Bioénergétique et les oxydatif: Protocoles pour l'isolement et l'évaluation des leucocytes humains et plaquettes

Dans le protocole suivant, la mesure des profils bioénergétiques et des réponses oxydatives des monocytes, des lymphocytes, des neutrophiles et des plaquettes du sang humain sera démontrée. Ceci est réalisé en recueillant d’abord les fractions de plasma riches en couches leucocytaires et en plaquettes à partir de sang fraîchement prélevé. Dans un deuxième temps, la population hétérogène de globules blancs est séparée en couches de cellules mononucléaires et polymorphonucléaires par gradient de densité.

Ensuite, les populations de neutrophiles et de lymphocytes monocytaires purs sont isolées par séparation maximale, puis plaquées pour une analyse de flux extracellulaire ou XF. En fin de compte, la mesure sensible et reproductible de la fonction mitochondriale dans les monocytes, les lymphocytes et les plaquettes, ainsi que l’explosion oxydative des taux de consommation d’oxygène des monocytes et des neutrophiles, peuvent être mesurées par la technologie XF. L’avantage de la technique que nous allons vous montrer aujourd’hui est que vous pouvez préparer à partir d’un petit échantillon de sang toutes les cellules principales qui se trouvent dans le sang du patient.

Il s’agit des plaquettes et des leucocytes sous une forme pure inactivée et mesurent leur fonction mitochondriale. Ceci, pensons-nous, peut alors refléter diverses maladies et états chez le patient en temps réel. Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés concernant le métabolisme, telles que le rôle du mode de vie, de l’alimentation et du stress pathologique sur la fonction mitochondriale.

Ce protocole combine plusieurs technologies pour l’isolement et la détermination de la bioénergétique cellulaire dans diverses populations de leucocytes et dans les plaquettes. Cette étape du protocole est très critique car le gradient de densité et la séparation magnétique nécessitent un pipetage précis. De plus, vous devez savoir où se trouvent les populations cellulaires pendant le fractionnement.

Nous démontrerons l’isolement des cellules sanguines périphériques et l’analyse de la bioénergétique cellulaire sur l’analyseur de flux extracellulaire à 24 puits ou le XF 24. Cependant, cette méthode peut également être effectuée sur le XF 96, au moins deux heures avant le début de l’intervention. Hydratez les sondes à cartouche du capteur XF avec la solution XF cran.

Ensuite, faites tourner le sang total fraîchement prélevé pendant 15 minutes à 500 fois G et à température ambiante dans une centrifugeuse avec un rotor à godets oscillant. Utilisez une pipette de transfert pour retirer la couche supérieure contenant le plasma riche en plaquettes jusqu’à ce qu’il reste un centimètre de plasma au-dessus de la couche leucocytaire érythrocytaire et mettez le plasma de côté à température ambiante pour un traitement ultérieur. Transférez ensuite la couche leucocytaire dans un tube conique stérile de 50 millilitres et diluez les globules blancs à 24 millilitres.

Avec le RPMI basal ensuite, ajoutez trois millilitres de faible densité, son opaque 1,077 à chacun des trois tubes coniques de 15 millilitres. Placez ensuite l’extrémité d’une pipette étroite de cinq millilitres au fond de chaque tube. À son tour et lentement libérer trois millilitres de haute densité, son opaque 1.119.

Maintenant, utilisez une pipette automatisée sur le réglage de faible puissance pour ajouter soigneusement huit millilitres de sang dilué à chaque gradient sans perturber les couches. Un colorant bleu a été ajouté au dégradé de faible densité pour la visualisation de toutes les couches de dégradé. Après avoir séparé les cellules par centrifugation séparément, prélever les cellules mononucléaires et polymorphonucléaires à l’aide de pipettes en verre stériles sans perturber les autres bandes cellulaires.

Regroupez les populations de cellules mononucléaires et polynucléaires de chaque tube dans des tubes coniques stériles uniques de 50 millilitres pour chaque type de cellule, et ajoutez quatre volumes de RPMI dans les deux tubes. Après avoir tourné, les cellules transfèrent les granulés dans un tube de 1,5 millilitre et les remettent en suspension dans 80 microlitres de RPMI frais complété par du BSA. Ajoutez ensuite 20 microlitres d’anticorps anti CD 14 et anti CD 15 marqués par billes magnétiques aux fractions de cellules mononucléaires et polymorphonucléaires respectivement.

Incuber chaque suspension cellulaire pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, puis laver chaque tube avec un millilitre de média R-P-M-I-I-B-S-A, remettre les granulés en suspension dans 500 microlitres de R-P-M-I-B-S-A. Appliquez ensuite les suspensions cellulaires sur des colonnes LS lavées individuelles en R-P-M-I-B-S-A et lavez chaque colonne trois fois avec trois millilitres de milieu R-P-M-I-B-S-A Collectez les flux de suspension cellulaire et les lavages de colonne dans des tubes stériles pour isoler les monocytes et les neutrophiles, retirez les colonnes du champ magnétique après le lavage final et éluez les cellules sélectionnées positivement dans un tube stérile avec cinq millilitres de R-P-M-I-B-S-A. Pour isoler les lymphocytes, granulez la fraction de lavage de la colonne cellulaire, remettez en suspension la cuiller cellulaire dans 80 microlitres de R-P-M-I-B-S-A, et incubez les cellules dans 20 microlitres d’anticorps CD 61 et CD 2 35 A pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, répétez la séparation maximale comme précédemment, et collectez le flux contenant les lymphocytes pour isoler les plaquettes, centrifugez, le plasma riche en plaquettes réservé, puis retirez le plasma et lavez la pastille cellulaire une fois avec cinq millilitres de PBS stérile complété par un microgramme par millilitre de prostaglandine I deux remettre en suspension la pastille plaquettaire dans un millilitre de prostaglandine PBS fraîche I deux tampon pour mettre en plaque les monocytes isolés, lymphocytes, neutrophiles et plaquettes. Comptez d’abord les cellules et amenez-les à un volume approprié dans un milieu de test XF pour permettre une densité d’ensemencement de 2,5 fois 10 à la cinquième cellule par puits dans un volume de 200 microlitres. Dans une microplaque de culture cellulaire XF de 24 puits recouverte de la cellule T pour les plaquettes, semez 2,5 fois 10 aux sept cellules par puits dans un volume de 200 microlitres.

Après avoir fait tourner les cellules sur la plaque, portez les volumes finaux du puits jusqu’à 660 microlitres avec un média XF et incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avant le test XF pendant la charge d’incubation, 75 microlitres des réactifs de test dans l’ordre indiqué dans les ports d’injection de cartouche du capteur XF. Si des mesures d’éclat oxydatif doivent être obtenues, le PMA peut être injecté après l’antimycine, puis le chargement de l’orifice d’injection place la cartouche sur l’analyseur de flux extracellulaire pour commencer le test. Les profils bioénergétiques des leucocytes et des plaquettes peuvent être déterminés à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire Seahorse XF, qui mesure la consommation d’oxygène en temps réel dans les cellules de manière non invasive.

Chaque type de cellule est plaqué sur la microplaque XF 24 avec cinq répétitions, comme cela vient d’être démontré dans le tableau. Les valeurs représentatives de l’éclatement basal et oxydatif mesurées au cours de l’essai et les concentrations moyennes de protéines par puits sont mises en évidence par type de cellule. Les valeurs du taux de consommation d’oxygène sont normalisées en fonction de la teneur totale en protéines dans les puits correspondants et exprimées en p moles par minute et par microgramme de protéines. Le taux de consommation basale d’oxygène est ensuite établi par les trois premières mesures.

L’oligomycine, un inhibiteur de la TP synthase mitochondriale A, est injectée dans le milieu XF pour estimer le taux de consommation d’oxygène couplé à une synthèse de TP et est représentée par un TP lié au taux de consommation d’oxygène résiduel moins le taux de consommation d’oxygène non mitochondrial peut être attribué à une fuite de protons. L’ajout du FCCP de découplage permet de déterminer le taux maximal de consommation d’oxygène, suivi d’une injection d’antimycine a et d’un inhibiteur de la respiration mitochondriale pour mesurer les sources non mitochondriales de consommation d’oxygène. La capacité de réserve est une mesure de la quantité de travail supplémentaire que les mitochondries peuvent effectuer en cas de demande énergétique accrue et peut être calculée comme la différence entre le taux maximal de respiration et le taux basal afin de déterminer la capacité d’explosion oxydative des monocytes et des neutrophiles.

Un agoniste P-M-A-A-P-K-C est injecté et l’augmentation du taux de consommation d’oxygène est liée à la production d’oxydant par la N-A-D-P-H oxydase Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en aussi peu que trois heures après le prélèvement sanguin, sans compter le test lui-même s’il est effectué correctement. Lors de cette procédure, il est important de maintenir des conditions stériles en effectuant chaque étape dans une enceinte de sécurité biologique et en utilisant des tampons et des milieux stériles à température ambiante. Suite à cette procédure, nous pouvons faire d’autres protocoles, tels que l’analyse par fax pour déterminer la pureté des cellules, l’état d’activation des leucocytes, et aussi pour déterminer la bioénergétique cellulaire dans les sous-populations de leucocytes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez maintenant avoir une idée assez claire de la façon de préparer les plaquettes, les lymphocytes, les monocytes et les neutrophiles, et de les mettre dans l’hippocampe et de mesurer l’explosion oxydative et la fonction mitochondriale à partir de ces données. Ensuite, vous pouvez analyser vos populations de patients et déterminer comment leur bioénergétique évolue en temps réel. N’oubliez pas que travailler avec des échantillons de patients humains peut être extrêmement dangereux.

Par conséquent, vous devez porter un équipement de protection individuelle ainsi qu’utiliser une enceinte de sécurité biologique pendant cette procédure.