Name: Lencapsulation de transcription cellulaire et sans traduction machines dans des vésicules pour la construction de Mimics cellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-21T20:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Découvrez l'encapsulation de la machinerie de transcription et traduction dans des vésicules lipidiques pour construire des mimétiques cellulaires. Cette méthode simple et économique permet de surveiller la production de protéines in vitro.

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Les auteurs remercient la Fondation Armenise-Harvard, la Marie-Curie Trentin COFUND (ACS), la province autonome de Trento (Ecomm), et CIBIO de financement.

1. Préparation de la matrice d&#39;ADN <ol><li> Purifier plasmide à partir d&#39;une souche de laboratoire standard de E. coli, tels que E. coli DH5a ou en Nouvelle-bleu avec un kit commercial. Alternativement, un produit PCR linéaire peut être purifié même avec un kit commercial. On élue l&#39;ADN avec H 2 O seulement. </li><li> Phénol-chloroforme extraire la solution d&#39;ADN 26. </li><li> Déterminer la concentration de l&#39;ADN et de la pureté, par exemple par absorbance UV ou d&#39;autres méthodes appropriées. Il est important d&#39;utiliser l&#39;ADN de haute pureté pour l&#39;efficacité de transcription-traduction. </li></ol> 2. Préparation de la Lipid Thin Film <ol><li> Peser la poudre lipidique sec et dissoudre dans un solvant. Pour 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC), les solutions mères sont préparées dans du chloroforme à une concentration de 40 mg / ml. Note: solvants organiques doivent être manipulés avec des pipettes en verre et de bouteilles. En d&#39;autres termes, le plastique ne doit jamais être utilisé. S Storesolutions tock dans serrés, solvants bouteilles en verre de couleur ambre résistant à l&#39;air à -20 ° C, de préférence sous argon. </li><li> Aliquote 12 pmol POPC (220 ul de 40 mg / ml de solution mère) dans un ballon à fond rond de 5 ml. </li><li> On évapore le solvant à l&#39;évaporateur rotatif (figure 1) pour générer le film lipidique mince. <ol><li> Fixer fermement le ballon à fond rond pour le tube de distillation avec une pince circulaire et démarrer la rotation du ballon. </li><li> Initier la circulation de l&#39;eau à travers le serpentin de condenseur. L&#39;utilisation d&#39;un bain de chaleur n&#39;est pas nécessaire, parce que le chloroforme a un faible point d&#39;ébullition de 61,2 ° C à la pression atmosphérique normale. </li><li> Assurez-vous que le système est ouvert à l&#39;atmosphère par vérifier que le robinet est ouvert. Tournez sur la pompe à vide et fermer lentement le robinet d&#39;appliquer le vide pour le système. </li><li> Un film mince de lipides se dépose sur les parois du ballon à fond rond pendant l&#39;évaporation rotative formant un film opaquece qui est visible à l&#39;œil nu. Soit l&#39;évaporation rotative continuer à 0,5-2 h. Pour arrêter le processus, relâchez lentement la pression de vide, arrêter la rotation, et enlever le ballon à fond rond. </li></ol></li></ol> 3. La remise en suspension des lipides et l&#39;homogénéisation des vésicules <ol><li> Ajouter 1 ml 18,2 MQ H 2 O pour le film lipidique mince directement dans le ballon à fond rond. Vigoureusement vortex de la solution à la vitesse maximale, soit environ 3200 tours par minute, jusqu&#39;à ce que le film lipidique se détache du verre, qui est observable à l&#39;oeil nu. </li><li> Transférer la dispersion lipidique dans un tube de 2 ml. </li><li> Mise en place d&#39;un anneau support pour tenir une homogénéisation avec une pointe de 5 mm. Placer une cale de centrifugation ci-dessous l&#39;homogénéisateur pour tenir solidement la dispersion des lipides. Rincez l&#39;élément de dispersion de l&#39;homogénéisation en plongeant la pointe dans 18,2 MQ H 2 O et courir pendant quelques secondes. </li><li> Placer l&#39;élément de dispersion directement dans la dispersion lipidique assurant èmeà la pointe ne touche pas le fond du tube de centrifugation. Homogénéiser pendant 1 min à puissance 4 ou 14.000 tours par minute. </li></ol> 4. Extrusion des vésicules et lyophilisation <ol><li> Assembler les parties de la mini-extrudeuse (figure 2), qui se compose d&#39;une enveloppe extérieure et d&#39;un écrou de retenue qui loge deux membrane Téflon interne prend en charge, les deux joints toriques, et un palier en téflon. <ol><li> Placer les deux joints toriques dans les rainures des supports de membrane interne. Pré-imbibé deux filtres et une membrane de 400 nm. Les filtres seront placés contre le Teflon à l&#39;intérieur des joints toriques avec la membrane entre eux. </li><li> Placer la membrane prend en charge dans la gaine à l&#39;extrudeuse avec la membrane entourée de deux filtres en entre les joints toriques. Placer le roulement Teflon l&#39;intérieur du boîtier et fixez l&#39;écrou de retenue et serrer à la main. </li></ol></li><li> Rincer deux seringues et de remplir un avec 18,2 MQ eau. Insérer les aiguilles de seringues dans le petit holes du téflon sur chaque extrémité de l&#39;ensemble d&#39;extrusion. Les aiguilles doivent glisser facilement, ne forcez pas les aiguilles. Fixez l&#39;extrudeuse avec les seringues dans le boîtier extrudeuse et coudre. </li><li> Faire passer l&#39;eau à travers l&#39;extrudeuse en poussant doucement l&#39;eau sur une seringue et dans l&#39;autre. Cela représente un passage. Répétez l&#39;opération pour un total de trois passages assurant qu&#39;il n&#39;y a pas de fuites actuelles. Retirez la seringue de l&#39;eau et de disposer de l&#39;eau. </li><li> Remplir une seringue avec l&#39;échantillon, attacher à l&#39;extrudeuse, et passer lentement la solution de vésicules à travers la membrane tel que décrit ci-dessus à l&#39;étape 4.3. Répétez 10 fois pour un total de 11 passages. Comme le procédé d&#39;extrusion produit, l&#39;échantillon sera moins trouble et plus facile à pousser à travers la membrane. Une baisse soudaine de la résistance, cependant, indique généralement une rupture de la membrane. </li><li> Transférer la solution de la vésicule extrudé et faire 40 aliquotes des vésicules dans des microtubes.Un gel chaque aliquote soit dans de la neige carbonique ou l&#39;azote liquide. </li><li> Lyophiliser chaque aliquote avec un évaporateur centrifuge pendant la nuit à 30 ° C. Stocker les vésicules vides lyophilisés à -20 ° C. </li></ol> 5. Encapsulation transcription-traduction Machinery <ol><li> Mélanger les composants de la réaction de transcription-traduction et ajouter 20 unités d&#39;inhibiteur de RNase. Incuber sur de la glace. </li><li> Ajouter la matrice d&#39;ADN. Pour obtenir une réaction de contrôle, 250 ng de plasmide mVenus de codage ou une protéine fluorescente similaire derrière un promoteur de transcription T7 et une forte E. coli site de liaison de ribosome est recommandé. </li><li> Porter le volume final de 25 pi avec de l&#39;eau sans RNase. </li><li> Hydratez une aliquote de vésicules lyophilisés (de l&#39;étape 4.6) avec 10 pl de la réaction assemblé à l&#39;étape 5.3. vortex brièvement le mélange jusqu&#39;à ce que les vésicules sont remises en suspension. Cela devrait prendre moins de 30 secondes. </li><li> Incuber la réaction sur la glace pendant 30 min pour permettre aux vésicules à gonfler. </li><li> Diluer le mélange de la vésicule 20 fois pour un volume final de 30 pi en ajoutant 1,5 ul de vésicules dans 27,0 ul de 50 mM Tris-HCl, NaCl 50 mM, pH 7,4 et 1,5 ul de 20,2 mg / ml protéinase K. DNase et RNase peuvent également être ajoutés à ce stade comme une alternative à la protéinase K à dégrader matière extravésiculaire. </li><li> Incuber pendant au moins 2,5 h à 37 ° C. </li></ol> 6. Microscopie <ol><li> Examiner les vésicules et les progrès de la production de la protéine fluorescente à différents points dans le temps. Les vésicules auront un diamètre plus grand que les pores de 400 nm de taille de la membrane utilisée pour l&#39;extrusion de la vésicule. <ol><li> Préparer une chambre d&#39;échantillon en plaçant un x 5 mm entretoise 20 de silicium sur une lame de microscope standard. Pipette 10 pl de vésicules dans la chambre de l&#39;échantillon. Placez une siliconé lamelle de verre sur la chambre. </li><li> Respecter les vésicules avec un 63X huile dispersion or objectif similaire par champ lumineux et la microscopie de fluorescence en utilisant l&#39;ensemble de filtre correspondant pour la protéine fluorescente exploité. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Bien que la biologie synthétique acellulaire est encore à ses balbutiements, des progrès ont jeté une base à partir de laquelle les systèmes cellulaires comme de plus en plus complexes peuvent être faites. La reconstitution de la machinerie de transcription-traduction à partir de composants entièrement défini 9 à l&#39;intérieur de vésicules 28 a été particulièrement important en facilitant les efforts ultérieurs dans la construction artificielle soucieux de l&#39;environnement cells17, 18. De même, les études sur les cellules artificielles ont été utilisés pour sonder les processus évolutifs 4,29,30, les détails mécanistiques de la synthèse d&#39;ARN et de protéines 22,31, les influences de métabolique load32, 33 ans, et l&#39;assemblage des particules virales 34. Surtout, suffisamment de connaissances existe maintenant que la fonction cellulaire de base peut être reconstitué à l&#39;intérieur de vésicules dans le laboratoire suite à ces précédents rapports et les protocoles décrits ici. En plus d&#39;être facile, l&#39;encapsulation décrite procedure a plusieurs avantages. Par exemple, de nombreux vides, portions de vésicules lyophilisés peuvent être faites à l&#39;avance et stockés à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. Le protocole n&#39;est pas soumis molécules biologiques aux solvants organiques, les changements brusques de température, ou de longues périodes de dialyse. Nous nous attendons à ce que la douceur de la procédure facilitera l&#39;intégration de composants supplémentaires au besoin. Nous avons également pas été observé d&#39;effets défavorables pour modifier la composition lipidique de la membrane sur l&#39;encapsulation ou l&#39;efficacité de transcription-traduction. Par conséquent, les lipides plus favorable à l&#39;incorporation de protéines membranaires, des morphologies spécifiques, ou la visualisation pourraient éventuellement être exploitées. La principale limite de la méthode décrite est que les vésicules résultantes ne sont pas homogènes en taille ou lamellarité. Pour de nombreuses applications, ces difficultés ne nuisent pas à l&#39;interprétation des données. Toutefois, si nécessaire, des mesures supplémentaires peuvent être incorporés à th étroitdistribution de la taille de l&#39;e et de diminuer les couches de membranes, telles que des cycles supplémentaires de l&#39;extrusion après l&#39;encapsulation, de gel-dégel, ou de dialyse 35. Sans doute de meilleures méthodes permettant de contourner ces problèmes et d&#39;autres seront développés. Jusque-là, nous trouvons le protocole décrit ici à être bien adapté pour la construction de mimiques cellulaires.

Acellulaire in vitro réactions transcription-traduction et la production de vésicules de lipides synthétiques ne sont pas nouvelles. Cependant, la combinaison des deux dans un cellulaire imiter est nettement plus challenging1-6. E. des extraits de cellules de E. coli avec ou sans T7 ARN polymérase ne peuvent être utilisés en tant que source de la machinerie de transcription-traduction 7,8. Des extraits cellulaires avantage de la présence d&#39;autres composants cellulaires qui peuvent faciliter l&#39;expression de protéines et de pliage. Alternativement, un mélange d&#39;ARN purifiés individuellement et les molécules de protéines, c&#39;est à dire le système PURE 9, peut être utilisé comme intermédiaire pour la synthèse des protéines intravésiculaire 4,10-14. Le système PURE permet la construction de mimiques cellulaires entièrement définis et ne souffre pas de l&#39;activité nucléase trouvé dans les extraits cellulaires. Pratiquement, cela signifie que beaucoup moins matrice d&#39;ADN est nécessaire, ce qui facilite les processus avec une faible efficacité d&#39;encapsulation 11 </sup&gt;. Bien que moins fréquemment utilisés, imite cellulaires peuvent être construits avec des extraits cellulaires dérivées de eucaryote cells15. Jusqu&#39;à présent, les cascades encapsulées codées génétiquement et imite cellulaires qui captent l&#39;environnement ont été signalés 16-18. Le plus simple pour surveiller les effets transcription-traduction est de mesurer la fluorescence ou luminescence d&#39;éléments génétiquement codés. En règle générale, la luciférase de luciole 19 ou GFP sont utilisés, bien in vitro réactions sont souvent mesurés par marquage radioactif. La détection par fluorescence permet en outre pour le suivi des populations de vésicules 20,21 par des méthodes basées sur la cytométrie, offrant ainsi un aperçu de la nature stochastique des processus biologiques comparables. Ces méthodes de surveillance ont été utilisées pour définir un petit ensemble de règles de conception et d&#39;une bibliothèque de pièces à partir de laquelle construire à partir, y compris une collection de protéines fluorescentes qui sont compatibles avec in vitro transcription-traduction 22, l&#39;influence de l&#39;organisation génétique sur l&#39;expression 22, l&#39;activité des facteurs sigma 16, et l&#39;efficacité de terminaison de la transcription 23. Néanmoins, il reste beaucoup qui doit être fait pour augmenter la capacité de construire prévisible in vitro, des dispositifs codées génétiquement. Il existe de nombreuses méthodes disponibles pour faire des vésicules. Les méthodes les plus courantes dépendent de la génération d&#39;un film lipidique mince sur une surface de verre, suivie par remise en suspension dans une solution aqueuse Solution24. Si la solution aqueuse contient machines transcription-traduction, par exemple, une fraction des vésicules formées contiendrait les éléments nécessaires pour la production de protéines. Cependant, le rendement d&#39;encapsulation de tels procédés est faible, ce qui signifie que seulement une faible proportion des vésicules sont actifs. Beaucoup de méthodes alternatives caractérisées par beaucoup plus eff d&#39;encapsulationiciency exploiter la conversion des gouttelettes de l&#39;émulsion eau-dans-huile à des vésicules. Bien qu&#39;il soit probable que ces méthodes seront monnaie courante dans l&#39;avenir, pour le moment ces méthodes souffrent de la nécessité d&#39;un équipement spécialisé et donnent des vésicules avec la membrane compositions modifiées 25. Un avantage particulier de l&#39;eau-dans-huile à des procédés de la vésicule est le potentiel de contrôle de lamellarité de la membrane. Le procédé décrit ici est basé sur le protocole de couche mince de lipide décrit par le laboratoire Yomo 11 avec de légères modifications, notamment une étape d&#39;homogénéisation complémentaire. Cette méthode est facile, pas cher, et donne des vésicules robustes et adaptés pour l&#39;encapsulation des machines transcription-traduction.

<table><tbody><tr><td>Quick Spin Mini-prep kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre</td><td>NanoDrop 1000</td><td>NDB767ND</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>770557</td><td>MW 760 g/mol Transition Temp -2 &deg ; C CAS# 26853-31-6</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>459836</td><td>anhydre, >99,5</td></tr> %<tr><td>Phénol-choloroforme-alcool isoamylique 25:24:1, pour la biologie moléculaire</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3803-100mL</td><td>Saturé de 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Biotech Grade Fluka</td><td>496189-1L</td><td>Contient de l’éthanol à 0,5-1,0 % v/v comme stabilisant</td></tr><tr><td>Bouteilles</td> <td>en verre brun ambréVWR</td><td>89043-518</td><td>55X 48 mm</td></tr><tr><td>Évaporateur rotatif</td><td>Buchi Rotovapor R-210/Sigma</td><td>Z563846EU-1EA</td><td>Avec vérin et bain-marie, joint 29/32 240 V</td></tr><tr><td>Mélangeur vortex analogique</td><td>VWR</td><td>945300</td><td>Vitesse 1 000-3 200 tr/min</td></tr><tr><td>Homogénéisateur</td><td>IKA T10 Basic Ultra-Turbax</td><td>3420000</td><td></td></tr><tr><td>Mini-extrudeuse</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610020</td><td></td></tr><tr><td>Filtres d’extrudeur</td><td>Whatman</td><td>610014</td><td>disque de vidange 10 mm&nbsp ;</td></tr><tr><td>Extrudeuse membrane polycarbonate 400 nm</td><td>Whatman</td><td>61007</td><td>polycarbonate nuclépore&nbsp ;</td></tr><tr><td>Concentrateur</td><td></td><td>d’ADN 7970011Centritrap</td><td></td></tr><tr><td>PURExpress New</td><td>England Biolabs</td><td>NRM #E6800S</td><td></td></tr><tr><td>inhibiteur de l’ARNASE (40 000 U/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>#M0307S</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K (20,2 mg/ml)</td><td>Microscope Fermentas</td><td>#EO0491</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss Observer Z1avec une caméra</td><td></td><td></td>AxioCam MRm</tr><tr><td>RealTime</td><td>CFX96 Système de détection PCR en temps réel (Biorad)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Presse à silicium pour sceller&nbsp ; -Sonde moléculaire</td><td>Life Technologies</td><td>P18174</td><td>Résistante de&nbsp ; -25-30 &deg ; C</td></tr><tr><td>Glissières de couvercle circulaire en verre siliconé</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-231</td><td>&nbsp ; &nbsp ; Diamètre= 22 mm</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;encapsulation de transcription cellulaire et sans traduction machines dans des vésicules pour la construction de mimics cellulaires

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

En quarts de travail d&#39;intérêt à partir de molécules individuelles à des systèmes de molécules, un nombre croissant de laboratoires ont cherché à construire de bas en haut imite cellulaires qui représentent mieux la complexité de la vie cellulaire. À ce jour, il ya un certain nombre de chemins qui pourraient être prises pour renforcer imite cellulaires compartimentées, y compris l&#39;exploitation des émulsions eau dans huile, des dispositifs microfluidiques et des vésicules. Chacune des options disponibles a des avantages et des inconvénients spécifiques. Par exemple, les émulsions eau-dans-huile donne une grande efficacité d&#39;encapsulation, mais ne reproduisent pas bien la barrière de perméabilité des cellules vivantes. Le principal avantage des méthodes décrites ici, c&#39;est qu&#39;ils sont tous facile et pas cher à mettre en œuvre. Machines transcription-traduction est encapsulé à l&#39;intérieur de vésicules de phospholipides par un processus qui exploite l&#39;instrumentation commune, comme un évaporateur centrifuge et une extrudeuse. Les réactions sont suivies par spectroscopie de fluorescence. Le protocoles peuvent être adaptés pour l&#39;expression de protéines recombinantes, la construction de mimiques cellulaires, l&#39;exploration des exigences minimales de la vie cellulaire, ou l&#39;assemblage de circuits génétiques.

La microscopie à fluorescence révèle que la fluorescence est observée uniquement à l&#39;intérieur des vésicules, parce que le matériel extravésiculaire est dégradé par voie enzymatique (figure 3). Pour l&#39;expression de mVenus, intravésiculaire fluorescence commence à être observée au bout de 1,5 heures à 37 ° C et atteint l&#39;intensité de fluorescence maximale dans 6 h. La température optimale et le temps d&#39;incubation peut varier en fonction des constructions spécifiques utilisés. Par exemple, différentes protéines fluorescentes mûrissent très différemment d&#39;une manière dépendante de la température. En d&#39;autres termes, l&#39;observation de la production de protéines n&#39;est pas uniquement dépendant de la synthèse des protéines et le pliage mais aussi sur la formation du chromophore. Synthèse globale des protéines peut être augmentée en incorporant les pores de la protéine de membrane pour permettre l&#39;afflux des composants épuisés nécessaires à la transcription et à la traduction 27. Il est recommandé d&#39;effectuer un analogue transcription traduction réaction en l&#39;absence de vésicules à ce que la construction génétique est exploité fonctionnelle. Cette réaction de contrôle est plus facilement contrôlée par spectroscopie de fluorescence plutôt que la microscopie. Figure 4 montre une réaction de transcription-traduction in vitro d&#39;une construction mVenus d&#39;encodage. Réactions non encapsulées donner beaucoup plus intensités de fluorescence totaux que intravésiculaires réactions similaires. Cela est dû à l&#39;efficacité d&#39;encapsulation et parce que le volume total de intravésiculaire est beaucoup moins que le volume extravésiculaire (soit un effet de dilution). <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig1.jpg" width="600px" /> Figure 1. L&#39;évaporateur rotatif et pompe à vide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . Figure 2. L&#39;logement et des parties de l&#39;extrudeuse sont présentés séparément. De gauche à droite, une seringue, écrou de retenue, roulement en téflon, membrane interne prend en charge avec des joints toriques noirs face de l&#39;autre, extrudeuse enveloppe extérieure et la deuxième seringue. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig3.jpg" width="600px" /> . Figure 3 images de fluorescence de la production de protéines mVenus dans des liposomes A et C:.. Des images de fond clair de vésicules multilamellaires après 1,5 h et 2,5 h et B &amp;# 160; D: La production de mVenus est visualisé par fluorescence (couleur verte) après 1,5 et 2,5 heures, respectivement. Barre d&#39;échelle est de 20 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig4.jpg" width="600px" /> Figure 4. Dans la réaction de contrôle in vitro de non encapsulé transcription in vitro et la traduction de mVenus. L&#39;intensité de fluorescence a été mesurée toutes les 5 min pendant 4 heures. Les données ont été acquises avec un instrument PCR en temps réel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> .

Ici, nous décrivons des méthodes simples pour la préparation de vésicules, l&#39;encapsulation de la transcription et de la machinerie de traduction, et le suivi de la production de protéines. Les systèmes sans cellules résultantes peuvent être utilisées comme point de départ pour construire imite cellulaires de plus en plus complexes.

L&#39;encapsulation de transcription cellulaire et sans traduction machines dans des vésicules pour la construction de Mimics cellulaires

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

L'objectif général de cette procédure est de construire des cellules artificielles à partir de zéro en encapsulant un système de transcription-translation dans des vésicules. Cela est réalisé en préparant tout d'abord un film lipidique mince. Ensuite, après la formation des vésicules, les composants sont assemblés pour permettre la transcription-translation in vitro.La dernière étape consiste à introduire le système de transcription-translation à l'intérieur des vésicules. L'activité du modèle cellulaire peut finalement être surveillée par microscopie. Le principal avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes d'encapsulation existantes, telles que les émulsions eau-huile, les dispositifs microstructurés ou le processus de conversion eau-huile en vésicules, est qu'elle est simple, peu coûteuse et produit des vésicules robustes dont les propriétés de perméabilité conviennent parfaitement à la construction de modèles cellulaires exploitant la fonction protéique encodée génétiquement.Cette méthode ne permet pas d'explorer des domaines clés de la biologie synthétique in vitro et ascendante, tels que la définition des bases minimales de la vie et le développement de technologies non vivantes imitant la vie. Pour préparer un film lipidique mince, commencez par dissoudre du POPC dans du chloroforme à une concentration de 40 milligrammes par millilitre, puis prélevez 12 micromoles de POPC dans un flacon rond de cinq millilitres. Ensuite, utilisez un clip circulaire pour fixer fermement le flacon au tube de distillation d'un évaporateur rotatif.Ensuite, en utilisant le réglage six, commencez une rotation forte et régulière du ballon. Ensuite, commencez à faire circuler l'eau à travers la colonne réfrigérante. L'eau n'a pas besoin d'être chauffée car le chloroforme a un point d'ébullition bas de 61,2 degrés Celsius.À une atmosphère, s'assurer que le système est ouvert à l'atmosphère en vérifiant que le robinet est ouvert afin d'appliquer simultanément le vide au système. Mettre en marche la pompe à vide tout en fermant lentement le robinet. Laisser la évaporation rotative se poursuivre de 0,5 à deux heures après que le chloroforme ne soit plus visible à l'œil nu.Pour arrêter le processus, relâchez lentement la pression de vide et arrêtez la rotation. Retirez le flacon et observez le film lipidique mince et opaque visible sur les parois du flacon, qui doit être mis en suspension. Commencez par ajouter un millilitre d’eau déionisée de 18,2 mégohms au film lipidique mince dans le flacon rond, puis vortexez vigoureusement la solution à environ 3 200 tr/min jusqu’à ce que le film lipidique se détache du verre.Cela devrait prendre environ une minute. Ensuite, transférez la dispersion lipidique dans un tube micro-centrifuge de deux millilitres. Installez un support sur trépied pour maintenir un homogénéisateur équipé d'une sonde de cinq millimètres et placez un micro-centrifugeuse.Se placer sous l'homogénéisateur pour maintenir fermement la dispersion lipidique. Placer ensuite l'élément de dispersion directement dans la dispersion lipidique, en veillant à ce que la pointe ne touche pas le fond du tube. Homogénéiser la dispersion lipidique pendant une minute.Au niveau de puissance quatre, assemblez les composants de la mini-extrudeuse, constituée d'un boîtier externe et d'un écrou de maintien qui loge deux supports internes en téflon, deux joints toriques et un palier en téflon. Placez les deux joints toriques dans les rainures des supports de membrane. Humidifiez ensuite deux filtres et une membrane de coupure à 400 nanomètres, puis placez les filtres humides contre la partie en téflon située à l'intérieur des joints toriques. La membrane de coupure à 400 nanomètres est positionnée entre les deux filtres.Placer les supports de membrane dans le boîtier extérieur de l'extrudeuse, la membrane étant entourée par deux filtres situés entre les joints toriques. Placer le palier en téflon à l'intérieur du boîtier et le fixer à l'aide d'un écrou de retenue à la main. Ensuite, rincer deux seringues et en remplir une avec de l'eau de 18,2 mégohm.Insérez les aiguilles des seringues dans les petits trous du téflon situés à chaque extrémité de l'ensemble de l'extrudeuse. Les aiguilles doivent s'insérer facilement. N'exercez pas de force sur les aiguilles.Ensuite, fixez l'ensemble dans le logement de l'extrudeuse. Faites maintenant passer l'eau à travers l'extrudeuse en poussant lentement l'eau d'une seringue vers l'autre. Cela représente un passage.Effectuez trois passages pour vérifier les fuites, puis retirez les seringues. Remplissez une nouvelle seringue avec la solution de vésicules. Fixez-la à l'extrudeuse et faites passer lentement la solution à travers la membrane.Répétez cette opération pour un total de 11 passages. Au fil du processus, l'échantillon devient progressivement moins trouble et plus facile à faire passer à travers la membrane. Une diminution soudaine de la résistance indique généralement une rupture de la membrane. Une fois terminé, préparez des aliquotes de 40 microlitres de la solution de vésicules extrudées.Congelez rapidement chaque aliquot dans de la glace sèche ou de l'azote liquide. Une fois congelé, utilisez un évaporateur centrifuge pour lyophiliser chaque aliquot pendant une nuit. À 30 degrés Celsius, les vésicules vides lyophilisées peuvent être conservées à moins 20 degrés Celsius. Commencez l'encapsulation en mélangeant les composants de la réaction de transcription-translation et en ajoutant 20 unités d'inhibiteur d'ARN.Incuber les réactifs sur de la glace, puis ajouter le modèle d'ADN comme témoin, en utilisant 250 nanogrammes d'un plasmide codant pour m venous ou une protéine fluorescente similaire sous un promoteur transcriptionnel T7 et un site de liaison au ribosome fort d'E. coli. Porter le volume final des réactions à 25 microlitres. Avec de l'eau libre d'ARN, hydrater maintenant 40 microlitres de vésicules lyophilisées dans 10 microlitres du mélange réactionnel.Vortexez brièvement une fois le mélange afin de resuspendre les vésicules. Cette étape ne devrait pas prendre plus de 30 secondes. Incubez la réaction sur de la glace pendant 30 minutes pour permettre aux vésicules de gonfler.Ensuite, diluez le mélange de vésicules 20 fois pour obtenir un volume final de 30 microlitres en combinant 1,5 microlitre de vésicules avec 27,0 microlitres de solution de chlorure de tris et 1,5 microlitre de solution mère de protéinase K. Incubez maintenant le mélange de vésicules dilué pendant au moins deux heures et demie à 37 degrés Celsius.Préparez une chambre d'échantillonnage en plaçant un espaceur en silicone de 20 par 5 millimètres sur un microscope standard. Introduisez 10 microlitres de vésicules dans la chambre d'échantillonnage à l’aide d’une pipette et placez une lame couvre-objet silanisée par-dessus la chambre. Ensuite, observez les vésicules à l’aide d’un objectif à immersion huile 63 x ou équivalent, en microscopie en champ clair et en microscopie à fluorescence.En utilisant le jeu de filtres approprié pour la protéine fluorescente exploitée, la microscopie de fluorescence révèle que la fluorescence n'est observée que dans l'intérieur des vésicules. Le matériel extravésiculaire est dégradé enzymatiquement lors de l'expression d'intravésiculaire en veineux. La fluorescence commence à être observée après 1,5 heure à 37 degrés Celsius.M Venus atteint une fluorescence maximale en six heures. Ici, elle est observée à 2,5 heures. Cette production de protéine dépend de la synthèse et du repliement protéiques, ainsi que de la formation du chromophore.Une réaction in vitro de transcription-translation analogue d'un construct et d'un revêtement de mVenus sans vésicules est utilisée comme témoin. Ces réactions présentent des intensités de fluorescence plus élevées en raison de l'efficacité d'encapsulation et d'un effet de dilution. Elles sont donc surveillées par spectroscopie, et non par microscopie.Cette procédure peut être utilisée pour répondre à des questions relatives à la régulation et aux effets de la charge métabolique sur l'activité des cellules artificielles. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment construire des cellules modèles en encapsulant directement un système de transcription-translation dans des vésicules synthétiques.

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