Name: Expression, Isolation et purification des solubles et insolubles biotinylés protéines pour la régénération des tissus nerveux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Découvrez l'expression et la purification de protéines biotinylées recombinantes pour l'ingénierie tissulaire nerveuse. Cette méthode utilise la chromatographie d'affinité pour isoler des protéines fonctionnelles à grande échelle.

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Les auteurs tiennent à remercier l&#39;université d&#39;Akron pour le financement en faveur de ce travail.

<ol><li>Itakura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli+of+a+chemically+synthesized+gene+for+the+hormone+somatostatin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin.</a> Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).</li>
<li>Goeddel, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli+of+chemically+synthesized+genes+for+human+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (1), 106-110 (1979).</li>
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<li>Sengupta, D., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-engineered+biomaterials%3A+highly+tunable+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein-engineered biomaterials: highly tunable tissue engineering scaffolds.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 16 (3), 285-293 (2010).</li>
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<li>McCormick, A. M., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+immobilization+of+biotinylated+fusion+proteins+NGF+and+Sema3A+utilizing+a+photo-cross-linkable+diazirine+compound+for+controlling+neurite+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific immobilization of biotinylated fusion proteins NGF and Sema3A utilizing a photo-cross-linkable diazirine compound for controlling neurite extension.</a> Bioconjug. Chem. 24 (9), 1515-1526 (2013).</li>
<li>Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+differences+between+genome+sequences+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22B+strains+REL606+and+BL21%28DE3%29+and+comparison+of+the+E.+coli+B+and+K-12%22%5BJournal%5D)">Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli.</a> B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12. 394 (4), 653-680 (2009).</li>
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<li>Balbas, P., Bolivar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+basics%3A+pBR322+and+protein+expression+systems+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Back to basics: pBR322 and protein expression systems in E. coli.</a> Methods Mol. Biol. 267, 77-90 (2004).</li>
<li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> J. Mol. Biol.. 189 (1), 113-130 (1986).</li>
<li>Dubendorff, J. W., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+basal+expression+in+an+inducible+T7+expression+system+by+blocking+the+target+T7+promoter+with+lac+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor.</a> J. Mol. Biol. 219 (1), 45-59 (1991).</li>
<li>Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+T7+RNA+polymerase+to+direct+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes.</a> Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).</li>
<li>Tucker, J., Grisshammer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+rat+neurotensin+receptor+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J.%22%5BJournal%5D)">Purification of a rat neurotensin receptor expressed in Escherichia coli.</a> Biochem. J.. 317, 891-899 (1996).</li>
<li>Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+peptide+libraries+to+map+the+substrate+specificity+of+a+peptide-modifying+enzyme%3A+a+13+residue+consensus+peptide+specifies+biotinylation+in+Escherichia+coli%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of peptide libraries to map the substrate specificity of a peptide-modifying enzyme: a 13 residue consensus peptide specifies biotinylation in Escherichia coli).</a> Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).</li>
<li>Anfinsen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+that+govern+the+folding+of+protein+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Principles that govern the folding of protein chains.</a> Science. 181 (4096), 223-230 (1973).</li>
<li>Villaverde, A., Carrio, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+in+recombinant+bacteria%3A+biological+role+of+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies.</a> Biotechnol. Lett. 25 (17), 1385-1395 (2003).</li>
<li>Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+neural+stem+cells+in+three-dimensional+growth+factor-immobilized+chitosan+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 32 (1), 57-64 (2011).</li>
<li>Tam, R. Y., Cooke, M. J., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+covalently+modified+hydrogel+blend+of+hyaluronan-methyl+cellulose+with+peptides+and+growth+factors+influences+neural+stem%2Fprogenitor+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">A covalently modified hydrogel blend of hyaluronan-methyl cellulose with peptides and growth factors influences neural stem/progenitor cell fate.</a> J. Mater. Chem. 22, 19402-19411 (2012).</li>
<li>Li, H., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Differentiation+of+Neural+Stem+Cells+in+Macroporous+Photopolymerizable+Hydrogel+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">3D Differentiation of Neural Stem Cells in Macroporous Photopolymerizable Hydrogel Scaffolds.</a> PLoS One. 7 (11), (2012).</li>
<li>McCormick, A. M., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regenerative+strategies+incorporating+biomolecular+axon+guidance+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Neural regenerative strategies incorporating biomolecular axon guidance signals.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 578-597 (2012).</li>
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<li>Marek, P., Senecal, K., Nida, D., Magnone, J., Senecal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+biotin+functionalized+QD+assay+for+determining+available+binding+sites+on+electrospun+nanofiber+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Application of a biotin functionalized QD assay for determining available binding sites on electrospun nanofiber membrane.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 48 (2011).</li>
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<li>de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-based+procedure+to+increase+yields+of+soluble+recombinant+proteins+produced+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli.</a> BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).</li>
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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Recombinant ingénierie des protéines est une technique très puissante qui s&#39;étend sur plusieurs disciplines. Il est rentable, accordable et une procédure relativement simple, ce qui permet la production de rendements élevés de protéines sur mesure. Il est important de noter que la conception et l&#39;expression de protéines cibles n&#39;est pas toujours évident. Expression basale et la stabilité de la protéine recombinante dépendent des choix spécifiques de vecteur, E. coli souches cellulaires, peptide tag ...

Protéines couvrent une large gamme de biomolécules qui sont responsables de nombreuses fonctions biologiques, conduisant finalement à la formation de tissu propre et de l&#39;organisation. Ces molécules lancer des milliers de voies qui contrôlent la régulation et / ou la régulation de gènes et d&#39;autres protéines de signalisation, maintien de l&#39;équilibre dans le corps humain. Perturbation d&#39;une seule protéine affecte l&#39;ensemble de ce réseau de signaux, ce qui peut conduire à l&#39;apparition de troubles ou de maladies dévastatrices. Ingénierie des protéines individuelles dans le laboratoire propose une solution pour lutter contre ces effets indésirables et offre une alternative aux médicaments à petites molécules. En 1977, un gène codant pour la séquence de la somatostatine 14 d&#39;acides aminés a été l&#39;un des premiers polypeptides modifiés créés à l&#39;aide de E. coli 1. Peu de temps après, en 1979, l&#39;insuline a été cloné dans le plasmide pBR322, transformé, a exprimé, et purifié 2. Depuis lors, des protéines recombinantes ont étendu leur influence à de multiples domaines de resecherche tels que les biomatériaux, l&#39;administration de médicaments, l&#39;ingénierie tissulaire, les produits biopharmaceutiques, de l&#39;agriculture, des enzymes industrielles, les biocarburants, etc (pour avis voir les références 3-8). Ceci est largement dû à la souplesse que la technique propose via l&#39;addition de l&#39;application des fragments chimiques spécifiques ou des séquences de protéines à des fins, y compris, mais sans s&#39;y limiter, l&#39;identification de la protéine cible, de stabilisation et de purification. Via la technologie de l&#39;ADN recombinant, des protéines recombinantes peuvent être exprimées dans une variété de systèmes hôtes eucaryotes et procaryotes, notamment de mammifères, de plantes, d&#39;insectes, de levures, de champignons ou de bactéries. Chaque hôte offre des avantages différents et généralement le meilleur système est déterminée sur la base de la fonction des protéines, le rendement, la stabilité, le coût global, et l&#39;évolutivité. Des cellules de bactéries manquent souvent des mécanismes de modifications post-traductionnelles qui fournissent des hôtes eucaryotes (par exemple glycosylation, le disulfure de pontage, e<html> tc.) 5. En conséquence, les systèmes de mammifères et d&#39;insectes aboutissent généralement à une meilleure compatibilité et l&#39;expression de protéines eucaryotes, mais ces hôtes sont généralement plus coûteux et prend du temps 9. Par conséquent, E. coli est l&#39;hôte privilégié pour notre système d&#39;expression parce que les cellules se développent rapidement dans des conditions de croissance peu coûteux et les mécanismes d&#39;expression génétique sont bien comprises de 5,9. En outre, ce système est facile à l&#39;échelle supérieure à des fins de production et les résultats dans les protéines fonctionnelles en dépit de l&#39;absence de modifications post-traductionnelles 10. Le E. souche de E. coli K12 est choisi dans ce protocole pour le clonage, car cette souche offre d&#39;excellents rendements en plasmide basé sur l&#39;efficacité de transformation élevées. En outre, un E. souche de E. coli BL21 est utilisé pour l&#39;expression, car cette souche hôte contient le gène d&#39;ARN polymerase de T7, qui fournit l&#39;expression des protéines et la stabilité contrôlée 11. tente &quot;&gt; Après la sélection de l&#39;hôte, en outre il faut prendre soin dans le choix du vecteur d&#39;expression idéal pour faciliter l&#39;expression de la protéine choisie et contrôlée. synthèse de protéines recombinantes commence par une séquence d&#39;ADN cible qui est clonée sous la direction du bactériophage transcription de T7 et de signaux de traduction, et l&#39;expression est induite dans des cellules hôtes contenant des copies chromosomiques du gène de l&#39;ARN polymerase T7 12. Ces vecteurs, dérivés de pBR322 du vecteur plasmidique (pour une revue, voir la référence 13), sont étroitement contrôlée par le promoteur T7 initialement développée par Studier et al 14 et de fournir plus d&#39; contrôle grâce à l&#39;inclusion de l&#39;opérateur lac et le répresseur lac (LAC1) 15,16. Pour l&#39;ingénierie des protéines recombinantes, ce système d&#39;expression offre la possibilité d&#39;adapter une séquence d&#39;acides aminés spécifique d&#39;une protéine souhaitée par l&#39;insertion des séquences d&#39;ADN cibles ou pour créer des protéines de fusion composée de domaine combinéss de protéines simples. En outre, certaines séries de vecteurs comprennent des modifications de points de peptides à être mis sur le N ou C-terminale. Pour nos besoins de conception, une histidine (His) tag a été ajouté à la séquence cible d&#39;ADN pour une purification et une séquence biotinylatable 15 d&#39;acides aminés a été inclus pour la biotinylation 17,18. Dans ce protocole, un plasmide contenant un gène de résistance à l&#39;ampicilline, a été choisi pour réaliser nos séquences de protéine de fusion biotinylatable. L&#39;expression est contrôlée dans ce vecteur par l&#39;intermédiaire du promoteur lac de T7 et est facilement induite par isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). expressions de test (cultures à petite échelle) sont utilisés pour déterminer la présence et la solubilité de la protéine cible, qui peut être exprimée soit sous forme soluble ou insoluble à formuler des procédures de purification. Une protéine soluble exprimé dans la cellule de bactérie subira pliage spontané de maintenir sa structure native 19. Typiquement, le natifla structure est thermodynamiquement favorable. Dans de nombreux cas, l&#39;activité métabolique de l&#39;hôte n&#39;est pas propice à la protéine cible, en mettant l&#39;accent sur le système qui conduit à la production de la protéine insoluble et la formation de corps d&#39;inclusion constitués d&#39;agrégats de protéines insolubles. Ainsi, la protéine cible dénature, ce qui les rend généralement biologiquement inactif 20. Les deux expressions de test sont mis à l&#39;échelle en place, les procédures d&#39;isolement et sont déterminées par la solubilité de la protéine cible. Une renaturation ou étape de repliement supplémentaire est nécessaire pour les protéines insolubles. Les protéines recombinantes résultantes peuvent en outre être purifiés en utilisant une Chromatographie d&#39;exclusion de taille. Dans la maison de production de protéines recombinantes offre des avantages de coûts par rapport aux produits commerciaux depuis milligrammes de protéine cible peut être isolé par litre de culture principale. La plupart de l&#39;équipement nécessaire est disponible dans un laboratoire biologique ou chimique typique. L&#39;ingénierie des protéines permet la créationde protéines de fusion personnalisé avec des fonctionnalités supplémentaires qui ne sont pas toujours disponibles dans le commerce. Figure 1 illustre les principales procédures liées à des protéines recombinantes de l&#39;ingénierie. Avec ce système d&#39;expression, nous avons créé de nombreuses protéines biotinylatable, telles que l&#39;interféron-gamma, le facteur de croissance dérivé des plaquettes, et d&#39;os protéine morphogénétique 21-23, mais nous allons nous concentrer sur deux protéines que nous avons conçu pour le guidage axonal, NGF (29 kDa ) et Sema3A (91 kDa) 10 (pour revue voir référence 24). La biotinylation est une technique courante pour l&#39;identification, l&#39;immobilisation et l&#39;isolement des protéines marquées en utilisant la biotine-streptavidine bien connu interaction 25-27. Sondes biophysiques 28,29, biocapteurs 30, et 31 points quantiques sont des exemples de systèmes qui utilisent la haute affinité de la conjugaison de biotine-streptavidine avec un Kd de l&#39;ordre de 10 -15 M 27. Le E. bio coliétain ligase, BirA, aide à la fixation covalente de la biotine à la chaîne latérale de la lysine trouvé à l&#39;intérieur de la séquence étiquetée biotine 18,32. Tethering biotine à des matériaux et des biomolécules a produit une distribution soutenue des facteurs de croissance à la cellule pour de multiples applications de génie tissulaire 21,33-35. Par conséquent, l&#39;ingénierie des protéines biotinylatable conçu sur mesure est un outil puissant qui peut transcender les intérêts de recherche multiples.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithio-DL-thréitol, DTT, 99,5 %</td><td>Chem-Impex International</td><td>127</td><td>100 g</td></tr><tr><td>2-Hydroxyéthylmercaptan &bêta ;-Mercaptoéthanol</td><td>Chem-Impex International</td><td>642</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Acide acétique, glacial</td><td>EMD</td><td>AX0073-9</td><td>2,5 L</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bioshop</td><td>AGR001.500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Sel de sodium d’ampicilline&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Antimousse 204</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6426</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Barstar-NGF pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 et micro ; g</td></tr><tr><td>BL21(DE3) Cellules Compétentes</td><td>Novagen</td><td>69450</td><td>1 ml ; Expression Host</td></tr><tr><td>Bradford réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>BugBuster</td><td>Novagen</td><td>70922-3</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Gel filtrant standard</td><td>Bio-Rad</td><td>151-1901</td><td>6 flacons</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Hydrodiure de guanidine chlorhydrate d’amioformamidine</td><td>Chem-Impex International</td><td>152</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>His-Pur Ni-NTA Résine</td><td>Thermo Scientific</td><td>88222</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>EMD</td><td>HX0603-3</td><td>2,5 L</td></tr><tr><td>Imidazole&nbsp ;</td><td>Chem-Impex International</td><td>418</td><td>250 g</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Chem-Impex International</td><td>194</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Tampon d’échantillon Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>30 ml</td></tr> de <tr><td>sel de sodium de laurylsulfate, dodécyle de sodium de surface</td><td>Chem-Impex International</td><td>270</td><td>500 g</td></tr><tr><td>LB Broth&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>NovaBlue Cellules Compétentes</td><td>Novagen</td><td>69825</td><td>1 ml ; Clonage de l’hôte</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td>10 paquet</td></tr> de <tr><td>chlorure de potassium</td><td>Chem-Impex International</td><td>01247</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sema3A-pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 et micro ; g</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Fisher</td><td>Scientific S318-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium diabasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Terrific Broth</td><td>Bioshop</td><td>TER409.5</td><td>5 kg</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de tétracycline</td><td>Chem-Impex International</td><td>667</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Tampon Tris/Glycine/SDS, 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Tryptone, EMD pancréatique</td><td></td><td>1.07213.1000</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Extrait de levure, granulé</td><td>EMD</td><td>1.03753.0500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>&nbsp ; &Auml ; KTApurifier10</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td>Comprend des kits et des accessoires</td></tr><tr><td>Agitateur orbital de paillasse</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE4000</td><td>MAXQ 4000</td></tr><tr><td>BirA500</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>Enzyme est livré avec des tampons de réaction et une solution</td></tr> de <tr><td>biotine Dialyse Casette</td><td>Thermo Scientific</td><td>66380</td><td>Slide-A-Lyzer (Extra Strength)</td></tr><tr><td>Tube de</td> <td>dialyseSpectrum Laboratories</td><td>132127, 132129</td> MWCO : Vanne de dérivation de débit <td>de 25 000 et 50 000</td></tr><tr><td>FV-923</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0011-70</td><td></td></tr><tr><td>FluoReporter Kit de dosage de quantification de la biotine</td><td>Invitrogen</td><td>1094598</td><td></td></tr><tr><td>Frac-950 Supports de tubes, Rack C</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-13</td><td></td></tr><tr><td>Collecteur de fractions Frac-950</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-00</td><td>Comprend des kits et des accessoires</td></tr><tr><td>Circulateur chauffant/réfrigéré&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>13271-102</td><td>Modèle 1156D</td></tr><tr><td>Four de chauffage Série FD</td><td>Binder</td><td></td><td>Modèle FD 115</td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1069-01</td><td>Discontinué--Produit de remplacement : HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td></tr><tr><td>J-26 XPI Avanti Centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>393126</td><td></td></tr><tr><td>JA 25.50 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>363055</td><td></td></tr><tr><td>JLA 8.1 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>969329</td><td>Comprend 1 L bouteilles en polyporpylène</td></tr><tr><td>JS 5.3 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Hotte à flux laminaire</td><td>Themo Scientific</td><td>1849</td><td>Forma 1800 Series Clean Bench</td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>TECAN</td><td></td><td>infinite M200</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8004</td><td>4 gels vertical système d’électrophorèse</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Gels préfabriqués</td><td>Bio-Rad</td><td>456-9036</td><td>N’importe quel kDa, peigne 15 puits</td></tr><tr><td>Colonne Ni-NTA</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2512</td><td>49 ml&nbsp ; volume ECONO-Column</td></tr><tr><td>Plasmid Miniprep</td><td>Kit Omega Bio-Tek</td><td>D6943-01</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC Alimentation</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5052</td><td>250 V, 3 A, 300 W</td></tr><tr><td>Tubes en polypolymère de polypropylène à fond rond</td><td>VWR</td><td>3119-0050</td><td>50 ml&nbsp ; tubes pour rotor JA 25.50</td></tr><tr><td>Spin-X UF Concentrators</td><td>Corning</td><td>431488, 431483</td><td>&nbsp ; 20 et 6 ml ; MWCO : 10 000 Da</td></tr><tr><td>Service de sous-clonage</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Processeur à ultrasons Protein Services&nbsp ;</td><td>Cole-Parmer</td><td>18910445A</td><td>Modèle CV18</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Modèle G560</td></tr></tbody></table>

expression, isolation et purification des solubles et insolubles biotinylés protéines pour la régénération des tissus nerveux

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Recombinant ingénierie des protéines a utilisé Escherichia coli (E. coli) systèmes d&#39;expression pour près de 4 décennies, et aujourd&#39;hui E. coli est toujours l&#39;organisme d&#39;accueil le plus largement utilisé. La flexibilité du système permet l&#39;ajout de groupements tels que une étiquette de biotine (pour les interactions de streptavidine) et des protéines fonctionnelles plus grands comme protéine fluorescente verte ou cerise protéine rouge. De plus, l&#39;intégration des acides aminés non naturels tels que des chélateurs d&#39;ions métalliques, les groupes fonctionnels réactifs de manière unique, des sondes spectroscopiques, et des molécules conférant des modifications post-traductionnelles a permis une meilleure manipulation des propriétés de protéines et de fonctionnalités. En conséquence, cette technique crée des protéines de fusion personnalisables qui offrent une grande utilité pour les différents domaines de recherche. Plus spécifiquement, la séquence de la protéine biotinylatable a été incorporé dans de nombreuses protéines cibles en raison de l&#39;interaction de haute affinité entre la biotine avec l&#39;avidine et la streptavidine. Cet ajout a aidé à améliorer la détection et la purification de protéines marquées ainsi que l&#39;ouverture de la voie à des applications secondaires telles que le tri de cellules. Ainsi, les molécules de biotine montrent une influence croissante et généralisée dans les domaines bio-industrielles et biomédicales. Aux fins de notre recherche, nous avons conçu des protéines de fusion recombinantes biotinylé contenant le facteur de croissance des nerfs (NGF) et semaphorin3A (Sema3A) régions fonctionnelles. Nous avons indiqué précédemment comment ces protéines de fusion biotinylée, avec d&#39;autres séquences de protéines actives, peuvent être attachés à des biomatériaux pour l&#39;ingénierie des tissus et à des fins de régénération. Ce protocole définit les principes de base de protéines de biotinylatable d&#39;ingénierie à l&#39;échelle du milligramme, en utilisant un lac vecteur inductible T7 et E. hôtes d&#39;expression coli, à partir de la transformation à l&#39;échelle et la purification.

<html> Clonage et expression de test Lorsque le placage est effectué correctement, simples colonies isolées devraient former pour augmenter les chances de plumer clonale transformées cellules bactériennes (figure 2A). Cependant, si trop de cellules sont étalées, les plaques sont incubées trop longtemps à 37 ° C ou transformation est discutable, les colonies peuvent couvrir la plaque de gélose ou former de plus grands agrégats de cellules (figures 2B</...

Développer des protéines de fusion biotinylatable a de nombreuses applications potentielles dans différents domaines de recherche. Recombinant ingénierie des protéines est une procédure avant droite qui est rentable, offrant des rendements élevés de protéines sur mesure.

Expression, Isolation et purification des solubles et insolubles biotinylés protéines pour la régénération des tissus nerveux

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

L'objectif général de cette procédure est de concevoir, exprimer et isoler avec succès des protéines recombinantes biotinylées pouvant être intégrées dans diverses applications telles que des sondes, des capteurs, la délivrance de médicaments et le génie tissulaire. Cela est réalisé en transformant d'abord le plasmide conçu sur mesure dans une lignée cellulaire bactérienne à l'aide de cultures à petite échelle, puis en induisant l'expression de la protéine cible. Ensuite, la présence et la solubilité de la protéine cible sont déterminées afin d'élaborer des procédures de purification appropriées.Ensuite, le protocole est transposé à une échelle plus grande afin d'obtenir des rendements plus élevés de la protéine cible, qui sont ensuite isolés par des techniques de chromatographie d'affinité. Enfin, les protéines sont purifiées, puis concentrées pour des applications et analyses ultérieures. En définitive, les résultats de la PAGE-SDS et de la FPLC confirment que les protéines recombinantes ont été correctement isolées et purifiées, et les protéines font l'objet d'analyses supplémentaires pour évaluer leur fonctionnalité.Le principal avantage de l'ingénierie des protéines recombinan

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Cette vidéo montre l’isolement de protéines de surface cellulaire et intracellulaires à partir d’une culture d’astrocytes. La culture d’astrocytes est placée sur de la glace pour inhiber l’endocytose, puis les protéines de surface cellulaire sont marquées avec un réactif de biotinylation. Les cellules sont lysées pour libérer les protéines biotinylées de surface cellulaire et les protéines intracellulaires non biotinylées. Enfin, des billes enrobées de streptavidine sont utilisées pour séparer...

Isolement de protéines de surface cellulaire et intracellulaires à partir d’une culture d’astrocytes

Trafic membranaire neuronal contrôle dynamiquement la membrane plasmique disponibilité des protéines et un impact significatif sur la neurotransmission. À ce jour, il a été difficile de mesurer le trafic endocytose neuronale dans les neurones adultes. Ici, nous décrivons une méthode très efficace, quantitative pour mesurer les changements rapides dans l'expression des protéines de surface ex vivo dans des tranches de cerveau de courte durée.

Tranche de cerveau Biotinylation: Une<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approche de Mesure région spécifique membrane de protéines plasmatiques traite des adultes neurones

Le transport axonal de BDNF, un facteur neurotrophique, est essentiel pour la survie et la fonction de plusieurs populations neuronales. Certaines maladies dégénératives sont marqués par la rupture de la structure et de la fonction axonale. Nous avons démontré les techniques utilisées pour examiner le trafic en direct de QD-BDNF dans des chambres microfluidiques utilisant neurones primaires.

Imagerie en temps réel des axonale Transport de Quantum Dot marqué BDNF dans les neurones primaires

Ce protocole présente un procédé pour la récupération morphologique des neurones corrigés lors des enregistrements électrophysiologiques en utilisant le remplissage de la biocytine et de post-traitement immunohistochimique ultérieure. Nous montrons que les sections de biocytin rempli d'épaisseur qui ont été colorées et sous une lamelle peuvent être recolorées avec un deuxième jours ou des mois d'anticorps primaires plus tard.

Immunocoloration des articles biocytine remplis et transformés pour neurochimiques Marqueurs

Une méthodologie à base de gradient de centrifugation modifiée a été utilisée pour isoler les cellules épithéliales du tissu intestinal de Rhipicephalus microplus . Les protéines liées à la surface ont été biotinylées et purifiées par des billes magnétiques de streptavidine pour une utilisation dans les applications en aval.

Purification des protéines de surface cellulaire biotinylées de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Cellules intestinales épithéliales

Deux méthodes basées sur la biotinylation, conçues pour déterminer l'expression de la surface cellulaire et la vitesse endocytaire des protéines exprimées à la membrane plasmatique, sont présentées dans ce rapport.

Détermination de l&#39;expression de la surface cellulaire et du taux endocytique des protéines dans les cultures d&#39;astritcy primaires utilisant la biotinylation

Nous présentons ici un protocole pour l’étiquetage des murins in vivo des protéines de surface de cellules glomérulaire avec de la biotine. Ce protocole contient des informations sur la façon de perfuse les reins de souris, isoler les glomérules et effectuer d’immunoprécipitation endogène de la protéine d’intérêt.

Isolement des glomérules et In Vivo , marquage des protéines de Surface de cellules glomérulaire

Présenté ici est un protocole qui combine un système de co-culture neural-endothelial in vitro et l'incorporation métabolique du sialoglycan avec des groupes fonctionnels bioorthogonals pour étendre les cellules neurales primaires de tige et d'ancêtre et étiqueter leur surface sialoglycoproteins pour l'imagerie ou l'analyse de la spectrométrie de masse des marqueurs de surface cellulaire.

Identification des marqueurs de surface cellulaire des cellules neurales primaires de tige et de progéniture par l'étiquetage métabolique du sialoglycan

Présentés ici sont des protocoles pour les essais biochimiques in vitro utilisant des étiquettes de biotine qui peuvent être largement applicables pour étudier les interactions protéines-acides nucléiques.

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions In Vitro Biochemical As

Le BDNF recombinant contenant une séquence Avi (BDNFAvi) est produit dans les cellules HEK293 d’une manière rentable et est purifié par la chromatographie d’affinité. BDNFavi est alors directement mono-biotinylé avec l’enzyme BirA dans un tube. BDNFavi et BDNFavi mono-biotinylés conservent leur activité biologique par rapport au BDNF disponible dans le commerce.

Un protocole amélioré pour purifier et directement mono-biotinylate recombinant BDNF dans un tube pour les études de trafic cellulaire dans les neurones

Le protocole présente une méthode de fixation covalente in vivo de la biotine à des protéines basée sur leur proximité avec une biotine ligase fusionnée à une protéine d’intérêt. Cette modification permet un enrichissement sélectif des protéines à l’aide de billes de streptavidine selon les besoins des études d’interaction protéique.

In vivo Biotinylation de proximité pour les études d’interaction protéique chez Paramecium tetraurelia

Découvrez l'expression et la purification de protéines biotinylées recombinantes pour l'ingénierie tissulaire nerveuse. Cette méthode utilise la chromatographie d'affinité pour isoler des protéines fonctionnelles à grande échelle.

Expression, Isolation et purification des solubles et insolubles biotinylés protéines pour la régénération des tissus nerveux

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