles de cette technique.

A Stroke Versatile modèle murin de Subcortical substance blanche pour l&#39;étude de axonale Degeneration et blanc Matière Neurobiologie

Nous présentons une méthode qui peut donner un aperçu de l’événements précoces qui sous-tendent la neurodégénérescence davantage et basée sur la technique de cerveau établies ex vivo , combinant les avantages des expériences in vivo et in vitro . En outre, il représente une occasion unique pour une comparaison directe du groupe traité et non traité dans le même plan anatomique.

Une autre approche pour étudier les événements primaires dans la neurodégénérescence utilisant des coupes de cerveau de Rat Ex Vivo

La microglie, les résidents cellules immunitaires du cerveau, répondre rapidement avec des changements morphologiques aux modifications de leur environnement. Ce protocole décrit comment utiliser la microscopie biphotonique à étudier l’attraction des microglies processus vers la sérotonine ou l’ATP en tranches cérébrale aiguë des souris.

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Ici, nous décrivons la préparation des tranches organotypiques rhinal de cortex-hippocampe. Sous une privation progressive et commandée de sérum, ces tranches dépeignent l’évolution épileptique-comme des événements et peuvent être considérées un modèle ex vivo d’épileptogenèse. Ce système représente un excellent outil pour surveiller la dynamique de l’activité spontanée, ainsi que pour évaluer la progression des caractéristiques neuro-inflammatoires tout au long de l’épileptogenèse.

Un modèle d’épileptogenèse dans les cultures de tranches organotypiques cortex rhinal-hippocampe

Décrit ici est le modèle d’AVC photothrombotique, où un AVC est produit à travers le crâne intact en induisant une occlusion microvasculaire permanente à l’aide d’un éclairage laser après administration d’un colorant photosensible.

Modélisation de l’AVC chez la souris: lésions corticales focales par photothrombose

Le protocole vise à fournir des méthodes pour l’encéphalomyosynangiose - greffe d’un lambeau musculaire temporalis vasculaire sur la surface piale du tissu cérébral ischémique - pour le traitement de l’AVC ischémique aigu non-moyamoya. L’efficacité de l’approche dans l’augmentation de l’angiogenèse est évaluée à l’aide d’un modèle d’occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne chez la souris.

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Ce protocole contient une description détaillée d’une approche étape par étape pour un modèle murin à fenêtre crânienne chronique et embolie microvasculaire, optimisé pour l’imagerie in vivo à deux photons utilisant des microsphères fluorescentes en polystyrène.

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Il ya plus de preuves que le préconditionnement ischémique (PC) - un défi ischémique non dommageable pour le cerveau - confère une protection contre les transitoires à un accident ischémique dommageable ultérieure. Nous avons établi bilatérale carotide commune occlusion de l'artère (BCCAO) comme un stimulus de préconditionnement pour induire une tolérance ischémique précoce (IT) à transitoire ischémie cérébrale focale (induite par occlusion de l'artère cérébrale moyenne, MCAO) dans souris...

Occlusion bilatérale de l&#39;artère carotide commune comme un stimulus suffisant pour provoquer le préconditionnement précoce Tolérance ischémique à une ischémie cérébrale focale

Apprenez à stimuler des microtranches cérébrales excitotoxiques pour modéliser l'AVC in vitro. Cette technique préserve le tissu cérébral mature et les interactions cellulaires tout en réduisant l'utilisation animale.

Excitotoxiques stimulation de Microslices cerveau comme un

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