Utilisation d'un multiplexage Caspase test destiné à déterminer l'apoptose dans une cellule du modèle hypothalamique

L'objectif général de cette vidéo est de démontrer un dosage multiplex à haut débit permettant de déterminer le début de l'apoptose mesuré par la caspase 3/7. Dans un premier temps, des neurones hypothalamiques sont exposés à l'acide gras saturé inducteur d'apoptose, l'acide palmitique.

Ensuite, la viabilité cellulaire des neurones est mesurée à l’aide d’un réactif basé sur la fluorescence et d’un lecteur de microplaques, après l’induction de l’apoptose. Le substrat luminescent DEVD, qui correspond à une séquence d’acides aminés clivée par la caspase-3, est ajouté aux cellules. La dernière étape du protocole consiste à mesurer la luminescence à l’aide d’un lecteur de microplaques afin de déterminer l’activité de la caspase, qui augmente dans les cellules en cours d’apoptose.

En fin de compte, un ratio d'activité de la caspase par cellule viable peut être obtenu en moins de cinq à six heures, dans un format de plaque de 96 puits. Le principal avantage de cette technique par rapport à nos méthodes existantes, telles que les immunobuvards ou la lyse, réside dans le fait qu'il s'agit d'un dosage rapide et peu coûteux permettant de mesurer directement l'activité des caspases 3 et 7 dans différents formats multi-puits.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine, comme l'identification des modulateurs primaires de l'apoptose. L'utilité de cette technique réside dans le fait que ce multiplexage peut être utilisé comme une méthode précise d'évaluation de la cytotoxicité et de la viabilité. Bien que le dosage soit relativement simple, une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car elle garantit que le dosage sera mené à bien avec succès.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la neurodégénérescence, elle peut également être appliquée à d'autres maladies et modèles in vitro, comme ceux utilisés dans la recherche sur le cancer. Les personnes novices dans cette méthode devront optimiser cette technique, car les points terminaux dépendent de la lignée cellulaire et de l'agoniste. L'activité de la caspase 3/7 est transitoire.

Par conséquent, selon l'efficacité du facteur de stress cellulaire, déterminer le moment approprié pour évaluer l'activité de base des casts peut nécessiter quelques efforts. Pour commencer rapidement, décongeler des cellules congelées de 12 dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius. Une fois décongelées, transférer délicatement les cellules dans un flacon de culture ventilé de 75 centimètres carrés et ajouter 10 millilitres de milieu Delcos modifié de Eagle, ou DMEM, préchauffé. Incuber le flacon toute la nuit dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius.

Après 24 heures, aspirez le milieu et remplacez-le par du milieu frais ; poursuivez la culture des cellules jusqu'à ce qu'une confluence comprise entre 70 et 80 % soit obtenue après deux à trois jours de croissance. Pour compter les cellules, préchauffez d'abord le DMEM et la solution de trypsine-EDTA 1 x à 37 degrés Celsius. Aspirez le milieu du flacon et rincez deux fois avec du tampon salin phosphate stérile.

Ajouter 500 microlitres de solution de trypsine avant d'incuber à 37 degrés Celsius pendant deux à cinq minutes. Détacher les cellules du flacon à l’aide d’un racloir et suspendre les cellules dans cinq millilitres de milieu. Faire passer les cellules à travers un filtre cellulaire dans un tube propre de 50 millilitres.

Il peut être nécessaire de faire passer les cellules à travers le filtre plus d'une fois, mais ne pas répéter plus de trois fois après avoir compté les cellules à l'aide d'une cellule de comptage hématologique. Ensemencer 6 000 cellules par puits dans une plaque de 96 puits à fond transparent et parois noires ou blanches, dans un volume final de 100 microlitres de milieu. Incuber la plaque à 5 % de dioxyde de carbone et à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Transférer l'acide palmitique dans un flacon en verre stérile de cinq millilitres et le solubiliser dans du DMSO à 100 %.

Après avoir dilué la solution mère d'acide palmitique au ratio de un pour dix dans le DMSO, ajoutez-la au DMEM PRÉALABLEMENT ÉCHAUFFÉ afin d'obtenir une concentration finale de travail de 0,1 millimolaire en acide palmitique pour le milieu témoin ; ajoutez au milieu la même concentration de DMSO que celle ajoutée aux milieux contenant l'acide palmitique. Retirez le milieu de chaque puits et remplacez-le par 50 microlitres de milieu avec ou sans acide tic, puis incubez la plaque à 5 % de dioxyde de carbone et à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ajoutez ensuite cinq microlitres de réactifs de résine et incubez pendant 10 minutes à température ambiante. À l'issue de l'incubation, placez la plaque sur un lecteur de microplaque multimode et enregistrez la fluorescence à une longueur d'onde d'excitation de 560 nanomètres et une longueur d'onde d'émission de 590 nanomètres.

Pour mesurer la viabilité cellulaire, les résultats sont présentés en unités de fluorescence relative par rapport à la même plaque. Ajoutez 55 microlitres de réactif DEVD-afc et incubez à température ambiante pendant deux heures. En utilisant à nouveau le lecteur de microplaques, enregistrez la luminescence afin de mesurer l'activité de la caspase-3/7 ; les résultats sont exprimés en unités de luminescence relative, la luminescence étant directement proportionnelle à l'activité de la caspase-3/7. Pour normaliser l'activité de la caspase-3/7 au nombre de cellules, divisez la viabilité cellulaire par l'activité de la caspase-3/7.

Ce protocole décrit les résultats obtenus en multiplexant deux tests distincts afin de déterminer les mécanismes de mort cellulaire par apoptose. L'activité des caspases a augmenté de manière significative dans les cellules exposées à l'acide palmitique. Après deux heures d'incubation, l'intégrité de la membrane cellulaire est visiblement altérée en présence d'acide palmitique.

Voici le chemin potentiel par lequel l'acide palmitique induit l'apoptose. Comprendre les mécanismes sous-jacents du stressor utilisé pour induire l'apoptose aide à déterminer la durée d'incubation du stressor. Étant donné que les enzymes caspases doivent être activées avant d'interagir avec le substrat DEVD, une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de cinq à six heures si elle est effectuée correctement.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser un dosage d'activité multiplex des caspases 3 et 7 en utilisant un modèle de culture cellulaire neuronale hypothalamique in vitro. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que les durées d'incubation dépendent des types cellulaires ainsi que des stress ou agonistes utilisés. Le développement de cette technique permet aux chercheurs en neurosciences d'utiliser une méthode fiable et économique en temps pour les études d'apoptose. Après cette procédure, d'autres dosages pharmacologiques ciblant des protéines spécifiques du processus apoptotique peuvent être réalisés afin de préciser les mécanismes sous-jacents à l'initiation des maladies dégénératives.