Name: Utilisation dun multiplexage Caspase test destiné à déterminer lapoptose dans une cellule du modèle hypothalamique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-16T15:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Découvrez un test multiplex Caspase-3/7 pour mesurer l'apoptose dans les neurones hypothalamiques exposés à l'acide palmitique. Cette méthode rapide combine fluorescence et luminescence pour évaluer la viabilité cellulaire.

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Le travail décrit ici a été financé par le département américain des Anciens Combattants recherche biomédicale en laboratoire et développement BX001686-1A1 et VA réhabilitation de recherche et de développement.

1. Placage et entretien de culture cellulaire <ol><li> Modified Eagle Medium chaud Dulbecco (DMEM) des milieux de culture (DMEM + 10% FBS + 1% pénicilline / streptomycine / néomycine) à 37 ° C. </li><li> Obtenir stock de cellules congelées A12 à partir de -80 ° C. </li><li> Décongeler rapidement dans les cellules à 37 ° C bain d&#39;eau; une fois décongelé, en douceur les cellules de pipette pour transférer à un évent flacon de culture de 75 cm 2 et ajouter 10 ml de milieu de culture. </li><li> Incuber ballon pendant une nuit sous 5% de CO 2 incubateur à 37 ° C. Aspirer le milieu après 24 h et le remplacer par du milieu frais. Continuer jusqu&#39;à ce que la croissance de cellules 70-80% de confluence est obtenue (croissance de 2-3 jours). </li></ol> 2. Comptage et étalement des cellules <ol><li> DMEM chaud et solution 1x-trypsine-EDTA à 37 ° C. </li><li> Aspirer le milieu des cellules et laver deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS). </li><li> Ajouter 500 ul de solution de trypsine et incuber à 37 ° C pendant 2-5 min. </li><li> Détacherles cellules de ballon à l&#39;aide d&#39;un grattoir et suspendre les cellules dans 5 ml de milieu. Passez cellules à travers la crépine et passer à travers tamis cellulaire dans un tube de 50 ml propre. Il peut être nécessaire de passer par les cellules crépine plus d&#39;une fois, mais ne pas répéter plus de trois fois. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hématimètre pour déterminer la quantité de cellules de culture de semences de 6000 cellules / puits dans une plaque inférieure paroi noir ou blanc 96 puits clair dans un volume final de 100 ul de milieu. Incuber la plaque à 5% de CO2 à 37 ° C pendant 24 heures. </li></ol> 3. Détermination de la viabilité cellulaire et la caspase-3/7 Activité <ol><li> PA transférer à un flacon de 5 ml en verre stérile et solubiliser dans 100% de diméthylsulfoxyde (DMSO). Diluer la solution mère PA 01h10 dans le DMSO et l&#39;ajouter à préchauffé DMEM pour obtenir une concentration finale de travail mM PA 0,1. Pour les milieux témoins, ajouter la même concentration de DMSO, qui est ajouté à des milieux contenant du PA. </li><li> Retirez le support dans chaque puits et les remplacer par 50 médias pl + / -PA. Incuber la plaque pendant 2 heures dans 5% de CO2 à 37 ° C. Ajouter ensuite 5 pi réactif REMA et incuber pendant 10 min à température ambiante. </li><li> En utilisant un lecteur de microplaques multimode, record fluorescence (560 EX / 590 EM) pour mesurer la viabilité cellulaire. Les résultats sont présentés sous forme d&#39;unités relatives de fluorescence (RFU). </li><li> Pour la même plaque, ajouter 55 ul de réactif de la caspase et incuber à température ambiante pendant 2 h. </li><li> Encore une fois à l&#39;aide du lecteur de microplaques, record luminescence pour mesurer l&#39;activité de la caspase-3/7. Les résultats sont présentés sous forme d&#39;unités relatives de luminescence (RLU), avec une luminescence directement proportionnelle à la caspase-3/7 activité. </li><li> Pour normaliser l&#39;activité de la caspase-3/7 de la numération cellulaire, la viabilité des cellules diviser (RFU) par la caspase-3/7 activité (RLU). </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont aucun conflit de divulguer.

Le test multiplex est une technique bien acceptée qui a été utilisé par les scientifiques dans de nombreuses applications telles que les puces à ADN de PCR, immunodétection, et d&#39;autres méthodes de détection à base de protéines de 13, 14. Récemment, des tests de multiplexage sont devenus de plus en plus utilisés dans des expériences in vitro sur la base de plaque et ont été validées comme une méthode précise pour évaluer la cytotoxicité et de la viabilité 12. Dans le protocole...

Les régimes riches en acides gras saturés comme l&#39;acide palmitique (PA) ont été associés à l&#39;obésité et d&#39;autres comorbidités, notamment les maladies cardiovasculaires et le diabète 1, 2. On a également montré les régimes alimentaires riches en matières grasses d&#39;augmenter le stress oxydatif, l&#39;apoptose, et la dégénérescence des neurones de l&#39;hypothalamus, un important régulateur de l&#39;appétit et les dépenses énergétiques 3-7. Comprendre le mécanisme par lequel l&#39;exposition de régime riche en graisses induit dérèglement hypothalamique est donc important pour le développement de traitements pharmacologiques de l&#39;obésité. Toutefois, les mécanismes cellulaires à travers lequel les graisses alimentaires affecte la fonction neuronale restent floues. Une meilleure compréhension de la façon dont les graisses tels que le PA peuvent déclencher l&#39;apparition de voies apoptotiques hypothalamiques est une première étape nécessaire vers cet objectif. Le but de cet article est de décrire un test multiplex pour les tests in vitro de la réponse neuronale à l&#39;exposition PA, développé pour une utilisation dans les études de hneurodégénérescence ypothalamic. Nous fournissons une description détaillée d&#39;un 96 bien le format dosage multiplex in vitro pour mesurer la caspase 3/7 activité par nombre total de cellules dans une ligne différenciée immortalisé de souris adulte hypothalamique cellulaire (désigné A12) après défi oxydatif avec PA 8. En bref, la viabilité cellulaire est déterminée après l&#39;épreuve PA via un test de resazurine base. Résazurine est un composé perméable de cellule qui subit une réduction enzymatique dans les cellules métaboliquement actives, un processus de pensée de se produire via les mitochondries 9. Les cellules viables à convertir en continu résazurine résorufine, la production d&#39;un signal fluorescent proportionnel au nombre de cellules viables. l&#39;activité de la caspase-3/7 est ensuite analysée en utilisant un dosage basé lumogenic-DEVD. DEVD est une séquence d&#39;acides aminés (Asp-Glu-Val-Asp) clivée par la caspase-3. Lorsque cette séquence est couplé à une substance lumogenic, lors d&#39;une activation intracellulaire de la caspase-3/7 et le clivage subséquentDEVD de substrat, le produit luminescent est libéré. Cette réaction est proportionnelle à l&#39;activité des caspases et, par conséquent à l&#39;induction de l&#39;apoptose. Comme les cellules mortes ne peuvent pas produire la caspase, la caspase-3/7 activité est par nature transitoire; donc l&#39;analyse doit être effectué entre 30 min à 4 h après la provocation, en fonction de l&#39;efficacité de stress cellulaire. La viabilité des cellules est inversement proportionnelle à l&#39;activité de la caspase-3/7 et peut être utilisé pour déterminer les mécanismes de mort cellulaire. Par exemple, ce procédé a déjà été utilisé pour montrer que le prétraitement avec l&#39;hormone peptidique orexine réduit l&#39;apoptose dans les cellules hypothalamiques provoquées avec du peroxyde d&#39;hydrogène, ce qui suggère que des mécanismes affectés par ce traitement sont importants dans la protection contre les dommages oxydatifs 10. Il est important de noter que ces tests sont-line et le tissu cellulaire dépendante, car elles reposent sur l&#39;activité mitochondriale de réduire les réactifs de dosage. Ce protocole a été optimisé pour l&#39;hypothalamus de souris adulte (A12) des cellules; cependant,méthodes décrites peuvent être modifiées pour s&#39;adapter dans le cadre de recherches similaires. Essais de multiplexage d&#39;une seule culture fournit ainsi un avantage sur la méthode traditionnelle de réaliser des dosages individuels pour plusieurs raisons. En plus d&#39;économiser du temps, des échantillons de cellules, et les réactifs de culture, des essais de multiplexage peuvent également fournir des connaissances de la survie cellulaire et la mort, assurer des contrôles internes, et d&#39;éliminer la nécessité d&#39;expériences répétitives 11, 12. Méthodes alternatives se sont appuyés sur des taches ou ELISA occidentaux, qui sont des tests fiables, mais ils sont coûteux et fastidieux (1-2 jours), en particulier lors de l&#39;utilisation d&#39;un format de 96 puits. À l&#39;exclusion du temps qu&#39;il faut pour des cellules de culture pour le test de multiplexage, la durée totale est inférieure à 3 heures. Bien que ce protocole a été optimisé pour une utilisation avec les cellules A12, il peut être modifié pour une utilisation dans d&#39;autres modèles tout en gardant à l&#39;esprit les facteurs qui peuvent influer sur l&#39;intégrité de la cellule. Dissuaderminier, si ce protocole travailler pour une série d&#39;expériences dépend du nombre d&#39;échantillons ou de conditions expérimentales et sur des expériences en aval prévues.

<table><tbody><tr><td>Lignée cellulaire de l’hypothalamus de souris adulte mHypoA-1/2&nbsp ;</td><td>Cellutions Biosystems Inc.</td><td>CLU172</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal&nbsp ;</td><td>PAA Labs</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Acide palmitique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>Dimethy Sulfoxide&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td> PrestoBlue Réactif de viabilité cellulaire</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 Assay Systems</td><td>Promega</td><td>G8091</td><td></td></tr><tr><td>96 W Plaque inférieure optique, polystyrène noir, traité par culture cellulaire, avec couvercle, stérile</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Dispositifs moléculaires multimodes sur microplaques</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation d&#39;un multiplexage caspase test destiné à déterminer l&#39;apoptose dans une cellule du modèle hypothalamique

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

La capacité de multiplexer des dosages dans des études sur les mécanismes cellulaires complexes élimine la nécessité d&#39;expériences répétitives, fournit des contrôles internes, et diminue les coûts des déchets et des réactifs. Nous décrivons ici l&#39;optimisation d&#39;un dosage multiplex à évaluer l&#39;apoptose suivant un acide palmitique (PA) de défi dans un modèle hypothalamique in vitro, en utilisant à la fois fluorescent et luminescent à base de dosages pour mesurer le nombre de cellules viables et de la caspase-3/7 activité dans un 96 puits format de plaque de microtitration. Après l&#39;épreuve PA, les cellules viables ont été déterminés par un essai fluorescent à base resazurine. Caspase-3/7, puis l&#39;activité a été déterminée en utilisant un substrat luminescent, DEVD, et normalisée au nombre de cellules. Ce test de multiplexage est une technique utile pour déterminer les changements dans l&#39;activité de la caspase la suite d&#39;un stimulus apoptotique, tel que défi d&#39;acide gras saturé. L&#39;acide gras saturé PA peut augmenter le stress oxydatif et l&#39;apoptose hypothalamique, indiquant l&#39;importation potentielnce de tests tels que celui décrit ici à l&#39;étude de la relation entre les acides gras saturés et de la fonction neuronale.

Le protocole ci-dessus présente les résultats de multiplexage deux essais distincts pour déterminer les mécanismes de la mort cellulaire. Figure 1 montre une vue d&#39;ensemble du protocole pour déterminer la viabilité cellulaire et de la caspase-3/7 activité. l&#39;activité de la caspase était significativement augmentée dans les cellules provoqués avec PA après 2 heures d&#39;incubation (figure 2A et le tableau 1). La perte d&#39;intégrité de la membrane cellulaire es...

Les essais multiplex peuvent fournir des informations utiles pour les mécanismes cellulaires de base et d&#39;éliminer les déchets de réactifs et d&#39;expériences répétitives inutiles. Nous décrivons ici une caspase-3/7 dosage de l&#39;activité de multiplexage, en utilisant des procédés fluorescents, luminescents et située, pour déterminer la viabilité cellulaire dans un modèle in vitro de l&#39;hypothalamus après provocation par oxydation avec de l&#39;acide palmitique.

Utilisation d&#39;un multiplexage Caspase test destiné à déterminer l&#39;apoptose dans une cellule du modèle hypothalamique

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

L'objectif général de cette vidéo est de démontrer un dosage multiplex à haut débit permettant de déterminer le début de l'apoptose mesuré par la caspase 3/7. Dans un premier temps, des neurones hypothalamiques sont exposés à l'acide gras saturé inducteur d'apoptose, l'acide palmitique.Ensuite, la viabilité cellulaire des neurones est mesurée à l’aide d’un réactif basé sur la fluorescence et d’un lecteur de microplaques, après l’induction de l’apoptose. Le substrat luminescent DEVD, qui correspond à une séquence d’acides aminés clivée par la caspase-3, est ajouté aux cellules. La dernière étape du protocole consiste à mesurer la luminescence à l’aide d’un lecteur de microplaques afin de déterminer l’activité de la caspase, qui augmente dans les cellules en cours d’apoptose.En fin de compte, un ratio d'activité de la caspase par cellule viable peut être obtenu en moins de cinq à six heures, dans un format de plaque de 96 puits. Le principal avantage de cette technique par rapport à nos méthodes existantes, telles que les immunobuvards ou la lyse, réside dans le fait qu'il s'agit d'un dosage rapide et peu coûteux permettant de mesurer directement l'activité des caspases 3 et 7 dans d

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Imagerie des cellules vivantes de l'apoptose médiée caspase-3 dans les cultures cellulaires immortalisée N19-oligodendrocyte utilisant...

Surveillance clivées activité caspase-3 et l&#39;apoptose des cellules immortalisées oligodendrocytaires utilisant imagerie des cellules vivantes et de Cleaveable fluorogénique-dye substrats suivants dépolarisation de la membrane de potassium induite par

Cette vidéo décrit un test luminescent in vitro de caspase-3/7 pour quantifier la mort cellulaire ou l’apoptose. Le dosage mesure la luminescence produite suite au clivage de la caspase-3/7 d’un substrat DEVD proluminescent. La luminescence générée est proportionnelle à l’activité de la caspase-3/7.

Caspase-3/7 Assay : Un test basé sur la luminescence pour quantifier l’apoptose en mesurant les activités de la caspase-3/7 dans les explants de peau de grenouille

Le terme anastase fait référence au phénomène dans lequel les cellules mourantes inversent un processus de suicide cellulaire à un stade avancé, se réparent elles-mêmes et finissent par survivre. Nous démontrons ici des protocoles de détection et de suivi des cellules qui subissent une anastase.

Stratégies pour le suivi Anastasis, une cellule de survie Phénomène qui renverse apoptose

Pour détecter les cellules saines chez des animaux entiers qui contiennent de faibles niveaux d'activité de la caspase, le biocapteur très sensible désigné CaspaseTracker a été générée pour la drosophile. Biocapteur activité caspase-dépendante est détectée dans les cellules saines longue durée de vie à travers les organes internes des animaux adultes élevés dans des conditions optimisées en l'absence de stimuli de mort.

In Vivo Biocapteur Tracks apoptotique non-activité Caspase chez la drosophile

Anastasis est techniquement difficile à détecter en vivo , parce que les cellules qui ont inversé le processus de mort cellulaire peuvent être morphologiquement impossibles à distinguer des cellules saines normales. Nous décrivons ici les protocoles pour détecter et suivre des cellules subissant anastasis animaux vivants à l’aide de notre système de biocapteur nouvellement mis au point en vivo CaspaseTracker.

Détection de Anastasis In Vivo par CaspaseTracker biocapteur

Ce protocole décrit la caspase bimoléculaire complémentation de Fluorescence (BiFC) ; une méthode axée sur l’imagerie qui permet de visualiser la proximité induite par des caspases initiateur, qui est la première étape de leur activation.

Illuminant les voies à l’Activation des caspases utilisant la Fluorescence bimoléculaire complémentation

Ici, un flux de travail expérimental est présenté qui permet la détection du traitement de la caspase-8 directement au niveau du complexe de signalisation induisant la mort (DISC) et détermine la composition de ce complexe. Cette méthodologie a de vastes applications, allant du démêlage des mécanismes moléculaires des voies de mort cellulaire à la modélisation dynamique des réseaux d’apoptose.

Mesure de la composition du complexe de signalisation induisant la mort CD95 et traitement de la procaspase-8 dans ce complexe

Ce protocole décrit le flux de travail pour obtenir des macrophages dérivés des monocytes (MDM) à partir d’échantillons de sang humain, une méthode simple pour introduire efficacement des rapporteurs de complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) de caspase inflammatoire dans le MDM humain sans compromettre la viabilité et le comportement des cellules, et une approche basée sur l’imagerie pour mesurer l’activation des caspases inflammatoires dans les cellules vivantes.

Visualisation de la proximité induite par les caspases inflammatoires dans les macrophages dérivés des monocytes humains

Ce protocole décrit une méthode complète d’évaluation de l’activation des caspases (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 et caspase-11) en réponse à des modèles in vitro et in vivo (chez la souris) d’infection, d’agressions stériles et de cancer pour déterminer l’initiation des voies de mort cellulaire, telles que la pyroptose, l’apoptose, la nécroptose et la panoptose.

Évaluation de l’activation des caspases pour évaluer la mort des cellules immunitaires innées

Le présent protocole décrit deux méthodes pour mesurer l’activité des caspases à travers un substrat fluorogénique à l’aide de la cytométrie en flux ou d’un spectrofluoromètre.

Mesure de l’activité des caspases à l’aide d’un dosage fluorométrique ou d’une cytométrie en flux

Découvrez un test multiplex Caspase-3/7 pour mesurer l'apoptose dans les neurones hypothalamiques exposés à l'acide palmitique. Cette méthode rapide combine fluorescence et luminescence pour évaluer la viabilité cellulaire.

Utilisation d'un multiplexage Caspase test destiné à déterminer l'apoptose dans une cellule du modèle hypothalamique

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