Utilisation d'un multiplexage Caspase test destiné à déterminer l'apoptose dans une cellule du modèle hypothalamique

L’objectif général de cette vidéo est de démontrer un test multiplex à haut rendement pour déterminer le début de l’apoptose mesurée par la caspase. Trois sept. Tout d’abord, les neurones hypothalamiques sont mis au défi par l’acide gras saturé apoptotique, l’acide palmitique.

Ensuite, la viabilité cellulaire des neurones est mesurée à l’aide d’un réactif fluorescent et d’un lecteur de microplaques après le début de l’apoptose. Le substrat lumino, DEVD, qui est une séquence d’acides aminés clivée par la caspase trois, est ajouté aux cellules. La dernière étape de la procédure consiste à mesurer la luminescence à l’aide d’un lecteur de microplaques pour déterminer l’activité de la caspase, qui augmente dans les cellules en apoptose.

En fin de compte, un rapport d’activité de la caspase par cellules viables peut être obtenu en moins de cinq à six heures. Dans un format de 96 puits. Le principal avantage de cette technique par rapport à nos méthodes existantes, comme les transferts Western ou la lyse, est qu’il s’agit d’un test rapide et peu coûteux qui peut mesurer directement l’activité de la caspase trois sept dans plusieurs formats de puits.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine, telles que la détermination des modulateurs primaires de l’apoptose. L’utilité de cette technique est que ce multiplexage peut être utilisé comme une méthode précise d’évaluation de la cytotoxicité et de la viabilité. Bien que le test soit assez simple, une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car elle garantira que le test sera mené à bien.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la neurodégénérescence, elle peut également être appliquée à d’autres maladies et à des modèles in vitro tels que ceux utilisés dans la recherche sur le cancer. Les personnes qui ne connaissent pas cette méthode devront optimiser cette technique, car les paramètres dépendent des lignées cellulaires et des agonistes. L’activité de la caspase trois sept est transitoire.

Par conséquent, en fonction de l’efficacité du facteur de stress cellulaire, déterminer le moment approprié pour doser l’activité de la base coulée peut prendre un certain effort pour commencer rapidement. Décongeler 12 cellules congelées dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Une fois décongelées, versez doucement les cellules dans un flacon de culture ventilé de 75 centimètres carrés et ajoutez 10 millilitres de delcos chauds, d’aigles modifiés, de milieu ou de DMEM, incubez le flacon pendant la nuit dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius.

Après 24 heures, aspirez le milieu et remplacez-le par un milieu frais peut continuer à développer des cellules jusqu’à ce qu’entre 70 et 80 % de confluence soit obtenu après deux à trois jours de croissance. Pour compter les cellules, d’abord le DMEM chaud et une solution de trypsine, EDTA à 37 degrés Celsius. Aspirez le milieu du ballon et lavez-le deux fois avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate.

Ajoutez 500 microlitres de solution d’essai avant d’incuber à 37 degrés Celsius pendant deux à cinq minutes. Détachez les cellules du ballon à l’aide d’un grattoir et suspendez-les dans cinq millilitres de milieu. Passez les cellules à travers une crépine de cellules dans un tube propre de 50 millilitres.

Il peut être nécessaire de passer les cellules à travers la passoire plus d’une fois, mais ne répétez pas plus de trois fois après avoir compté les cellules à l’aide d’un germe d’hémocytomètre. 6 000 cellules par puits dans une plaque à paroi noire ou blanche à fond transparent de 96 puits dans un volume final de 100 microlitres de milieu, incuber la plaque à 5 % de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Transférez l’acide palmitique dans un flacon en verre stérile de cinq millilitres et solubilisez dans du DMSO à 100 %.

Après avoir dilué la solution mère d’acide palmitique de un à 10 dans du DMSO, ajoutez-la à PREWARM DMEM pour obtenir une concentration finale de travail de 0,1 millimolaire d’acide palmitique pour les milieux témoins, ajoutez la même concentration de DMSO que celle qui a été ajoutée aux milieux contenant de l’acide palmitique. Retirez le média dans chaque puits et remplacez-le par 50 microlitres d’acide moyen plus ou moins tic, et incubez la plaque à 5 % de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ajoutez ensuite cinq microlitres de réactifs de résine et incubez pendant 10 minutes à température ambiante après l’incubation, chargez la plaque sur un lecteur de microplaques multimode et enregistrez la fluorescence à une longueur d’onde d’excitation de 560 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 590 nanomètres.

Pour mesurer la responsabilité cellulaire, les résultats sont présentés sous forme d’unités de fluorescence relatives à la même plaque. Ajoutez 55 microlitres de réactif coulé DEVD et incubez à température ambiante pendant deux heures. Encore une fois, à l’aide du lecteur de microplaques, enregistrez la luminescence pour mesurer l’activité de la caspase trois sept, les résultats sont présentés sous forme d’unités de luminescence relatives, la luminescence étant directement proportionnelle à la caspase trois sept pour normaliser l’activité de la caspase trois sept au nombre de cellules, divisez la viabilité cellulaire par l’activité de la caspase trois sept.

Ce protocole décrit les résultats du multiplexage de deux tests distincts pour déterminer les mécanismes de mort cellulaire par apoptose. L’activité de la caspase a été significativement augmentée dans les cellules soumises à l’acide palmitique. Après deux heures d’incubation, l’intégrité de la membrane cellulaire est visiblement altérée en présence d’acide palmitique.

La voie potentielle par laquelle l’acide palmitique induit l’apoptose est montrée ici. Comprendre les mécanismes sous-jacents du facteur de stress utilisé pour induire l’apoptose aide à déterminer la durée d’incubation du facteur de stress. Étant donné que les enzymes caspases doivent être activées avant d’interagir avec le substrat DEVD Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de cinq à six heures si elle est exécutée correctement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un test d’activité multiplex de la caspase trois sept à l’aide d’un modèle de culture cellulaire neuronale hypothalamique in vitro. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les temps d’incubation dépendent des types de cellules et des facteurs de stress ou agonistes utilisés. Le développement de cette technique permet aux chercheurs dans le domaine des neurosciences d’utiliser une technique fiable et rapide pour les études apoptotiques. Suite à cette procédure, des tests pharmacologiques supplémentaires ciblant des protéines spécifiques dans le processus apoptotique peuvent être effectués afin de délimiter les mécanismes sous-jacents qui initient les maladies dégénératives.