Name: Mesure longitudinale de la matrice extracellulaire rigidité de tumeur modèles 3D utilisant Microrhéologie de particules de suivi (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Apprenez la microrhéologie de particules de suivi pour mesurer la rigidité de la matrice extracellulaire dans les modèles tumoraux 3D. Cette méthode non destructive permet d'analyser l'évolution mécanique des tumeurs.

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Nous tenons à remercier le partage open-source d&#39;un code de traces de particules MATLAB fournies par Maria Kilfoil ( <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> ), avec le code précédent IDL et une documentation détaillée fournie par John C. Crocker et Eric Semaines R.. Ce travail a été rendu possible grâce au financement de l&#39;Institut national du cancer (NCI / NIH), K99CA155045 et R00CA155045 (PI: CPM).

1. Sphéroïdes La culture de la tumeur <ol><li> Mélanger 10 ml de l&#39;eau de qualité culture cellulaire avec 0,1 g d&#39;agarose pour obtenir une solution d&#39;agarose à 1%. </li><li> solution d&#39;agarose à la chaleur au-dessus de 70 ° C (plus ou moins 14 secondes dans un four micro-ondes standard ou à l&#39;aide d&#39;une plaque chauffante) avant aliquotage 40 ul de solution d&#39;agarose dans un puits d&#39;une plaque à 96 puits. </li><li> Incuber la plaque à 37 ° C pendant au moins 1 heure tandis que la récolte de cellules en utilisant des techniques standard. </li><li> Utiliser un hématimètre pour déterminer la concentration de cellules dans la suspension. </li><li> Diluer la suspension cellulaire à 1.000 cellules / ml et ajouter 100 ul de cette dilution au puits contenant le lit d&#39;agarose durci. </li><li> Placer l&#39;échantillon sur un agitateur pendant une nuit dans un incubateur réglé à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Enlever le modèle de secoueur et ajouter 100 ul de milieu de culture cellulaire. </li><li> Incuber jusqu&#39;à ce que des sphéroïdes de diamètre désiré soit atteint. Par exemple, après 9 jours, un spHeroid aura environ 450 m de diamètre. Pendant ce temps, un milieu de croissance frais peut être ajouté dans les puits d&#39;aspiration mais doit être évitée car cela se traduira par la suppression de la sphéroïde. </li></ol> 2. Préparation Sphéroïdes tumorales 3D embarqués dans ECM <ol><li> Préparer une station de travail avec les matériaux nécessaires à l&#39;intérieur d&#39;une hotte à flux laminaire. </li><li> Préparer un mélange dilué de 1 um de diamètre sondes fluorescentes traceurs carboxylate modifié par l&#39;ajout de sondes 2 pièces en stock (2% de solides) pour 25 parties d&#39;eau stérile. </li><li> Retirer une bouteille de 3,1 mg / ml de collagène bovin du réfrigérateur et placez-le sur la glace. </li><li> Aliquote de 125 ul de collagène dans un vide flacon de 2 ml. </li><li> Ajouter 50 pi de solution diluée de la sonde de traceur dans le flacon contenant le collagène et vortex brièvement pour distribuer des sondes. </li><li> Ajouter 235 ul de milieu de culture cellulaire approprié contenant du phénol rouge (qui devient jaune) pour un volume total de 410 ml et vortex brièvement avant de retirer 205 ml (demi le volume total) et le placer dans un nouveau flacon ml 2. Une fiole contiendra le sphéroïde de tumeur et Vial 2 sera un mélange de commande. </li><li> Ajouter ~ 2 pi de NaOH 1 M au flacon 1 pour amener la solution revenir à pH neutre (milieu de culture contenant du phénol rouge devraient revenir à rouge). Notez que cela va provoquer le mélange de commencer guérir si elle n&#39;est pas conservé dans la glace. brièvement Vortex à mélanger, puis retour au bac de glace immédiatement. NOTE: Le sphéroïde est à peine visible à l&#39;œil nu après 9 jours de culture et son retrait de la chambre d&#39;agarose est une tâche délicate. Utilisation d&#39;un microscope de dissection peut être utile pour certains utilisateurs. Le maintien de l&#39;intégrité du sphéroïde pendant le transfert est primordiale. </li><li> En utilisant une pointe de pipette à large ouverture, retirez délicatement 40 pi de milieu du puits contenant de l&#39;ellipsoïde de la tumeur. Conservez ce 40 pi tout en effectuant l&#39;étape suivante. </li><li> Vérifiez le bien afin de voir si le sphéroïdea été enlevé à l&#39;étape précédente. S&#39;il l&#39;était, ajouter 40 ul contenant le sphéroïde au flacon 1. Sinon, placez les 40 pi dans le puits et répétez l&#39;étape précédente. </li><li> Incorporer délicatement 1 Vial (ne pas risquer de vortex, il peut endommager le sphéroïde) avant de transférer le mélange dans 60 parties de pi en trois puits séparés d&#39;une plaque de 96 puits. Inspecter chaque puits avec un microscope après l&#39;ajout de mélange pour déterminer qui contient bien le sphéroïde. </li><li> Ajouter ~ 2 ul de NaOH 1 M et 40 ul de milieu de culture cellulaire dans le flacon 2 et vortex avant aliquotage 60 ul de ce mélange dans un puits vide dans la plaque à 96 puits et l&#39;étiquetage comme témoin. </li><li> Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pour durcir pendant au moins 1 heure. </li></ol> 3. Construire la grille de points d&#39;échantillonnage et prenez une vidéo à chaque point dans <ol><li> Transférer la plaque de l&#39;échantillon de l&#39;incubateur de la platine du microscope. Laisser 10 minutes pour que l&#39;échantillon EQUILibrate à la température ambiante si une platine chauffante n&#39;est pas disponible. </li><li> Observer l&#39;échantillon avec de faibles lentilles de l&#39;objectif motorisés pour s&#39;assurer qu&#39;il est intact et prêt pour l&#39;imagerie. Déterminer la position de la tumeur à l&#39;intérieur du puits. </li><li> Décidez du nombre de points d&#39;échantillonnage à prendre. En général, 20 points d&#39;échantillonnage dans chaque puits, répartis en anneaux concentriques autour du sphéroïde produiront des résultats suffisamment détaillés. </li><li> Déplacez le stade à chaque position souhaitée et utiliser un logiciel de microscope interface pour enregistrer les coordonnées x et y (ou enregistrer les coordonnées manuellement si l&#39;interface du logiciel n&#39;est pas disponible). </li><li> Mettez le microscope à un objectif de haute puissance (typiquement 100X), et sélectionnez le cube de filtre approprié pour la longueur d&#39;onde d&#39;excitation des sondes de traceurs. Utilisez la liste des points créés à l&#39;étape 3.4 pour passer au premier point de la grille. </li><li> Ajustez la mise au point de trouver le fond du puits, puis déplacez-vous de trouver un champ de vision (FOV) contenant plusieurs trac de mise au pointer sondes. </li><li> Observer l&#39;histogramme de l&#39;intensité et de régler l&#39;intensité et la durée d&#39;exposition pour donner la plus grande gamme dynamique possible, tout en veillant à ce que l&#39;image ne soit pas saturé. </li><li> Obtenir une séquence vidéo à un taux de 20-30 ms par trame de cadre (environ 800 cadres ou 16-24 sec de longueur est recommandé de fournir des statistiques suffisantes pour le calcul MSD robuste en équilibre avec la nécessité de réduire au minimum le temps d&#39;acquisition à chaque point de la grille spatiale) et enregistrer avec une convention appropriée. Pendant l&#39;enregistrement, ne touchez pas le microscope ou une table. </li><li> Répéter les étapes 3.6 à 3.9 pour chaque point dans la grille de l&#39;échantillon. </li><li> Répétez les étapes 3.3 à 3.10 pour chaque bien dans l&#39;expérience. </li></ol> 4. Analyser les données vidéo à Calculer Propriétés rhéologiques à chaque point dans l&#39;échantillon <ol><li> Copiez toutes les données vidéo dans un dossier d&#39;analyse (éventuellement sur un autre ordinateur). </li><li> données d&#39;image à l&#39;importation dans MATLAB ou d&#39;autres logiciels d&#39;analyse. NOTE: documentation détaillée concernant l&#39;ensemble des routines MATLAB particules de suivi adoptées ici est disponible à <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil</a> . L&#39;utilisation d&#39;une fonction d&#39;appel personnalisée pour le traitement de plusieurs fichiers à des positions différentes automatisation est recommandé. </li><li> Calibrer le logiciel par l&#39;analyse de plusieurs images de la vidéo afin de déterminer de manière appropriée sélection et de rejet paramètres (taille, passe-bande, etc) pour identifier les positions du centre de la sonde. Vaste expérience de ces étapes cruciales est décrit par Crocker et Grier. </li><li> Utilisez le logiciel pour déterminer automatiquement à chaque position de la sonde pour toutes les images de la vidéo, puis relier ces positions dans les trajectoires. </li><li> Utilisez les données de trajectoire pour calculer la moyenne carré déplacement (TMS) en fonction du temps de latence, en étant sûr d&#39;appliquer le facteur de calibration spatiale appropriée (um par pixel) pour l&#39;objectif spécifique, toute catégorisation de pixels, etc (généralement effectuédans les méta-données). </li><li> Calculer G * (en utilisant la relation généralisée de Stokes-Einstein pris en considération les limites d&#39;application de GSER pour un échantillon particulier 24,28,43. Alternativement, les utilisateurs peuvent souhaiter interpréter propriétés ECM directement à partir de MSD en comparant simplement la loi de puissance mise à l&#39;échelle, plateau valeurs, indices d&#39;hétérogénéité ou d&#39;autres paramètres. </li><li> Répétez les étapes 4.2 à 4.6 pour chaque fov dans l&#39;expérience. </li><li> Co-enregistrer les données de position de l&#39;étape 3.4 avec modulii viscoélastiques à une fréquence d&#39;intérêt particulier. Selon le fabricant du microscope utilisé, cette étape peut être facilitée par une routine personnalisée qui lit les métadonnées de microscope ou de la position des données peuvent être compilées manuellement. </li><li> Utiliser des fonctions d&#39;interpolation 3D pour générer une carte de la rhéologie spatiale de l&#39;ECM. </li></ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Dans ce protocole, nous introduisons une stratégie robuste et largement applicable pour le suivi longitudinal des changements locaux dans ECM rigidité dans des modèles de tumeurs 3D. Nous prévoyons que cette méthode pourrait être adoptée par les biologistes du cancer et biophysiciens intéressés par le comportement mécanosensible impliquée dans le remodelage matriciel pendant la croissance de la tumeur et les processus d&#39;invasion. Quantification précise de la matrice cinétique de dégradation pourrait être particulièr...

Il est clair à partir d&#39;un nombre croissant de preuves dans la littérature que les cellules cancéreuses, comme les cellules épithéliales de mammifères non malignes, sont très sensibles aux propriétés mécaniques et biophysiques de la matrice extracellulaire environnante (ECM) et d&#39;autres composants de microenvironnement 1-9. Études mécanistiques élégantes ont donné un aperçu du rôle de la rigidité extracellulaire en tant que partenaire de signalisation mécano complexe qui régit le comportement de la tumeur maligne et la morphogenèse 2,3,10,11. Ce travail a été facilité en particulier par le développement de la 3D dans des modèles de tumeurs in vitro qui restaurent biologiquement architecture tissulaire pertinents et peuvent être cultivées dans des matériaux d&#39;échafaudage mécanique accordables et imagés par microscopie optique 12-19. Cependant, de l&#39;autre côté de cette boîte de dialogue entre mechanoregulatory microenvironnement tumoral et, à travers laquelle les cellules cancéreuses, à son tour modifier la rhéologie de leur environnement, reste assezplus difficile à étudier. Par exemple, au cours des processus d&#39;invasion, les cellules à la périphérie d&#39;une tumeur peut subir une transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et augmenter l&#39;expression de métalloprotéases matricielles (MMP) qui provoquent une dégradation locale de l&#39;ECM 20 à 22, qui à son tour, influence le comportement de croissance mécanosensible d&#39; d&#39;autres cellules tumorales proximales. Grâce à une variété de processus biochimiques, les cellules cancéreuses composer continuellement la rigidité locale de son environnement de haut en bas en fonction de différents processus à des moments différents. La méthode décrite ici est motivé par le besoin d&#39;outils d&#39;analyse qui rendent compte des changements locaux dans la rigidité et la conformité de l&#39;ECM lors de la croissance, qui peuvent être intégrés aux modèles tumoraux 3D et corrélés longitudinalement par des changements biochimiques et phénotypiques sans mettre fin à la culture. A la recherche d&#39;une technique appropriée pour mettre en œuvre dans ce contexte, microrhéologie particules de suivi (PTM) apparaît comme un candidat sérieux.Ce procédé, a lancé à l&#39;origine par Mason et 23,24 Weitz, utilise le mouvement de sondes de traceurs incorporés dans un fluide complexe pour signaler le module complexe dépendant de la fréquence viscoélastique de cisaillement, G * (ω) à des échelles de longueur micron. Cette approche générale a été développé avec de multiples variantes adaptées pour différentes applications dans la matière, colloïdes, biophysique molle condensée et la physique des polymères 25-31. PTM a certains avantages par rapport à d&#39;autres méthodes, comme les lectures de viscoélasticité locale sont fournies par l&#39;imagerie vidéo non destructif de sondes de traceurs biochimiques inactifs qui sont incorporés au moment de la préparation de la culture et restent en place pendant de longues périodes de croissance. Ceci est en contraste avec les mesures de l&#39;étalon-or avec un rhéomètre à cisaillement oscillatoire vrac, ce qui nécessite obligatoirement la fin de la culture et des rapports de la rhéologie macroscopique de l&#39;échantillon en vrac plutôt que des mesures ponctuelles sein de la tumeur microenvir 3D complexeronnement. En effet, un certain nombre d&#39;études ont montré l&#39;utilité de l&#39;interprétation des mesures de mouvements de la sonde de traceur dans ou autour de cellules cancéreuses ou non-cancéreuses de mesurer des déformations associées à la migration des cellules 32, le stress mécanique induit par un sphéroïde expansion 33, rhéologie intracellulaire 34,35, et mapper les contraintes mécaniques et les déformations dans les tissus par génie 36, et la relation entre la taille des pores et la vitesse d&#39;invasion 37. D&#39;autres techniques appropriées pour microrhéologie, telles que la microscopie à force atomique (AFM) peuvent être mises en œuvre, mais surtout pour les points de palpage à la surface de l&#39;échantillon et peuvent également poser des problèmes de stérilité culture qui compliquent les mesures longitudinales 38. Ici, nous décrivons un protocole complet qui englobe les méthodes de croissance des sphéroïdes tumoraux 3D appropriés pour le transfert dans ECM avec des sondes fluorescentes intégrés pour la vidéo particules de suivi et d&#39;analyse pour la cartographie fiable spatialechangements dans microrhéologie au fil du temps dans la culture. Dans la présente application, les modèles de tumeurs 3D sont cultivées en format multi-puits en vue de leur incorporation des mesures de Microrhéologie avec d&#39;autres tests traditionnels (par exemple, cytotoxicité) qui ce format est propice à la. Dans cette illustration représentative de cette méthodologie nous culture in vitro sphéroïdes 3D en utilisant des cellules Panc-1, une lignée cellulaire de cancer pancréatique établi connus pour former des sphéroïdes 39, mais toutes les mesures décrites ici sont largement applicables à l&#39;étude des tumeurs solides en utilisant une variété de lignées cellulaires adaptés à la culture 3D. Fondés sur l&#39;imagerie parce que cette méthode est intrinsèquement il est idéal pour les co-enregistrement des données de Microrhéologie haute résolution avec de grands champs de diascopie de vue qui signalent des changements dans la croissance cellulaire, la migration et le phénotype. La mise en œuvre de PTM intégré à la microscopie lumière transmise de cette manière suppose positionnement reproductible des wh stade de microscopeich est généralement disponible sur grand champ épifluorescence commerciale microscopes biologiques motorisés. Le protocole développé ci-dessous peut être mis en oeuvre avec n&#39;importe quel fluorescence automatisé microscope biologique raisonnablement équipé. Il s&#39;agit d&#39;une méthode intensive de données en soi, ce qui nécessite l&#39;acquisition de gigaoctets de données numériques de microscopie vidéo pour le traitement hors ligne. Dans le protocole suivant, le protocole 1 se rapporte à la préparation initiale des sphéroïdes de tumeur qui est décrite ici en utilisant superposition sur agarose, mais pourrait être substitués par une variété d&#39;autres méthodes telles que la goutte suspendue 40, ou culture rotatif 41 techniques. Protocole 2 décrit le processus d&#39;intégration des sphéroïdes dans un échafaudage de collagène mais alternativement, in vitro tumeurs en 3D peuvent être cultivées par encapsulation ou l&#39;incorporation de cellules remises en suspension dans l&#39;ECM 12,15, plutôt que de sphéroïdes non adhérentes simples pré-formées. Protocoles suivants décrivent les procédures pour obtenir des mesures de Microrhéologie résolues en temps par l&#39;acquisition et le traitement des données de microscopie vidéo, respectivement. Le traitement des données est décrit en utilisant MATLAB, faisant usage de routines open source pour PTM construit sur ​​des algorithmes initialement décrite par Crocker et Grier 42, qui ont également été largement développés pour différentes plates-formes logicielles (voir http://www.physics.emory.edu/ ~ semaines / idl /).

<table><tbody><tr><td>Collagène bovin de type 1</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>354231</td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td> American <td>Type Cell Culture, Manassas, VA</td><td>CRL1469</td><td>ou autre type de cellule approprié</td></tr><tr><td>Microsphères fluorescentes</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td><td>906906</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences, Bedford, MA</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Bioréactifs, Waltham, MA</td><td>C12H18O9</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NaOH Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td><td>NC0480985</td><td></td></tr><tr><td>Plaques d’imagerie à 96 puits</td><td>Corning Inc., Corning, NY</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone, Waltham, MA</td><td>SH30243.01</td><td>ou milieu de culture cellulaire approprié</td></tr><tr><td>Microscope Zeiss AxioObsever Zeiss</td><td>, Oberkochen, Allemagne</td><td></td><td>comprend une caméra à grande vitesse et logiciel d’imagerie</td></tr><tr><td>Logiciel MATLAB</td><td>The Mathworks, Natick, MA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mesure longitudinale de la matrice extracellulaire rigidité de tumeur modèles 3d utilisant microrhéologie de particules de suivi

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Le micro-mécanique a été montré pour agir comme un régulateur essentiel du comportement de la croissance tumorale et de signalisation, qui est elle-même transformée et modifiée dans le cadre d&#39;un ensemble d&#39;interactions, dans les deux sens mécanosensibles complexes. Alors que le développement de modèles de tumeurs 3D biologiquement pertinentes ont facilité études mécanistiques sur l&#39;impact de la matrice rhéologie sur la croissance de la tumeur, le problème inverse de l&#39;évolution de la cartographie de l&#39;environnement mécanique induite par des tumeurs reste difficile. Ici, nous décrivons la mise en œuvre de microrhéologie de traces de particules (PTM) en conjonction avec des modèles 3D de cancer du pancréas dans le cadre d&#39;une approche robuste et viable pour le suivi longitudinal des changements physiques dans le microenvironnement de la tumeur, in situ. La méthodologie décrite ici intègre un système de préparation de modèles in vitro 3D incorporés dans un modèle de matrice extracellulaire (ECM) de l&#39;échafaudage de collagène de type I avec des sondes marquées par fluorescence répartis uniformément pour po-sition et des mesures de temps-dépendante Microrhéologie à travers l&#39;échantillon. tumeurs in vitro sont étalées et sondés dans des conditions parallèles en utilisant des plaques d&#39;imagerie multi-puits. S&#39;appuyant sur ​​des méthodes établies, les vidéos des traceurs mouvements de la sonde sont transformés par la Relation généralisé Stokes Einstein (TBS) pour signaler le complexe viscoélastique module de cisaillement dépendant de la fréquence, G * (ω). Parce que cette approche est basée imagerie, caractérisation mécanique est également mappé sur de grands champs spatiaux transmis-lumière de signaler simultanément des changements qualitatifs dans la taille et le phénotype tumoral 3D. Les résultats représentatifs montrant contraste réponse mécanique dans les sous-régions associées à une dégradation locale de la matrice induite invasion ainsi que le calibrage du système, les données de validation sont présentés. Résultats indésirables de erreurs expérimentales communes et le dépannage de ces questions sont également présentés. Le format de la culture placage 3D 96 puits mis en œuvre dans ce protocole est conducive de corrélation des mesures de Microrhéologie avec des essais de criblage thérapeutiques ou d&#39;imagerie moléculaire à acquérir de nouvelles connaissances dans l&#39;impact des traitements ou à des stimuli biochimiques sur le microenvironnement mécanique.

Pour vérifier la validité de G * (ω) des mesures à des positions localisées dans un micro-environnement de la tumeur modèle complexe, deux expériences de validation initiales ont été menées. Tout d&#39;abord, nous avons cherché à valider nos mesures contre le «gold standard» de masse oscillante cisaillement rhéométrie. Nous avons préparé des échantillons identiques de matrice de collagène (sans cellules) à une concentration de 1,0 mg / ml de collagène. Ces échantillons ont été sondés avec un rhéomètre vrac (TA ...

microrhéologie de traces de particules peut être utilisé pour quantifier de manière non destructive et spatialement cartographier les changements dans les propriétés mécaniques matrice extracellulaire dans des modèles de tumeurs 3D.

Mesure longitudinale de la matrice extracellulaire rigidité de tumeur modèles 3D utilisant Microrhéologie de particules de suivi

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer les modifications longitudinales des propriétés mécaniques de la matrice extracellulaire dans des modèles tridimensionnels de cancer. Cela est réalisé en récoltant d'abord des cellules cancéreuses et en cultivant le stéroïde tumoral par une méthode appropriée jusqu'à ce qu'il atteigne la taille souhaitée. La deuxième étape consiste à incorporer le stéroïde tumoral dans du collagène ou une autre matrice extracellulaire appropriée.Ensuite, la grille de points d'échantillonnage est construite et une vidéo est enregistrée à chaque point. La dernière étape consiste à analyser les données vidéo et à calculer ainsi qu'à coregistrer les propriétés logiques réelles à chaque point spatial. En définitive, ce protocole utilise l'analyse des trajectoires des sondes traceuses pour quantifier longitudinalement les changements spatiaux des propriétés mécaniques de la matrice extracellulaire de manière non destructive.L'idée est que, en associant des mesures d'imagerie basées sur la radiologie de la matrice extracellulaire à des modèles tumoraux tridimensionnels in vitro qui restaurent les interactions avec la matrice extracellulaire, cette appro

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Mesure longitudinale de la matrice extracellulaire rigidité de tumeur modèles 3D utilisant Microrhéologie de particules de suivi (Vidéo) | JoVE Journal

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