Expression, Isolation et purification des solubles et insolubles biotinylés protéines pour la régénération des tissus nerveux

L’objectif global de cette procédure est de concevoir, d’exprimer et d’isoler avec succès des protéines biotinylées recombinantes qui peuvent être incorporées dans une variété d’applications telles que les sondes, les capteurs, l’administration de médicaments et l’ingénierie tissulaire. Pour ce faire, il suffit d’abord de transformer le plasmide conçu sur mesure en une lignée cellulaire hôte bactérienne à l’aide de cultures à petite échelle, puis d’induire l’expression de la protéine cible. Ensuite, la présence et la solubilité de la protéine cible sont déterminées afin de formuler des procédures de purification appropriées.

Ensuite, la procédure est mise à l’échelle pour produire de plus grands rendements de la protéine cible, qui sont ensuite isolés à l’aide de techniques de chromatographie d’affinité. Enfin, les protéines sont purifiées puis concentrées pour des applications et des analyses en aval. En fin de compte, les résultats de la page SDS et du FPLC confirment que les protéines recombinantes ont été isolées et purifiées avec succès, et que la fonctionnalité des protéines est testée plus avant.

Le principal avantage de l’ingénierie des protéines recombinantes est qu’elle nous permet de créer des quantités à grande échelle ou à l’échelle du milligramme de protéines conçues sur mesure pour répondre à nos spécifications scientifiques exactes. Par exemple, nous pouvons ajouter de nouvelles fonctionnalités à des parties de ces protéines pour activer de nouvelles propriétés. Nous allons vous montrer aujourd’hui comment vous pouvez biotine les extrémités de protéines spécifiques, et nous l’utilisons pour immobiliser ou attacher spécifiquement ces protéines à des surfaces afin de guider des fonctions cellulaires telles que l’excroissance neuronale ou la différenciation neuronale.

Les personnes novices dans cette technique ne devraient pas avoir beaucoup de difficulté à suivre les procédures d’isolement des protéines natives ou non natives. De nombreuses étapes sont identiques, mais nécessitent une mémoire tampon spécifique formulée pour des conditions natives ou non natives. Une attention particulière aux détails dès le début.

Les étapes de transformation et d’expression des tests garantiront un rendement élevé en protéines au cours du processus final de mise à l’échelle. La démonstration visuelle de cette méthode est importante car elle montre comment des protéines recombinantes peuvent être fabriquées à l’aide d’équipements et de fournitures de laboratoire simples. En utilisant la simple réaction de lot, e equalize et les milieux de croissance sont cultivés à l’échelle leader, produisant 10 milligrammes de protéines par culture principale.

De plus, des techniques de chromatographie peuvent être utilisées et démontrées pour montrer comment les protéines sont purifiées davantage pour une application en aval Aujourd’hui, Alicia, diplômée du Cinema Lab, fera la démonstration de la procédure Après le clonage et les tests d’expression à la protéine cible d’intérêt, et la culture d’une culture de 20 millilitres pendant la nuit. Selon le protocole de texte, versez la culture de nuit dans 1,8 litre de milieu de croissance stérile avec de l’ampicilline et utilisez une pipette à pâte pour ajouter six à huit gouttes d’anti-mousse stérile 2 0 4 placez les cultures dans un bain-marie à 37 degrés Celsius à travers un filtre de 0,2 micron, faites buller de l’air comprimé dans les cultures à travers des pierres d’aération. Lorsque la culture atteint une DO 600 de 0,7 à 0,8 à un millimolaire IPTG et l’induit pendant quatre heures à 37 degrés Celsius ou toute la nuit à 18 degrés Celsius, selon que la protéine a été trouvée dans la fraction soluble ou insoluble de l’expression d’essai.

Des expériences visant à collecter les cellules, à transférer la culture dans des bouteilles à centrifuger d’un litre et à la faire tourner pendant 15 minutes à 14 000 fois la gravité et quatre degrés Celsius. Versez le super natin et, à l’aide d’une spatule fine, versez la pastille bactérienne dans deux tubes de 50 millilitres. Granulez à nouveau les cellules par centrifugation pendant quelques minutes avant de stocker les granulés à moins 80 degrés Celsius.

Pour effectuer des protéines non natives. Isolement d’une protéine insoluble dans chaque pastille d’e coli congelée. Ajoutez 20 millilitres de lyse, de tampon de lavage et de vortex et secouez pour remettre en suspension afin d’éliminer les gros morceaux.

Après avoir été incubée sur un mutateur pendant la nuit, la solution ressemblera à une centrifugeuse à boue visqueuse. La boue à 20, 500 fois la gravité et la température ambiante pendant 30 minutes. Transférez le surnageant dans un tube frais et jetez la pastille pour isoler les protéines natives.

Resus suspend les granulés dans un tampon de lyse à un volume final de 30 millilitres avec les granulés remis en suspension sur de la glace. Réglez le sonicate à une amplitude de 30 % avec une impulsion de 30 secondes sur 30 secondes d’arrêt, et sonicate pendant cinq minutes. Secouez le tube de haut en bas pendant la sonication pour briser complètement la pastille cellulaire.

Centrifugez la boue à 20, 500 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Transférez ensuite le surnageant dans un tube frais et jetez la pastille. Pour effectuer une chromatographie d’affinité sur une protéine isolée non native, ajoutez un millilitre de solution de résine de nickel NTA dans chaque tube de centrifugation et incubez sur un mutateur ou un agitateur à température ambiante pendant au moins une heure.

Versez le lisier dans une colonne d’affinité et laissez la solution s’égoutter complètement par la vanne du robinet d’arrêt dans un bécher à déchets. Ajoutez 10 millilitres de tampon de lavage dans le tube de centrifugation pour éliminer la résine résiduelle et ajoutez la solution à la colonne après que la solution ait coulé à travers. Utilisez une tige d’agitation en verre pour remuer la résine et laissez-la finir de s’égoutter avant d’ajouter un autre lavage.

Ensuite, utilisez 10 millilitres de tampon de lavage pour répéter le rinçage du tube de centrifugation et le transférer sur la colonne. Effectuez ensuite huit autres lavages de la colonne avec 10 millilitres de tampon de lavage de lyse pour chaque lavage. Une fois les lavages terminés, fermez le robinet d’arrêt et remplacez le bécher à déchets par le tube à centrifuger de 50 millilitres.

Ajoutez 15 millilitres de tampon elucian dans la colonne, remuez la résine et laissez la solution reposer pendant cinq minutes. Ouvrez ensuite le robinet d’arrêt et récupérez l’EIT avant de répéter avec 15 millilitres supplémentaires de tampon d’élution pour purifier une protéine native. Après avoir ajouté la résine de nickel NTA à la solution protéique, incubée sur un mutateur à quatre degrés Celsius pendant au moins une heure.

Après avoir utilisé un tampon de lavage pour laver la colonne 10 fois, ajoutez cinq millilitres de tampon d’élution et incubez la résine pendant cinq minutes avant d’utiliser un tube frais pour recueillir la majeure partie de l’EIT pendant que l’EIT s’égoutte de la colonne, ajoutez 90 microlitres par puits de réactif Bradford dans une plaque transparente de 96 puits. Après chaque cinq millilitres d’elucian avec tampon, laissez 10 microlitres de solution s’égoutter de la colonne dans un puits contenant 90 microlitres de réactif Bradford. Continuez avec l’EEU jusqu’à ce qu’il ne soit plus détecté de protéine pour dialyser et/ou Rena.

Les protéines transfèrent chaque EIT dans la tubulure de dialyse et dialysent contre le tampon approprié, une pendant quatre heures à quatre degrés Celsius avant de la remplacer par le tampon correspondant. Deux nuits à quatre degrés Celsius. Utilisez des concentrateurs de spin pour concentrer les protéines dialysées à moins de cinq millilitres et purifiez-les davantage à l’aide de la chromatographie d’exclusion stérique si vous le souhaitez au bout huit.

Selon le protocole textuel, lors de l’expression du test, le NGF et le SE trois A ont d’abord été induits pendant quatre heures à 37 degrés Celsius et l’analyse de la page SDS a déterminé que les deux protéines étaient situées dans cette fraction soluble. L’expression des protéines semblait correcte et, par conséquent, une autre expression test avec une induction nocturne à 18 degrés Celsius a été examinée. L’expression du NGF s’est améliorée dans la fraction soluble, alors qu’il n’y avait pas de différence notable avec SEMA trois.

Un NGF a été isolé dans des conditions indigènes et non indigènes et passé dans la colonne FPLC pour la purification. Bien que le NGF ait été présent dans la fraction soluble lors de l’expression de l’essai, l’isolement natif a produit un faible rendement à 37 degrés Celsius et à 18 degrés Celsius. Cependant, un rendement plus élevé de NGF a été obtenu grâce à l’isolement non indigène avec renaturation.

Par conséquent, le NGF a été isolé dans des conditions non indigènes. Après une induction nocturne à 18 degrés Celsius, l’isolement non indigène n’a pas entraîné de production de SEMA trois a avec 8,61 plus ou moins 3,1 milligrammes par culture principale de deux litres pour l’isolement natif. Par conséquent, SEMA three A a été induit pendant quatre heures à 37 degrés Celsius et isolé à l’aide de paramètres d’isolement natifs.

Les pics FPLC ont été collectés et les échantillons NGF et SEMA trois A ont été analysés avec la page FDS. Des pics de protéines supplémentaires trouvés dans la sortie FPLC pour SEMA 3 A ont été collectés et analysés avec la page FDS et n’ont pas été localisés dans la région de poids moléculaire 3 a de SEMA. Ces fractions sont très probablement des produits de dégradation parce qu’elles ne se sont pas comportées de manière fonctionnelle dans les essais cellulaires, comme l’ont fait les trois SEMA.

Un pic indiqué ici. Une fois établie et maîtrisée la protéine recombinante, l’isolement et la purification ne devraient prendre que quelques jours s’ils sont effectués correctement. Cependant, les étapes initiales de transformation bactérienne et d’expression du test prennent plus de temps afin d’identifier correctement la solubilité de la protéine.

Une fois la solubilité déterminée, une bibliothèque de bactéries transformées peut être stockée dans le moins 80. De plus, après l’expression de la protéine, les granulés d’e coli peuvent être stockés dans le moins 80 jusqu’à ce qu’ils soient isolés et expérimentés. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de vous assurer que les tampons sont stérilisés et fraisés afin d’éviter que les protéases ne dénaturent et ne décomposent vos protéines.

Les tampons d’isolement doivent être fabriqués et stérilisés toutes les quatre à six semaines, et les tampons de dialyse doivent être fabriqués la veille de l’isolement. Les colonnes N-I-N-T-A et FPLC doivent être propres conformément aux protocoles du fabricant afin d’éviter la contamination croisée par plusieurs protéines biotinylées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exprimer, d’isoler et de purifier des protéines biotinylées conçues sur mesure à l’aide d’un système d’expression d’hôte bactérien.

C’est similaire à ce qui se fait à la fois scientifiquement et commercialement à petite et grande échelle. Ainsi, cela a une large application.