Le dosage de la dégradation par le protéasome dans un système exempt de cellules dans les plantes

L’objectif général de l’expérience suivante est d’analyser la stabilité des protéines dans un système acellulaire. Ceci est réalisé par l’inoculation d’Oceana Biana avec différentes souches d’agrobactéries. Hébergeant la protéine d’intérêt contenant une construction binaire.

La protéine totale est ensuite extraite des feuilles de la plante. Les feuilles sont transférées dans des tubes micro-fuges et incubées à température ambiante pendant des périodes de temps croissantes. Ensuite, les échantillons de protéines sont résolus par SDS Acrylamide, gel, électrophorèse et électro-transfert sur une membrane de nitrocellulose.

Afin de détecter la protéine d’intérêt à l’aide d’un anticorps spécifique, on obtient des résultats qui montrent une stabilité protéique en présence ou en l’absence d’un inhibiteur protéasomale spécifique sur la base d’une analyse par western blot. Nous décrivons ici une méthodologie simple pour étudier la stabilité du substrat du kyste du protosome INE en présence ou en l’absence de l’un des composants essentiels de la voie de dégradation du protéasomal dans un système acellulaire. Ainsi, ces méthodes peuvent donner un aperçu d’une dégradation protéasomale plus sûre.

Il peut également être appliqué à d’autres systèmes, tels que l’étude des rôles de la dégradation régulée des protéines dans divers processus cellulaires. Dans cette démonstration, NCOA hamana est utilisé. La plante est facile à cultiver, très sensible aux agrobactéries et possède de grandes feuilles qui sont facilement inoculées.

Cultivez une plante pendant quatre à six semaines dans un pot avec promix B dans des conditions environnementales contrôlées de longues journées et de 40 à 65 % d’humidité relative. Fertilisez la plante de temps en temps avec des produits disponibles dans le commerce selon les instructions du fabricant. Une fois la plante cultivée, sélectionnez des feuilles d’une taille de 50 millimètres sur 70 millimètres ou plus.

Pour l’inoculation d’Agrobacterium, cultivez la souche Agrobacterium hébergeant la construction binaire, exprimant la protéine testée pendant la nuit à 28 degrés Celsius dans un milieu YEP complété par des antibiotiques appropriés après centrifugation des cellules, remettez en suspension à une densité optique à 600 nanomètres de 0,5 dans un tampon d’infiltration et incubez pendant deux heures à température ambiante. Infiltrer la culture dans le côté AAL d’une feuille à l’aide d’une seringue sans aiguille d’un millilitre. Après l’infiltration, cultivez la plante pendant 72 heures sous le même régime de lumière Avant la récolte, quatre heures avant la récolte, infiltrez les zones foliaires inoculées d’agrobacterium avec 10 inhibiteurs micromolaires ou mock.

Traitez la feuille avec les solvants respectifs, récoltez les zones inoculées de la feuille, généralement 200 à 400 milligrammes de poids frais, et broyez-les en une fine poudre d’azote liquide. Préparez ensuite l’extrait de protéines totales en plaçant le tissu broyé dans 500 microlitres de tampon de dégradation. Clarifiez l’extrait par deux centrifugations séquentielles à 12 000 fois la gravité pendant cinq minutes pour effectuer la réaction de dégradation des protéines.

Transférez des volumes égaux d’extraits, généralement 20 microlitres dans des tubes de micro-fuge et incubez-les à température ambiante pendant des périodes de temps croissantes. En règle générale, l’échantillonnage temporel ainsi que les points temporels de 5, 10, 15, 20 et 30 minutes sont utilisés. Arrêtez les réactions en faisant bouillir un tampon d’échantillon de gel SDS avant de les analyser par western blot.

Résoudre les échantillons de protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS en déterminant d’abord la concentration en protéines à l’aide de la méthode de Bradford et en chargeant 50 à 80 microgrammes de protéines totales par voie. Assurez-vous que tous les échantillons sont chargés de la même manière pour les contrôles de chargement. Comparez les intensités d’espèces protéiques ubiquitaires telles que les grandes chaînes de rubis putatives, qui migrent comme une bande majeure avec une mobilité électrophorétique relative d’environ 50 kilodaltons.

Après l’électrotransfert des protéines résolues dans une membrane de nitrocellulose selon les protocoles standard, bloquer la membrane avec du lait écrémé à 5 % dans du TBST pendant une heure à température ambiante. Ensuite, diluez l’anticorps anti-épitope primaire dans du lait écrémé à 1 % dans du TBST à la concentration recommandée par le fabricant. Incuber l’anticorps avec la membrane bloquée pendant une heure à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius en agitant doucement.

Rincez ensuite la membrane dans 20 millilitres de TBST pendant 15 minutes une fois, puis deux fois pendant cinq minutes à température ambiante avec une agitation douce. Ensuite, diluez l’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort dans du lait écrémé à 1 % dans du TBST, comme recommandé par le fabricant. Incuber l’anticorps secondaire avec la membrane pendant une heure à température ambiante avec une agitation douce après un autre rinçage en TBST, visualiser les protéines d’intérêt avec une expérience représentative de la peroxydase de raifort montrant la déstabilisation d’une protéine liée à la défense végétale.

Veep one par la protéine boîte VBFF via la voie SCF est démontrée chez N hamana. L’analyse sanguine de Western a démontré que les quantités de Veep one étaient réduites de manière significative lorsqu’elles étaient co-exprimées avec le VBF, mais restaient relativement stables en l’absence de co-expression du VBF. Le mécanisme de dégradation protéasomale de la déstabilisation de Veep one par le VBF a été déduit de son inhibition par l’inhibiteur du protéasome MG 1 32.

La quantification de ces résultats a montré une inhibition presque complète de V one par VBF, qui était pratiquement bloqué par MG 1 32. Les niveaux légèrement plus élevés de V one en présence de MG 1 32 s’expliquent très probablement par l’inhibition de l’activité homologue endogène du VBF. Après avoir lavé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier la dégradation des protéines par la voie initiale du protéasome.

Le même plan expérimental pourrait être utilisé pour n’importe quel autre organisme et peut être réalisé afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le rôle de la dégradation régulée des protéines dans divers processus cellulaires.