Name: Bioénergétique et les oxydatif: Protocoles pour lisolement et lévaluation des leucocytes humains et plaquettes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-27T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Apprenez à isoler et évaluer la fonction mitochondriale et la réponse oxydative des leucocytes et plaquettes humains. Cette méthode permet de surveiller la santé bioénergétique et les processus pathologiques en temps réel.

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Les auteurs tiennent à souligner la contribution technique de Gloria Benavides A. Ce travail a été soutenu par l&#39;American Heart Association 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC), les complications diabétiques NIDDK Consortium (DiaComp, www.diacomp.org) DK076169 de subvention (sous-subvention sur écran), et le P30 DK079337 O&#39;Brien Center (sur écran).

Tous les protocoles décrits dans ce manuscrit pour la collecte de sang, l&#39;isolement et l&#39;analyse ont été examinés et approuvés par le comité d&#39;examen institutionnel de l&#39;Université d&#39;Alabama à Birmingham. Une. Isolement cellulaire (modification de Protocole Sigma-Aldrich Histopaque n ° 1119 et Miltenyi Biotec microbille positive et les protocoles de sélection négative) <ol><li> sang total Centrifugeuse (recueillies dans ACD ou tubes EDTA) à 500 g pendant 15 min dans une centrifugeuse avec un rotor oscillant-seau (accélération = 5-6, et pas de frein). </li><li> Enlever la couche supérieure qui contient le plasma riche en plaquettes (PRP) avec une pipette de transfert jusqu&#39;à 1 cm reste au-dessus de la couche cellulaire (manteau érythrocytes / leucocytaire). Mettez de côté le PRP à la température ambiante pour un traitement ultérieur. </li><li> Transférer la couche leuco-plaquettaire à un 50 ml tube conique stérile, diluer à 24 ml avec de base RPMI ou au moins 4x le volume de départ de la couche leuco-plaquettaire. Remarque: La moitié supérieure de la couche de RBC peuvent have être inclus, bien que cela se traduira par l&#39;augmentation du volume du milieu RPMI proportionnellement. </li><li> Préparer le gradient de densité en utilisant une faible densité de Ficoll ayant une densité de 1,077 (1,077) pour la couche supérieure et Ficoll à haute densité ayant une densité de 1,119 (1,119) pour la couche inférieure dans trois tubes de 15 ml coniques (3 ml chacune). Pour effectuer cette étape, tout d&#39;abord ajouter 1,077 à chaque tube. L&#39;utilisation d&#39;un 5 ml pipette étroite ajouter 1119 au fond du tube en plaçant la pointe de la pipette sous 1077 et relâchez lentement le réactif sans mélange avec le gradient supérieur. Un total de 6 ml de milieu à gradient de densité doit être présent à ce stade avec une phase visible de la séparation à la marque 3 ml. </li><li> Utilisation d&#39;une pipette automatique, ajouter 8 ml de sang dilué (de l&#39;étape 1.3) doucement chaque tube gradient en utilisant le réglage de faible puissance pour éviter de perturber les couches de gradient. Le volume total devrait être de 14 ml à cette étape. </li><li> Tubes à centrifuger à 700 g pendant 30 min à température ambiante (Acceleration 6, pas de frein). Note: A ce stade, les trois bandes distinctes de cellules devraient être évidents (Figure 1A). Les bandes supérieures (entre 1077 et plasma) contient des cellules mononucléaires (MNC) et les plaquettes, et la bande du milieu (entre 1007 et 1119) contient des cellules polymorphonucléaires (PMN) et la bande inférieure (ci-dessous 1119) contient des globules rouges. </li><li> Recueillir le MNC et PMN séparément à l&#39;aide de pipettes en verre stériles sans déranger les autres groupes de cellules. Combiner la population MNC de chaque tube dans un tube conique de 50 ml stérile. Répétez cette opération pour la population PMN ainsi. </li><li> Ajouter 4 volumes de RPMI à chaque tube contenant les fractions et MNC PMN respectivement pour diluer le gradient de densité. </li><li> Tubes à centrifuger à 700 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension MNC culot cellulaire et PMN culot cellulaire dans 1 ml de RPMI contenant 0,5% ultra-pure gras sans acide BSA (RPMI-BSA) et de les transférer à stériles tubes de 1,5 ml. Pellet les cellules en utilisant un picofuge de paillasse pour 30sec. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension chaque culot cellulaire dans 80 ul de milieu RPMI-BSA. </li><li> Ajouter 20 ul de billes magnétiques-anticorps marqué antiCD14 dans le tube contenant la fraction MNC pour une sélection positive des monocytes. Pour le tube contenant la fraction de cellules PMN, ajouter 20 ul de billes magnétiques-anticorps marqué antiCD15 pour la sélection positive de cellules neutrophiles. Incuber chaque suspension de cellules pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Laver chaque suspension de cellules avec 1 ml de milieu RPMI-BSA et un culot comme précédemment et remettre en suspension chaque culot dans 500 ul de RPMI-BSA. </li><li> Les cellules marquées sont séparées dans le champ magnétique de la cellule activée tri magnétique (MACS) séparateur. Préparer les colonnes MACS LS (une pour chaque suspension de cellules) en plaçant la colonne de séparation MACS et lavage avec 3 ml de RPMI-BSA avant l&#39;ajout de la suspension de cellules. </li><li> Après l&#39;application de suspensions cellulaires, laver chaque colonne 3x avec 3 ml de RPMI-BSA médias (assurez-vous de laisser le drai des médiasn complètement entre les lavages). Recueillir la suspension cellulaire accréditive et lavages de colonne dans un tube stérile. </li><li> Pour isoler les monocytes et les neutrophiles, retirer la colonne du champ magnétique après le lavage final et éluer les cellules sélectionnées positivement dans un tube stérile avec 5 ml de RPMI-BSA en utilisant le piston de la colonne. </li><li> Pour isoler les lymphocytes granulés la fraction accréditives lavage des multinationales de l&#39;étape 1.15 à 300 g pendant 10 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 80 ul de milieu RPMI-BSA. Ajouter 20 ul d&#39;anticorps CD61 et CD235a et incuber la suspension de cellules pendant 15 min à 4 ° C. Répétez la séparation MACS comme avant et collecter le flux mais contenant les lymphocytes. </li><li> Pour sédimenter les monocytes, les neutrophiles et les lymphocytes fractions, centrifugeuse avant (étape 1.9) et jeter les surnageants. Les culots cellulaires devraient être remises en suspension dans 1 ml extracellulaires flux médias (XF-DMEM) pour le comptage. &lt;br /&gt; Note: 8 ml de sang entier doivent aboutir à 1-5 x 10 6 monocytes / ml et 5-20 x 10 6 lymphocytes et des neutrophiles / ml. </li><li> Pour isoler les plaquettes, centrifugeuse PRP (étape 1.2) pour les 8-10 min à 1500 xg à température ambiante. Retirez le plasma et laver culot cellulaire une fois avec 5 ml stériles PBS additionné de 1 pg / ml PGI 2, repellet et suspendre culot final dans 1 ml de tampon PBS-PGI 2. </li><li> Déterminer la numération plaquettaire par turbidimétrie une fois que les plaquettes sont mises en suspension dans du tampon PBS-PGI 2 par spectrophotomètre tel que décrit par Walkowiak et al en utilisant l&#39;équation suivante: [6,23 / (2,016 - Abs 800)] - 3,09 x facteur de dilution = # x 10 8. plaquettes / ml 12. </li></ol> 2. Placage des cellules <ol><li> Préparation de Cell-Tak (adhésif de cellule): Ajouter adhésif de cellule de 90 pi à 180 pi diH 2 0, 540 ul de 0,1 N bi de sodiumcarbonate (pH 8,0), et ajuster le pH à 7.2 à 7.8 à l&#39;aide de NaOH 1 N. Préparer plaques XF (24 puits, V7 microplaques) en revêtant chaque puits avec 30 pi de colle cellulaire préparé. Remarque: L&#39;adhésif de cellule doit être préparé pour chaque utilisation. </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C pendant 20-30 minutes, puis colle cellule d&#39;aspiration et laver les puits avec du PBS deux fois (1 ml / puits). </li><li> Effectuer un comptage de cellules sur les monocytes isolés, des lymphocytes, des neutrophiles et des plaquettes et amener au volume approprié à l&#39;aide XF-DMEM à permettre à une densité de semis de 250 k cellules / puits pour les monocytes, les lymphocytes et les neutrophiles, et 25 x 10 6 / puits pour les plaquettes. Sinon, pour mesurer la réponse de burst oxydatif, les neutrophiles peuvent être ensemencées à 125K cellules / puits. Le volume d&#39;ensemencement final de chaque suspension cellulaire doit être de 200 pl / puits. </li><li> Centrifuger la plaque à 200 g pendant 1 sec sans frein. Faites pivoter la plaque de 180 ˚ et centrifuger à nouveau sans frein à 300 x g. </li><li> Apportez ainsi finale volume à 660 pi avec XF-DMEM et incuber à 37 º C pendant 30 minutes avant l&#39;essai XF. Remarque: Des microphotographies de cellules étalées, avant et après le test peut être utilisé pour assurer le placage adéquate et écarter le détachement des cellules. </li></ol> 3. Préparation d&#39;un 24 puits extracellulaire Flux Essai Plate (XF24) <ol><li> Hydrate XF sonde avec une solution d&#39;étalonnage pour un minimum de 2 heures avant le dosage. </li><li> Préparer 10x stocks de 0,5 pg / ml, 0,6 uM oligomycine FCCP, et 10 uM antimycine A en XF-DMEM et charge 75 pi de solutions mères dans les ports d&#39;injection de la cartouche dans l&#39;ordre ci-dessus. Si les mesures d&#39;éclatement oxydation doivent être obtenus, l&#39;injection de 10x bilan de 100 ng ml de PMA / peut être injectée après antimycine-A. </li><li> Calibrer la cartouche hydratée et chargé et effectuer le test XF. Les méthodes détaillées pour l&#39;analyse et l&#39;interprétation de la consommation d&#39;oxygène et le pH des changements ont été décrits dans des publications antérieures 9,13,14 et sont non-Discussed en détail ici. </li><li> Après essai XF, aspirer tous, mais les 50 dernières ul de DMEM XF-après dosage pour éviter la perte de cellules de la plaque et ajouter ul RIPA tampon de 50 lyse cellulaire et d&#39;effectuer une analyse des protéines pour la normalisation. </li></ol>

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</ol>

Écran de visualisation est un membre du Conseil consultatif scientifique Bioscience hippocampe.

Ce protocole représente la compilation de plusieurs techniques couramment utilisées pour l&#39;isolement de cellules de sang, d&#39;une manière adaptée à l&#39;analyse de la bioénergétique. Les techniques présentées contigus sont avantageux à d&#39;autres méthodes d&#39;isolement (analyse FACS) pour leur capacité à isoler un grand nombre de cellules dans des conditions contrôlées de médias avec un minimum de contraintes placées sur des cellules isolées. Il présente l&#39;inconvénient de longs isolements même avec un minimum d&#39;interruptions. Ce protocole sert de base pour l&#39;isolement de cellules du sang de sujets humains primaires, qui peuvent être extrapolés à des paramètres cliniques et de recherche de translation. MACS séparation est une technique d&#39;isolement des cellules fiable qui offre la possibilité d&#39;isoler les cellules directement à partir du sang total, mais ce procédé nécessite de plus grandes quantités d&#39;anticorps et n&#39;est pas optimale pour l&#39;isolement de l&#39;ensemble des quatre types distincts de cellules telles que décrites dans la présente méthode. Il a been aucune preuve pour montrer que la sélection positive des leucocytes par les résultats de séparation MACS dans l&#39;activation en utilisant notre protocole d&#39;isolement. Colonnes MACS fonctionnent par la séquestration de cellules marquées dans un champ magnétique en utilisant des anticorps conjugués à des particules superparamagnétiques 50 nm. Les cellules marquées sont ensuite élues de la colonne. Sélections positives et négatives sont mises en œuvre dans ce protocole afin d&#39;assurer l&#39;isolement rapide et la pureté. Si le nombre de cellules sont obtenues à partir de l&#39;insuffisance isolement ou la pureté en question est, plusieurs anticorps peuvent être ajoutés à l&#39;échantillon selon les instructions du fournisseur et le second passage à travers la colonne de LS peut se traduire par une plus grande pureté (tableau 2). Notre laboratoire a trouvé une grande pureté et l&#39;efficacité de placage à l&#39;aide du protocole existant en analysant suspensions cellulaires finales par analyse FACS 8. Analyseurs de flux extracellulaires ont la possibilité de surveiller à la fois la consommation d&#39;oxygène et l&#39;acidification des médias en temps réel sur celle de otses électrodes. La consommation d&#39;oxygène telle qu&#39;elle est observée par la réaction oxydative dans les monocytes et les neutrophiles est la NADPH oxydase dépendante comme indiqué par l&#39;inhibition avec le DPI 8. Nous avons constaté une perte dépendant du temps de la capacité de salve oxydative avec isolements prolongés ou des dosages de XF étendues. Ce protocole a été conçu et mis au point pour une utilisation sur le XF24 mais est également compatible avec le XF96 à environ un tiers à une moitié de la cellule XF24 densités d&#39;ensemencement (Figure 3). Dans la conception de ce protocole, l&#39;adhésion aux protocoles existants pour chaque technique était nécessaire pour des performances optimales avec des modifications apportées uniquement à contrôler les conditions de médias pour l&#39;analyse bioénergétique. Après la maîtrise des techniques, un tel protocole peut être utilisé dans un large éventail d&#39;applications de translation et de recherche pour mesurer la toxicité ou l&#39;efficacité des stratégies de traitement, d&#39;explorer les caractéristiques métaboliques de la maladie, et la production d&#39;oxydants par des monocytes et neutrophils dans des conditions inflammatoires.

Surveillance de la santé métabolique de cellules immunitaires (monocytes, lymphocytes, les neutrophiles et les plaquettes) du sang a été reconnu depuis un certain temps comme un outil de diagnostic potentiellement utile pour évaluer la santé bioénergétique globale d&#39;un individu. Il existe un corps émergeant de la littérature attribuer un certain nombre de maladies telles que le cancer, les maladies cardiovasculaires et les maladies neurodégénératives à un dysfonctionnement mitochondrial 1,2. Ceci est d&#39;importance clinique depuis un dysfonctionnement mitochondrial peut initier une série d&#39;événements cellulaires qui favorisent les voies de signalisation pro-inflammatoires, ou conduisent à la mort cellulaire. Plusieurs études ont caractérisé la fonction mitochondriale des cellules et les plaquettes sanguines mononucléaires périphériques dans des conditions telles que la fibromyalgie, le diabète, un choc septique, et la maladie d&#39;Alzheimer 7.3. Par exemple, une étude récente a évalué les bioénergétique des plaquettes comme un marqueur de la fonction mitochondriale et a constaté que les plaquettes de type 2 diabetic patients avaient diminué la consommation d&#39;oxygène des mitochondries 7,8. A partir de ces conclusions et d&#39;autres, il est clair que les monocytes, les lymphocytes, les neutrophiles et les plaquettes peuvent servir de marqueurs de substitution de l&#39;évolution de la bioénergétique dans des conditions pathologiques puisqu&#39;ils enquête la circulation systémique et peuvent refléter des changements métaboliques locaux et mondiaux. Pour déterminer si cette approche a une valeur pronostique ou diagnostique une méthode à haut débit d&#39;analyse et une méthode cohérente pour la préparation de cellules est nécessaire. Les méthodes pour mesurer la fonction mitochondriale dans les leucocytes et les plaquettes ont déjà participé isolement des mitochondries ou l&#39;évaluation de bioénergétique cellulaire dans des cellules intactes 4,9. L&#39;avantage de l&#39;évaluation bioénergétique cellulaire en utilisant un flux extracellulaire (XF) d&#39;analyseur est que la fonction mitochondriale dans les cellules peut être établie avec des substrats endogènes et des paramètres respiratoires tels que fuite de protons et respiratoire maximalecapacité peut être déterminée. Nous et d&#39;autres avons utilisé cette technologie pour montrer que les profils bioénergétiques dans les plaquettes, les monocytes et les lymphocytes isolés à partir de sang humain peuvent être établis et comparés entre les différents types de cellules 8. En outre, deux des neutrophiles et des monocytes possèdent une capacité oxydative dans laquelle oxydases NADPH sont activés et consomment de l&#39;oxygène pour former la superoxyde. Surtout, cette voie est un élément clé de l&#39;immunité innée et est modulée par l&#39;inflammation systémique. Par exemple, il a été montré que les variations de la capacité oxydante de salve sont associés à diverses maladies auto-immunes telles que la sclérose en plaques, l&#39;arthrite, et des infections récurrentes 10,11. Actuellement, il n&#39;y a pas de tests quantitatifs à haut débit disponibles pour mesurer la poussée oxydative dans des échantillons cliniques. Ceci est important étant donné que la caractérisation de la capacité oxydative des neutrophiles et des monocytes peut également servir d&#39;outil de diagnostic important pour plusieurs pathologies. Les principaux défis techniques ont été peu sensible pour la mesure de la consommation d&#39;oxygène en utilisant des techniques polarographiques classiques et la nécessité d&#39;utiliser des cellules fixées lors de l&#39;utilisation des techniques de microplaque fluorométriques plus sensibles. Dans cette vidéo pratique, nous décrivons la solution à ces problèmes techniques. Nous détaillons les méthodes pour l&#39;isolement, le placage et la mesure de la bioénergétique de monocytes, les lymphocytes, les neutrophiles et les plaquettes et la poussée oxydative des monocytes et des neutrophiles du sang humain. Cette méthode est appropriée pour l&#39;évaluation clinique de la bioénergétique et oxydatif pour les enquêteurs qui ont l&#39;accès à une population de patients, et la capacité d&#39;obtenir des échantillons de sang frais.

<table><tbody><tr><td>Le kit de démarrage QuadroMACS comprend un séparateur QuadroMACS et un support MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-833</td><td></td></tr><tr><td>CD235a (glycophorine A) Microbilles, humaines</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-501</td><td></td></tr><tr><td>CD61 Microbilles, humaines pour plaquettes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-051-101</td><td></td></tr><tr><td>CD14 Microbilles, humaines pour monocytes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>CD15 Microbilles humaines pour granulocytes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-601</td><td></td></tr><tr><td>LS Colonnes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer ACD Tubes de prélèvement sanguin</td><td>Fisher</td><td>02-684-26</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td>avec L-glutamine et sans rouge de phénol</td></tr><tr><td>Prostaglandine I2, sodium sel</td><td>Caïman</td><td>18220</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml demi-micro cuvettes</td><td>Phenix Research Products</td><td>SC-2410</td><td></td></tr><tr><td>Gradient de densité histopaque, densité 1,077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Gradient de densité histopaque, densité 1,119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine fraction V</td><td>Roche</td><td>3117405001</td><td>acides gras ultra-free</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acétate</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>XF24 FluxPak</td><td>Seahorse Biosciences</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher</td><td>MT90113PB</td><td>sans glucose, L-glutamine, pyruvate, rouge de phénol et bicarbonate</td></tr><tr><td>L-glutamine, 200 mM (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma</td><td>P8574</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak (adhésif cellulaire)</td><td>BD Biosciences</td><td>CB-40242</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycine</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Antimycine A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>(FCCP) Cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone</td><td>Sigma</td><td>C-2920</td><td></td></tr><tr><td>DC Réactif de dosage de protéines A</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0113</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de dosage des protéines DC S</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0015</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de dosage des protéines DC B</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0114</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse</td><td>Seahorse Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Séparateur QuadroMACS et spectrophotomètre</td><td></td><td></td> MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-090-976 et 24039 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bioénergétique et les oxydatif: protocoles pour l&#39;isolement et l&#39;évaluation des leucocytes humains et plaquettes

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Dysfonctionnement mitochondrial est connue pour jouer un rôle important dans un certain nombre de conditions pathologiques telles que l&#39;athérosclérose, le diabète, le choc septique, et les maladies neurodégénératives, mais l&#39;évaluation des changements dans la fonction bioénergétique chez les patients est un défi. Bien que les maladies telles que le diabète ou l&#39;athérosclérose présente cliniquement atteints d&#39;insuffisance d&#39;organe spécifique, les composantes systémiques de la pathologie, tels que l&#39;hyperglycémie ou l&#39;inflammation, peuvent altérer la fonction bioénergétique dans les leucocytes ou les plaquettes de circulation. Ce concept a été reconnu depuis un certain temps, mais son application généralisée a été entravée par le grand nombre de cellules primaires nécessaires à l&#39;analyse bioénergétique. Cette limitation technique a été résolu par la combinaison de la spécificité des techniques d&#39;isolement de billes magnétiques, des techniques d&#39;adhérence cellulaire, qui permettent aux cellules d&#39;être fixés sans activation de microplaques, et la sensibilité des nouvelles technologies conçue pour un débit élevé micrespirométrie ROPLATE. Un exemple de cet appareil est un analyseur de flux extracellulaire. Cette instrumentation utilise généralement l&#39;oxygène et le pH sondes sensibles pour mesurer les taux de variation de ces paramètres dans les cellules adhérentes, qui peuvent ensuite être liés au métabolisme. Ici, nous détaillons les méthodes d&#39;isolement et de placage de monocytes, les lymphocytes, les neutrophiles et les plaquettes, sans activation, à partir de sang humain et de l&#39;analyse de la fonction mitochondriale bioénergétique dans ces cellules. En outre, nous montrons comment la poussée oxydative dans les monocytes et les neutrophiles peut aussi être mesurée dans les mêmes échantillons. Puisque ces méthodes utilisent seulement 8-20 ml de sang humain, ils ont le potentiel pour le suivi réactif génération et la bioénergétique des espèces d&#39;oxygène dans un cadre clinique.

Afin d&#39;évaluer les bioénergétique des cellules du sang, le sang total est recueilli à partir de sujets humains par ponction veineuse dans un tube de collecte de Vacutainer EDTA ou ACD. L&#39;isolement des leucocytes et des plaquettes suivants collecte de sang est visualisée sur la figure 1A comme décrit dans le protocole. Des échantillons de sang total sont traités dans les 8 heures de collecte pour éviter la mort des cellules et l&#39;activation. Temps de stockage prolongé de plus de 8 heures n&#39;ont pas été testés, mais peuvent entraîner bioénergétique altérées et moins représentatif des conditions physiologiques. Tubes acide citrate dextrose (ACD-8 ml) et de l&#39;EDTA Vacutainer ont été utilisés pour les isolements cellulaires sans effet observé sur la fonction métabolique de cellules isolées. Les anticoagulants sont nécessaires comme des caillots de réduire le nombre de cellules obtenues, interfèrent avec la formation de la phase correcte au cours de la centrifugation en gradient de Ficoll, et entraînent peu ou pas de plaquettes obtenues dans le sérum centrifugé. Tout le sang représente un biolodanger ical et équipement de protection individuelle doivent être mises en œuvre tout au long de la procédure, même après populations de cellules sont isolées ou lysats cellulaires sont générés. Les échantillons doivent être éliminés conformément aux normes d&#39;élimination des déchets humains de l&#39;institution. Le sang total est centrifugé pour séparer le plasma riche en plaquettes à partir de la couche leucocytaire, la couche blanche juste au-dessus des globules rouges concentrés qui contient les leucocytes. La couche leucocytaire est appliquée sur des gradients de densité et centrifugé pour obtenir les cellules mononucléaires du sang périphérique (monocytes et lymphocytes) et des cellules polynucléaires (granulocytes). Contamination RBC des phases individuelles de cellules MNC et PMN est commun à ce stade et devrait être résolu lors de la purification de MACS. Les divers types de cellules sont ensuite obtenues par incubation avec des anticorps magnétiques pour obtenir des fractions pures. Les monocytes sont collectées par incubation de la fraction des CMSP avec le CD14, le flux continu à partir de til contient des lymphocytes, des monocytes, qui sont ensuite épuisés de globules rouges et des plaquettes. Les neutrophiles sont obtenues par incubation de la couche de cellules polymorphonucléaires avec l&#39;anticorps CD15 (Figure 1A). Par la suite, les plaquettes peuvent être rassemblées en un culot par centrifugation du plasma riche en plaquettes et on les lave pour éliminer d&#39;autres composants du plasma. Après ces sélections les plaquettes, les monocytes CD14 +, les lymphocytes, les neutrophiles CD15 + peuvent être comptées et étalées sur un support revêtu XF plaque d&#39;analyseur de l&#39;adhésion cellulaire et l&#39;analyse de la bioénergétique oxydative. Chaque étape de la procédure doit être effectuée dans des conditions stériles et est encouragé à empêcher l&#39;activation prématurée de la réaction oxydative dans les monocytes et les neutrophiles. Un indicateur de moins de conditions stériles pendant l&#39;isolement est évident lorsque les neutrophiles, qui ont peu ou pas de consommation d&#39;oxygène dans des conditions basales, commencent le dosage flux extracellulaire avec des mesures OCR élevées queprogressivement augmenter ou diminuer tout au long de l&#39;essai. Nous soulignons l&#39;importance de l&#39;imagerie des cellules par microscopie optique à 200X ou plus pour s&#39;assurer que pas de signes morphologiques d&#39;activation ont eu lieu avant le dosage. Par exemple, les neutrophiles affichent normalement un arrondi à la forme irrégulière avec des limites de cellules marquées comme on le voit sur ​​la figure 1B. Cependant, ces cellules vont aplatir contre la surface de la plaque lorsqu&#39;elle est activée et perdent leur morphologie cellulaire distinct. Nous avons déjà signalé les changements morphologiques des leucocytes et des plaquettes activées en utilisant ce protocole et des mesures supplémentaires doivent être prises pour garantir des conditions stériles si l&#39;activation 8 rencontrer. Un schéma simplifié du protocole est vu sur la figure 2 en tant que table de temps dans lequel les étapes principales de l&#39;isolement des cellules, XF préparation de la plaque, et le dosage XF sont détaillées. L&#39;isolement consiste en la séparation par gradient de densité de types de cellules etest suivi par une séparation magnétique. Parallèlement au processus d&#39;isolement cellulaire, XF plaque préparation est nécessaire pour éviter les retards dans le placage de cellule ou de commencer l&#39;essai XF. Ceci est important car des retards importants peuvent conduire à l&#39;activation de la cellule et les paramètres bioénergétiques diminué. Concentrations cellulaires inadéquats après l&#39;isolement sont un problème et l&#39;optimisation de chaque processus de centrifugation commun est nécessaire pour éviter la perte de cellules. Isolations réussies ont été réalisées sur aussi peu que six ml de sang, mais des modifications peuvent être faites en fonction de la concentration de type cellulaire souhaité circulant. Si le gradient de densité est mal préparé, les phases de cellulaires distincts pourraient ne pas être visible et la perte de cellules peuvent se produire (voir JoVE vidéo d&#39;instruction pour une démonstration visuelle). Plaquettaire insuffisante isolé du PRP est rare, mais a eu lieu si le tampon de lavage ne ​​contient pas de PGI 2 ou si l&#39;isolement a lieu en dessous de la température ambiante. Le risque d&#39;une plaquettairectivation est souvent empêchée si les plaquettes sont les dernières cellules à isoler, mais si les plaquettes restent dans le tampon de lavage pendant de longues périodes les bioénergétique seront affectés. Il ya eu des cas de populations de plaquettes plus petites qui n&#39;ont pas Pellet lors de la centrifugation de 1500 xg et la bioénergétique de ces cellules n&#39;a pas été largement caractérisés. Voir le tableau 2 pour un guide plus complet de dépannage. Les profils bioénergétique de leucocytes et les plaquettes peuvent être déterminées en utilisant l&#39;analyseur XF, qui mesure en temps réel consommation d&#39;O 2 dans les cellules de façon non invasive. Chaque type de cellules est étalée sur la plaque de XF24 avec cinq répétitions comme représenté sur la figure 3A. Tableau 1 indique l&#39; oxydatif basales et les valeurs attendues par type de cellule au cours de l&#39;essai, les concentrations moyennes de protéine par puits. Technologies de débit plus élevé sont disponibles, tels que le XF96, ce qui permet dequatre donateurs à évaluer simultanément comme le montre la figure 3B. Après l&#39;essai, les données sont exportées vers un ordinateur poste de travail pour l&#39;analyse à l&#39;aide du logiciel approprié XF et Microsoft Excel. Les valeurs ont été normalisées à l&#39;OCR teneur totale en protéine dans les puits correspondants et sont exprimés en pmol / min / mg de protéine. Les profils de rafale bioénergétiques-oxydant représentatives de chaque type de cellule ont été signalés récemment par notre groupe 8. Une analyse plus poussée des paramètres de l&#39;analyse bio-énergétiques (basal, ATP-lié, proton fuite, maximal, et nonmitochondrial poussée oxydative) peut être calculé pour des puits individuels comme précédemment illustré et décrit ci-dessous 8. Le taux de consommation d&#39;oxygène de base (OCR) est établie par les trois premières mesures, comme indiqué sur la figure 4A. Oligomycine (0,5 pg / ml), un inhibiteur de la synthase mitochondriale d&#39;ATP est injecté dans le moyen pour estimer la XF OCR couplé à la synthèse d&#39;ATP et repré<html> ted que l&#39;ATP-lié. L&#39;OCR résiduelle moins l&#39;OCR nonmitochondrial peuvent être attribués à fuite de protons. Puis FCCP un découpleur est ajoutée afin de déterminer la reconnaissance optique de caractères maximal, suivi par l&#39;antimycine A, un inhibiteur de la respiration mitochondriale, pour déterminer les sources nonmitochondrial de consommation d&#39;oxygène. La capacité de réserve est une mesure de la quantité d&#39;ATP qui peut être produite sous la demande d&#39;énergie et peut être calculée comme la différence entre le taux maximum de la respiration et de la base. Afin de déterminer la capacité oxydante de salve, le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), un agoniste de la PKC est injecté pour augmenter l&#39;activité de la NADPH oxydase, et l&#39;augmentation de la vitesse de consommation d&#39;oxygène après stimulation par PMA peut être mesurée en utilisant l&#39;analyseur XF. Figure 4B montrer comment calculer les différents paramètres de la fonction mitochondriale et oxydatif. <html> 1301/51301fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51301/51301fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Isolement des leucocytes et des plaquettes de sang total. A) des échantillons fraîchement recueillis sont séparés en leur plasma et les composants cellulaires par centrifugation et purifiés par gradient de Ficoll et magnétique tri cellulaire activé (MACS) en positif (monocytes et neutrophiles) ou de la sélection négative (lymphocytes), tandis que les plaquettes sont isolées par une grande vitesse de centrifugation plasma riche en plaquettes. B) Images des populations cellulaires isolées fois remises en suspension dans du DMEM XF et étalées à des densités cellulaires indiqués. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51301/51301fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> ghres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51301/51301fig2.jpg &quot;/&gt; Figure 2. Préparation des plaques pour les études XF24 bioénergétique de leucocytes et des plaquettes. Chronologie détaillées pour la préparation d&#39;une plaque d&#39;essai de XF24 par isolement des cellules et le placage et la cartouche d&#39;hydratation et d&#39;injection orifice de chargement. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51301/51301fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51301/51301fig3.jpg" /> Figure 3. Disposition des leucocytes et des plaquettes sur XF24 et XF96 plaques d&#39;analyse. A) Les leucocytes (cellules 125-250k / puits) et les plaquettes (25 x 10 6 cellules / puits) à partir d&#39;un seul donneur sont plaqués sur la plaque d&#39;essai de XF24 parmi fond contrôles. 75 ul de stocks de 10x (oligomycine 0,5 pg / ml), FCCP (0,6 uM), l&#39;antimycine A (10 pM) et du PMA (100 ng / ml) dilué dans XF médias sont chargées dansaux ports d&#39;injection indiqués. B) Les leucocytes (cellules de 75 150k / puits) et les plaquettes (10 x10 6 cellules / puits) de moins de quatre donateurs peuvent être plaqués sur le XF96 dans un volume total de 180 pl XF-DMEM. 20 ul de stocks de 10x oligomycine (1,0 pg / ml), FCCP (0,6 uM), l&#39;antimycine A (10 pM) et du PMA (100 ng / ml) dilué dans du DMEM-XF sont chargés dans les orifices d&#39;injection indiqués. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51301/51301fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51301/51301fig4.jpg" /> Figure 4. Analyse des indices bioénergétique. A) trace Représentant du taux de consommation d&#39;oxygène (OCR) par les mitochondries et burst oxydatif dans les monocytes. Basale OCR est établi (3 premiers taux indiqués par des numéros dans les cercles). Puis additions séquentielles d&#39;oligomycine (O; 0,5 pg / ml), FCCP (F; 0,6 uM) et anticine-A (A; 10 M) sont injectés pour déterminer mitochondriale et la respiration des cellules non activées nonmitochondrial. Enfin, PMA (100 ng / ml) est ajouté à mesurer oxydatif. B) analyse modulaire de la fonction mitochondriale et du métabolisme oxydatif sont calculées par les différences dans les taux selon les indications. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:215px;"></td><td style="width:215px;"> Optimale de semis Densité </td><td style="width:215px;"> Moy. Basale OCR (pmol O 2 / min) </td><td style="width:215px;"> Moy. Oxydatif OCR (pmol O 2 / min) </td><td style="width:215px;"> Moy. protéines (g) / puits </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;"> Monocytes </td><td> 250k cellules / puits </td><td> 83,9 (± 13,0) </td><td> 300,3 (± 58,8) </td><td> 19,0 (± 2,4) </td></tr><tr height="40"><td height="40"style = &quot;height: 40px;&quot;&gt; neutrophiles </td><td> 250k cellules / puits </td><td> 6,1 (± 2,2) </td><td> 1411,8 (± 233,3) </td><td> 20,6 (± 2,7) </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;"> Lymphocytes </td><td> 250k cellules / puits </td><td> 52,9 (± 7,7) </td><td> 15 (± 4,1) </td><td> 13.2 (± 2.1) </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;"> Plaquettes </td><td> 25 x 10 6 cellules / puits </td><td> 199,4 (± 20,3) </td><td> 24 (± 2,7) </td><td> 47,5 (± 3,1) </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Paramètres normaux pour le dosage XF24: La basales moyenne (Tarif 3) et burst oxydatif (Taux 7) OCR pas corrigé vers OCR nonmitochondrial ou protéines sont présentés par type de cellule plaqué aux densités cellulaires indiqués. La teneur moyenne en protéines par puits est représenté comme effectuée par un dosage DC Lowry. Ces données représentent les valeurs moyennes des6-8 donneurs sains avec parenthèses contenant ± SEM. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="4" /></colgroup><tbody><tr height="66"><td> Étape </td><td> Problème </td><td> Raison possible </td><td> Solution </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.2 </td><td style="width:199px;"> plasma clair </td><td style="width:199px;"> plaquettes granulés lors de la centrifugation </td><td style="width:199px;"> diminuer le temps de centrifugation de 10 min ou lente à 400 xg </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"></td><td style="width:199px;"> plasma laiteux </td><td style="width:199px;"> excès de lipides </td><td style="width:199px;"> éviter collection postprandiale </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.6 </td><td style="width:199px;"> bandes de cellules incomplètes formées </td><td style="width:199px;"> lutinpréparation de gradient cordier, réactif froid </td><td style="width:199px;"> éviter de perturber gradient pendant le pipetage, l&#39;utilisation de la température ambiante réactif </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"></td><td style="width:199px;"> touffes dans les bandes cellulaires </td><td style="width:199px;"> coagulation du sang peut avoir eu lieu </td><td style="width:199px;"> Prélever le sang des anticoagulants tels que ACD ou EDTA </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.10 </td><td style="width:199px;"> aucun culot cellulaire </td><td style="width:199px;"> voir l&#39;étape 1.6 </td><td style="width:199px;"> Si brumeux surnageant voir ci-dessous </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"></td><td style="width:199px;"> surnageant trouble </td><td style="width:199px;"> Contamination de gradient de Ficoll lourd, la contamination des plaquettes </td><td style="width:199px;"> Augmenter la vitesse de centrifugation à 900 xg, diluth avec plus RPMI </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.16, 1.17 </td><td style="width:199px;"> faible rendement de leucocytes </td><td style="width:199px;"> contamination RBC lourd, pas assez de sang total, de la coagulation </td><td style="width:199px;"> Double anticorps et RPMI-BSA volumes, de recueillir plus de sang, ajouter anticoagulant </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.19 </td><td style="width:199px;"> l&#39;agrégation plaquettaire </td><td style="width:199px;"> PGI 2 omis, l&#39;exposition aux médias froid, stockage prolongé dans le plasma </td><td style="width:199px;"> ajouter PGI 2 à tampon de lavage des plaquettes, des réactifs de température utilisation de la chambre </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.20 </td><td style="width:199px;"> faible numération plaquettaire </td><td style="width:199px;"> pertes lors de la centrifugation primaire, l&#39;agrégation plaquettaire </td><td style="width:199px;"> Voirétapes 1.2 et 1.19 </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 2.3 </td><td style="width:199px;"> Contamination RBC </td><td style="width:199px;"></td><td style="width:199px;"> Répétez MACS séparation </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Leucocytes et plaquettes isolement dépannage. Le tableau répertorie les problèmes courants rencontrés lors de leucocytes et plaquettes isolement des cellules du sang et des solutions qui peuvent guider les utilisateurs à travers le processus de dépannage ensemble.

leucocytes du sang et de plaquettes peuvent être utilisé comme un marqueur de la santé bioénergétique globale d&#39;un individu et ainsi avoir la possibilité de surveiller les processus pathologiques et l&#39;impact des traitements. Nous décrivons ici un procédé pour isoler et mesurer la fonction mitochondriale et de la poussée oxydative dans ces cellules.

Bioénergétique et les oxydatif: Protocoles pour l&#39;isolement et l&#39;évaluation des leucocytes humains et plaquettes

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Dans le protocole suivant, la mesure des profils bioénergétiques et des réponses de l'explosion oxydative des monocytes, lymphocytes, neutrophiles et plaquettes sanguins humains sera démontrée. Cela est réalisé en premier lieu en prélevant les fractions de culot buffy et de plasma riche en plaquettes à partir de sang fraîchement prélevé. Dans un deuxième temps, la population hétérogène des globules blancs est séparée en couches de cellules mononucléées et polynucléées par gradient de densité.Ensuite, les populations pures de monocytes, de neutrophiles et de lymphocytes sont davantage isolées par séparation maximale, puis mises en culture pour une analyse du flux extracellulaire ou une analyse XF. En fin de compte, la mesure sensible et reproductible de la fonction mitochondriale dans les monocytes, les lymphocytes et les plaquettes, ainsi que celle du burst oxydatif des taux de consommation d'oxygène des monocytes et des neutrophiles, peut être réalisée à l'aide de la technologie XF. L'avantage de la technique que nous allons vous présenter aujourd'hui est que vous pouvez préparer, à partir d'un petit échantillon sanguin, l'ensemble des principales cellules présentes dans le sang du patient.Il s'agit de plaquettes et de leucocytes sous une forme inactivée pure, dont on mesure la fonction mitochondriale. Nous pensons que cela peut refléter en temps réel diverses maladies et états pathologiques chez le patient. Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions essentielles concernant le métabolisme, telles que le rôle du mode de vie, de l'alimentation et du stress pathologique sur la fonction mitochondriale.Ce protocole combine plusieurs technologies pour l'isolement et la détermination de la bioénergétique cellulaire dans diverses populations de leucocytes et dans les plaquettes. Cette étape du protocole est très critique, car la séparation par gradient de densité et la séparation magnétique exigent un pipetage précis. En outre, vous devez savoir où se trouvent les populations cellulaires durant la fractionnation.Nous allons démontrer l'isolement des cellules sanguines périphériques et l'analyse de la bioénergétique cellulaire à l'aide d'un analyseur de flux extracellulaire à 24 puits ou du XF 24. Toutefois, cette méthode peut également être réalisée sur le XF 96. Au moins deux heures avant de commencer la procédure, hydratez les sondes de la cartouche XF avec la solution XF cran.Ensuite, centrifuger le sang total fraîchement prélevé pendant 15 minutes à 500 × g et à température ambiante dans une centrifugeuse équipée d'un rotor à godets oscillants. Utiliser une pipette de transfert pour éliminer la couche supérieure contenant le plasma riche en plaquettes, en laissant un centimètre de plasma au-dessus de la couche de buffy coat des érythrocytes, puis mettre le plasma de côté à température ambiante pour un traitement ultérieur. Ensuite, transférer le buffy coat dans un tube conique stérile de 50 millilitres et diluer les globules blancs à 24 millilitres.Avec le RPMI basal, ajoutez trois millilitres de densité faible, de son opacité 1,077 à chacun des trois tubes coniques de 15 millilitres. Ensuite, placez la pointe d'une pipette étroite de cinq millilitres au fond de chaque tube. Puis, relâchez successivement et lentement trois millilitres de densité élevée, de son opacité 1,119. Utilisez maintenant une pipette automatique sur le réglage de faible puissance pour ajouter soigneusement huit millilitres de sang dilué à chaque gradient sans perturber les couches. Un colorant bleu a été ajouté au gradient de faible densité afin de visualiser toutes les couches du gradient. Après séparation des cellules par centrifugation séparée, récupérez les cellules mononucléées et les cellules polymorphonucléées à l’aide de pipettes en verre stériles sans perturber les autres bandes cellulaires.Regroupez les populations de cellules mononucléées et polynucléées de chaque tube dans des tubes coniques stériles de 50 millilitres séparés pour chaque type cellulaire, puis ajoutez quatre volumes de RPMI dans les deux tubes. Après centrifugation, transférez les culots dans un tube de 1,5 millilitre, re-centrifugez et resuspendez-les dans 80 microlitres de RPMI frais supplémenté en BSA. Ajoutez ensuite 20 microlitres d'anticorps marqués avec des billes magnétiques anti-CD14 et anti-CD15 respectivement aux fractions de cellules mononucléées et polynucléées.Incuber chaque suspension cellulaire pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, puis laver chaque tube avec un millilitre de milieu R-P-M-I-B-S-A et resuspendre les culots dans 500 microlitres de R-P-M-I-B-S-A. Appliquer ensuite les suspensions cellulaires sur des colonnes LS individuelles préalablement lavées avec du R-P-M-I-B-S-A, et laver chaque colonne trois fois avec trois millilitres de milieu R-P-M-I-B-S-A. Recueillir les fractions percolées des suspensions cellulaires ainsi que les lavages des colonnes dans des tubes stériles afin d'isoler les monocytes et les neutrophiles. Retirer les colonnes du champ magnétique après le dernier lavage, puis éluer les cellules sélectionnées positivement dans un tube stérile à l’aide de cinq millilitres de R-P-M-I-B-S-A. Pour isoler les lymphocytes, centrifuger la fraction percolée du lavage de la colonne cellulaire, resuspendre le culot cellulaire dans 80 microlitres de R-P-M-I-B-S-A, puis incuber les cellules avec 20 microlitres d’anticorps dirigés contre CD 61 et CD 2 35 A pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Ensuite, répéter la séparation maximale comme précédemment, et recueillir l'écoulement contenant les lymphocytes afin d'isoler les plaquettes, centrifuger, puis le plasma riche en plaquettes conservé, et ensuite éliminer le plasma et laver le culot cellulaire une fois avec cinq millilitres de PBS stérile supplémenté avec un microgramme par millilitre de prostaglandine I deux, resuspendre le culot de plaquettes dans un millilitre de tampon PBS frais contenant de la prostaglandine I deux, afin de plaquer les monocytes, lymphocytes, neutrophiles et plaquettes isolés. Compter d'abord les cellules et les ajuster à un volume approprié dans le milieu d'essai XF pour obtenir une densité d'ensemencement de 2,5 × 10⁵ cellules par puits dans un volume de 200 microlitres. Dans une microplaque de culture cellulaire XF à 24 puits revêtue de Cell-T pour les plaquettes, semer 2,5 × 10⁷ cellules par puits dans un volume de 200 microlitres.Après avoir centrifugé les cellules dans la plaque, ajuster le volume final des puits à 660 microlitres avec le milieu XF et incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avant le test XF. Pendant cette période d'incubation, charger 75 microlitres des réactifs du test, dans l'ordre indiqué, dans les orifices d'injection de la cartouche de capteurs XF. Si des mesures de production oxydative doivent être effectuées, le PMA peut être injecté après l'antimycine, dans un orifice d'injection suivant. Placer ensuite la cartouche sur l'analyseur de flux extracellulaire pour démarrer le test. Les profils bioénergétiques des leucocytes et des plaquettes peuvent être déterminés à l'aide de l'analyseur de flux extracellulaire Seahorse XF, qui mesure de manière non invasive la consommation d'oxygène en temps réel dans les cellules.Chaque type de cellule est ensemencé dans la microplaque XF 24 avec cinq réplicats, comme vient de l'être illustré dans le tableau. Des valeurs représentatives du taux basal et du pic oxydatif mesurées au cours du test, ainsi que les concentrations moyennes de protéines par puits, sont présentées selon le type cellulaire. Les valeurs du taux de consommation d'oxygène sont normalisées par rapport à la teneur totale en protéines des puits correspondants et exprimées en picomoles par minute par microgramme de protéine. Le taux basal de consommation d'oxygène est ensuite déterminé à partir des trois premières mesures.L'oligomycine, un inhibiteur de la ATP synthase mitochondriale, est injectée dans le milieu XF afin d'estimer la vitesse de consommation d'oxygène couplée à la synthèse de ATP, et est représentée comme étant liée au ATP. La vitesse résiduelle de consommation d'oxygène, après soustraction de la consommation d'oxygène non mitochondriale, peut être attribuée à une fuite de protons. L'ajout de l'agent désaccouplant FCCP permet de déterminer la vitesse maximale de consommation d'oxygène, suivie par l'injection d'antimycine A, un inhibiteur de la respiration mitochondriale, afin de mesurer les sources non mitochondriales de consommation d'oxygène. La capacité de réserve correspond à la quantité de travail supplémentaire que les mitochondries peuvent effectuer en cas de demande énergétique accrue, et peut être calculée comme la différence entre la vitesse maximale de respiration et la vitesse basale, afin de déterminer la capacité de production d'explosion oxydative des monocytes et des neutrophiles.L'agoniste P-M-A-A-P-K-C est injecté et l'augmentation du taux de consommation d'oxygène est liée à la production d'oxydants par la N-A-D-P-H oxydase. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en aussi peu que trois heures suivant le prélèvement sanguin, sans inclure le dosage lui-même s'il est effectué correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de maintenir des conditions stériles en effectuant chaque étape dans une hotte de sécurité biologique et en utilisant des tampons et des milieux stériles à température ambiante. Après cette procédure, nous pouvons réaliser d'autres protocoles, tels que l'analyse par cytométrie en flux pour déterminer la pureté des cellules, l'état d'activation des leucocytes, ainsi que pour évaluer la bioénergétique cellulaire dans les sous-populations de leucocytes.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez maintenant avoir une idée assez claire de la manière de préparer les plaquettes, les lymphocytes, les monocytes et les neutrophiles, de les introduire dans le Seahorse et de mesurer l'explosion oxydative et la fonction mitochondriale à partir de ces données. Vous pourrez ensuite analyser vos populations de patients et déterminer comment leur bioénergétique évolue en temps réel. N'oubliez pas que le travail avec des échantillons humains provenant de patients peut être extrêmement dangereux.Par conséquent, vous devez porter des équipements de protection individuelle et utiliser une hotte de sécurité biologique pendant cette procédure.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo montre le test permettant de confirmer l’activité phagocytaire des cellules du sang humain via la cytométrie en flux. Les granulocytes et les monocytes confirment leur activité phagocytaire en montrant une fluorescence verte et rouge, confirmant respectivement la présence de bactéries englouties et l’activité d’explosion oxydative.

Un test pour évaluer la phagocytose et l’activité de sursaut oxydatif dans les granulocytes et les monocytes

Ici , nous montrons les plaquettes humaines isolées peuvent être utilisées comme accessibles modèle ex vivo pour étudier les adaptations métaboliques en réponse au complexe I inhibiteur de la roténone. Cette approche utilise le traçage isotopique et la quantification relative par spectrométrie de masse Chromatographie en phase liquide, et peut être appliquée à une variété de modèles d'étude.

LC-MS Analyse des plaquettes humaines en tant que plate-forme pour l&#39;étude du métabolisme mitochondrial

Le but de ce manuscrit est de présenter une méthode de mesure de la phagocytose des monocytes et des granulocytes et de l’activité oxydative dans des échantillons de sang humain.

Mesure de granulocytes et de monocytes phagocytose et oxydative Activité Burst dans le sang humain

L’étude du métabolisme devient de plus en plus pertinente pour la recherche immunologique. Ici, nous présentons une méthode optimisée pour mesurer la glycolyse et la respiration mitochondriale dans les splénocytes de souris et les lymphocytes T et B.

Un protocole optimisé pour l&#39;analyse glycolyse et mitochondrial Respiration dans Lymphocytes

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des cellules leucémiques de leucémie patients la moelle osseuse et l’analyse de leur état métabolique. Évaluation du profil métabolique des cellules leucémiques primaires pourrait aider à mieux caractériser la demande des cellules primaires et pourrait mener à une médecine plus personnalisée.

Évaluation du profil métabolique des cellules leucémiques primaires

Nous décrivons des protocoles par étapes mesurant la respiration mitochondriale des neutrophiles de souris et humaines et des cellules HL60 à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire métabolique.

Mesure en temps réel du profil bioénergétique mitochondrial des neutrophiles

Ce protocole comprend un ensemble de tests fonctionnels des neutrophiles à utiliser comme méthode de criblage pour couvrir les fonctions de différentes voies de signalisation. Le protocole comprend une évaluation initiale et simple de la viabilité cellulaire, de la pureté, de la production d’espèces réactives de l’oxygène, de la migration en temps réel, de la phagocytose et d’une suggestion préliminaire de pièges extracellulaires à neutrophiles.

Un ensemble de techniques de dépistage pour un aperçu rapide de la fonction des neutrophiles

Les cellules mononucléées isolées du sang périphérique peuvent être utilisées pour l’analyse des fonctions et des troubles immunitaires, des maladies métaboliques ou des fonctions mitochondriales. Dans ce travail, nous décrivons une méthode standardisée pour la préparation de PBMC à partir de sang total et la cryoconservation ultérieure. La cryoconservation rend ce temps et ce lieu indépendants.

Cryoconservation et évaluation bioénergétique des cellules mononucléées du sang périphérique humain

La génération d’anions superoxydes est essentielle pour la stimulation des plaquettes et, si elle est dérégulée, critique pour les maladies thrombotiques. Nous présentons ici trois protocoles pour la détection sélective des anions superoxyde et l’étude de la régulation plaquettaire dépendante de l’oxydoréduction.

Méthodes alternatives pour la détection de la génération d’anions superoxyde dans les plaquettes 

L’abus d’alcool altère l’immunité des macrophages alvéolaires (MA) en raison de la suppression de la respiration mitochondriale et de la bioénergétique. Nous avons récemment démontré que l’exposition à l’éthanol (EtOH) augmente la dépendance à la glutamine pour la respiration mitochondriale dans les MA. Dans le présent document, des méthodes sont fournies pour déterminer l’utilisation de la glutamine pour la respiration mitochondriale dans les MA traités à l’EtOH à l’aide d’un bioanalyseur de...

Évaluation de la glutamine comme source de carburant pour les macrophages alvéolaires exposés à l’éthanol chronique à l’aide d’un bioanalyseur de flux extracellulaire

Le métabolisme plaquettaire est intéressant, en particulier en ce qui concerne le rôle de l’hyperactivité et de l’hypoactivité plaquettaires dans les saignements et les troubles thrombotiques. L’isolement des plaquettes du plasma est nécessaire pour certains tests métaboliques ; Voici une méthode d’isolement des métabolites intracellulaires à partir de plaquettes lavées.

Préparation de plaquettes humaines lavées pour des études quantitatives de flux métaboliques

Apprenez à isoler et évaluer la fonction mitochondriale et la réponse oxydative des leucocytes et plaquettes humains. Cette méthode permet de surveiller la santé bioénergétique et les processus pathologiques en temps réel.

Bioénergétique et les oxydatif: Protocoles pour l'isolement et l'évaluation des leucocytes humains et plaquettes

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