Mesure longitudinale de la matrice extracellulaire rigidité de tumeur modèles 3D utilisant Microrhéologie de particules de suivi

L'objectif général de cette procédure est de mesurer les modifications longitudinales des propriétés mécaniques de la matrice extracellulaire dans des modèles tridimensionnels de cancer. Cela est réalisé en récoltant d'abord des cellules cancéreuses et en cultivant le stéroïde tumoral par une méthode appropriée jusqu'à ce qu'il atteigne la taille souhaitée. La deuxième étape consiste à incorporer le stéroïde tumoral dans du collagène ou une autre matrice extracellulaire appropriée.

Ensuite, la grille de points d'échantillonnage est construite et une vidéo est enregistrée à chaque point. La dernière étape consiste à analyser les données vidéo et à calculer ainsi qu'à coregistrer les propriétés logiques réelles à chaque point spatial. En définitive, ce protocole utilise l'analyse des trajectoires des sondes traceuses pour quantifier longitudinalement les changements spatiaux des propriétés mécaniques de la matrice extracellulaire de manière non destructive.

L'idée est que, en associant des mesures d'imagerie basées sur la radiologie de la matrice extracellulaire à des modèles tumoraux tridimensionnels in vitro qui restaurent les interactions avec la matrice extracellulaire, cette approche peut fournir un aperçu quantitatif des changements dépendant du temps dans le microenvironnement mécanique associé aux processus de croissance et d'invasion tumorales, ainsi qu'à la réponse au traitement. La méthode présentée dans cette vidéo utilise une approche de superposition d'aros pour générer des OIDs tridimensionnels non adhérents à partir de la lignée cellulaire cancéreuse pancréatique bien établie pan one. Pour commencer, mélangez 10 millilitres d'eau de qualité pour culture cellulaire avec 0,1 gramme d'aros afin d'obtenir une solution d'aros à 1 %.

Chauffer la solution d'aros à plus de 70 degrés Celsius avant l'aliquote. Distribuer 40 microlitres de la solution dans chaque puits d'une plaque de 96 puits, puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure. Récolter les cellules cancéreuses par trypsine et préparer une suspension monocellulaire, puis diluer la suspension cellulaire à 1000 cellules par millilitre. Ajouter 100 microlitres de cette dilution dans le puits contenant le lit d'aros polymérisé.

Placer l'échantillon sur un agitateur pendant la nuit dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius et 5 %CO2 après l'incubation. Retirer l'échantillon de l'agitateur et ajouter 100 microlitres de milieu de culture cellulaire, puis procéder à l'incubation du stéroïde obtenu jusqu'à ce que le diamètre souhaité soit atteint. Par exemple, après neuf jours, une stéroïde en forme de plaque atteindra environ 450 microns de diamètre.

Pour commencer, préparez un poste de travail à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire avec deux vials de deux millilitres. Le vial un contiendra le stéroïde tumoral et le vial deux servira de témoin sans cellules. Préparez un mélange dilué de sondes traceuses fluorescentes modifiées au carboxylate, de diamètre un micron, en ajoutant deux parts de la solution mère de sondes à 25 parts d’eau stérile.

Retirer un flacon de collagène bovin à 3,1 milligrammes par millilitre du réfrigérateur et le placer sur de la glace. Prélever 125 microlitres de collagène, puis ajouter 50 microlitres de solution de sonde traceuse diluée dans le flacon un. Vortexer brièvement pour répartir les sondes. Ajouter ensuite 235 microlitres de milieu de culture cellulaire approprié contenant du rouge de phénol, pour un volume total de 410 microlitres, et vortexer brièvement avant de prélever 205 microlitres et de les transférer dans le flacon deux. Ajouter ensuite environ deux microlitres d'hydroxyde de sodium à un molaire dans le flacon.

Un pour ramener la solution à un pH neutre, vortexer brièvement afin de mélanger. Puis, replacer immédiatement sur la glace afin que le mélange ne commence pas à polymériser. Retirer délicatement 40 microlitres de milieu du puits contenant le stéroïde tumoral.

Conserver ces 40 microlitres pendant l'exécution de l'étape suivante. Vérifier le puits pour s'assurer que le stéroïde a été éliminé à l'étape précédente. Dans l'affirmative, remettre les 40 microlitres dans le puits et répéter l'étape précédente.

S’il l’était, ajouter les 40 microlitres contenant le stéroïde au flacon. Agiter doucement le flacon 1 avant de transférer le mélange en portions de 60 microlitres dans trois puits distincts d’une plaque 96 puits. Examiner chaque puits au microscope après avoir ajouté le mélange afin de déterminer quel puits contient le stéroïde. Ensuite, ajouter environ deux microlitres d’hydroxyde de sodium à une molaire et 40 microlitres de milieu de culture cellulaire au flacon 2, puis vortexer avant Ali.

Prélevez 60 microlitres de ce mélange dans un puits vide de la plaque 96 puits et étiquetez-le comme témoin sans cellules. Placez la plaque dans une étuve à 37 degrés Celsius pour la polymériser pendant au moins une heure afin de constituer une grille de points d'échantillonnage. Transférez d'abord la plaque d'échantillons de l'étuve sur la platine du microscope.

Laisser 10 minutes pour que l'échantillon atteigne l'équilibre à température ambiante s'il n'y a pas de plateau chauffant disponible. Observer l'échantillon avec des objectifs à faible grossissement pour s'assurer qu'il est intact et prêt pour l'acquisition d'images. Déterminer la position de la tumeur dans le puits et documenter cela par une image en lumière transmise afin d'assurer par la suite une co-localisation spatiale.

Typiquement, 20 points d'échantillonnage dans chaque puits, répartis en anneaux concentriques autour du sphéroïde S, produiront des résultats suffisamment détaillés. Déplacez la platine vers chaque position souhaitée et utilisez le logiciel d'interface du microscope pour enregistrer les coordonnées XNY. Passez le microscope à un objectif à fort grossissement et sélectionnez le cube de filtres approprié pour la longueur d'onde d'excitation des sondes traceuses.

À l'aide de la liste des points créés, se déplacer vers le premier point de la grille. Ajuster la mise au point pour trouver le fond du puits avant de remonter. Rechercher un champ de vision contenant plusieurs sondes traceuses nettes.

Observer l'histogramme d'intensité et régler l'intensité d'exposition et la durée afin d'obtenir la plage dynamique maximale possible, tout en s'assurant que l'image ne devienne pas saturée. Acquérir une séquence vidéo à une fréquence d'acquisition de 20 à 30 millisecondes par image, et enregistrer avec une convention de nommage appropriée. Pendant l'enregistrement, ne pas toucher au microscope ni à la table.

Répétez l’enregistrement pour chaque point d’échantillonnage de la grille. Ensuite, procédez à la répétition du processus afin de construire une grille pour chaque puits de l’expérience, et répétez l’ensemble du processus pour chaque point temporel au cours du suivi longitudinal.

Pour commencer l'analyse des données, copiez toutes les données vidéo dans un dossier d'analyse. Importez les données d'image dans MATLAB ou un autre logiciel d'analyse.

Étalonner le logiciel en analysant plusieurs images de la vidéo afin de déterminer correctement les paramètres de sélection et de rejet pour identifier les positions centrales de la sonde. Ensuite, utiliser le logiciel pour déterminer automatiquement la position de chaque sonde dans toutes les images de la vidéo, puis relier ces positions en trajectoires. Utiliser les données de trajectoire pour calculer le déplacement quadratique moyen ou MSD en fonction du temps de retard, en veillant à appliquer le facteur d'étalonnage spatial approprié pour l'objectif utilisé ou pour tout pixel benning.

Calculez G Star à l'aide de la relation généralisée de Stokes-Einstein, en tenant compte des limites d'application de cette relation pour un échantillon particulier. Répétez les étapes d'analyse pour chaque champ de vision de l'expérience. Superposez les données de position avec le module viscoélastique I à une fréquence d'intérêt spécifique, selon le fabricant du microscope utilisé.

Cette étape peut être facilitée par une routine personnalisée, qui lit les métadonnées du microscope, ou les données de position peuvent être consignées manuellement. Des séquences vidéo sont acquises à plusieurs positions spatiales au sein d'un puits représentatif contenant un nodules tumoral tridimensionnel et sont associées afin de fournir une carte micro-radiologique spatiale de l'échantillon lorsqu'on suit longitudinalement les populations cellulaires situées à la périphérie du plateau. Un des stéroïdes utilisé dans cet exemple dégradera spontanément les fibres de collagène environnantes et envahira la matrice extracellulaire en quelques jours.

Dans cet exemple, la co-localisation en microscopie fournit une mesure quantitative de l'invasion évidente dans la matrice se produisant à gauche, mais pas à droite du stéroïde. Le suivi longitudinal de ces régions spatiales distinctes montre une diminution d'environ quatre ordres de grandeur de la composante réelle du module de cisaillement viscoélastique complexe, concomitante à l'invasion. L'ensemble des données dépendantes de la fréquence est présenté, mettant en contraste les propriétés rhéologiques du matériau dans la région un et la région deux au quatrième jour.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit qu'il faut éviter soigneusement les écueils courants lors de l'analyse des trajectoires des sondes, écueils pouvant conduire à des conclusions inappropriées. Nous encourageons les lecteurs à consulter la littérature sur les MTP citée ici, qui aborde des aspects tels que la dérive de l'échantillon et l'interprétation de l'hétérogénéité. Cette procédure peut être combinée à des analyses longitudinales ou terminales supplémentaires par imagerie de fluorescence afin de répondre à d'autres questions, comme la manière dont le remodelage mécanique est corrélé à des événements clés de signalisation ou à la réponse cytotoxique à une intervention.