En utilisant l'ARN interférence pour étudier la réponse immunitaire innée dans les macrophages de souris

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser l'interférence ARN pour étudier l'effet de gènes candidats sur la réponse immunitaire innée. Pour ce faire, des lignées cellulaires de macrophages murins sont trypséisées et combinées à une solution de transfection contenant les ARNsi d'intérêt. Le mélange est ensuite transféré dans une plaque 96 puits Nucleo VETE, et un système de transfection 96 puits Maxa est utilisé pour introduire l'ARNsi dans les macrophages. Après une incubation avec le milieu de culture cellulaire, des activateurs de l'immunité innée tels que le LPS ou d'autres agents sont ajoutés aux macrophages transfectés afin de les stimuler. Enfin, des ELISA sont réalisés pour mesurer la production de cytokines et évaluer l'effet du traitement par ARNsi sur la réponse immunitaire innée.

L'avantage principal de cette technique par rapport à la transfection médiée par des lipides est que notre test est robuste et peut être appliqué à de nombreux gènes dans un cadre de production à haut débit. La clé de cette méthode consiste à travailler avec des cellules saines, à les manipuler délicatement et à agir efficacement durant le processus de transfection. Comme nous le démontrerons, ce protocole utilise la lignée cellulaire de macrophages murins brute 2 64 0.7, cultivée comme décrit dans le document accompagnant.

En prévision de la plaque pour la transfection INA, les cellules doivent être à une confluence de 20 % et être cultivées un ou deux jours jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence maximale de 80 %. Il est important de se rappeler d'utiliser des cellules comprises entre les passages trois et dix. Après décongélation, commencer cette procédure en programmant le système 96 puits Shuttle qui sera utilisé pour la transfection.

Pour ce faire, lancez le logiciel de transfert 96 puits sur l'ordinateur connecté au dispositif de transfert à partir du menu Fichier situé en haut à gauche. Sélectionnez un nouveau fichier de paramètres. Sélectionnez les puits qui seront transfectés sur le schéma de la plaque 96 puits affiché.

Une boîte verte indiquera les puits sélectionnés. Choisissez le programme correspondant à la lignée cellulaire de macrophages utilisée pour les cellules brutes 2 64 0,7. Sélectionnez DS 1 36, puis cliquez sur Appliquer.

Remarquez que, après avoir sélectionné un programme, les puits sur le schéma de la plaque seront colorés. Les cercles vides bleu foncé indiquent les puits qui n'ont pas été attribués à un programme et qui ne seront pas soumis à un choc électrique. Ensuite, préparez la solution efficace de travail en mélangeant la solution efficace pour ligne cellulaire SF en plaque de 96 puits avec la totalité du contenu du tube de supplément fourni.

Laisser les réactifs mélangés équilibrer à température ambiante. Réchauffer le D-M-E-M-R-P-M-I 1640, la trypsine 0,25 % EDTA et le PBS à 37 degrés Celsius. Préparer le plasmide témoin S-I-R-N-A-P max GFP expérimental ou les ARNi marqués de façon fluorescente en les décongelant sur de la glace afin de détacher les macrophages adhérents des boîtes de culture cellulaire.

Aspirez le milieu et lavez les cellules deux fois avec 10 millilitres de PBS. Ensuite, après avoir retiré le PBS, incubez les cellules avec un millilitre de trypsine 0,25 % EDTA préchauffée par plaque jusqu'à ce que les cellules commencent à se détacher. Cette étape prend de une à deux minutes.

Tapotez doucement la plaque et agitez la solution pendant l'incubation afin d'optimiser la trypsination. Une fois les cellules détachées, ajoutez neuf millilitres de DMEM additionné de mélange de FBS en pipetant doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas, puis récupérez les cellules par pipetage dans un tube stérile. Comptez le nombre de macrophages isolés à l’aide d’un hémacytomètre.

Prévoir environ 10 millions de macrophages par plaque de 10 centimètres. Calculer le nombre total de macrophages nécessaires, sachant que chaque puits de la plaque de 96 puits nécessite 200 000 cellules. Prélever au micropipette le nombre calculé de cellules dans un tube de centrifugation.

Faire centrifuger les cellules pendant 10 minutes à 150 G à température ambiante vers une plaque stérile de 96 puits à fond rond, ce qui facilite le mélange tout en minimisant la perte de réactif. Ajouter deux microlitres de chaque ARNi dans chaque puits à transfecter. Remarque : selon le nombre d'ARNi, cette étape peut être réalisée pendant la centrifugation des macrophages.

Le point le plus délicat de cette procédure est l'électroporation ; les points clés consistent à manipuler les cellules très délicatement et à travailler très rapidement. Une fois les cellules placées dans une solution de transfection toxique, aspirez le milieu après centrifugation des cellules, puis resuspendez-les délicatement dans la solution nucléofector contenant la solution de supplément SF.

Transférez immédiatement les cellules dans une cuvette stérile à l’aide d’une pipette multipuce, en transférant 20 microlitres du mélange cellulaire resuspendu dans chaque puits de la plaque 96 puits contenant les ARNsi, puis mélangez délicatement par aspiration et expulsion répétées. Ensuite, transférez 20 microlitres du mélange cellulaire INA dans la plaque nucleo vete 96 puits. Il est essentiel d’éviter la formation de bulles lors de cette étape, car cela pourrait induire des erreurs durant la nucléofection.

Après avoir placé tous les échantillons expérimentaux dans la plaque de transfection, couvrez-la avec le couvercle fourni et tapez très doucement sur une surface dure. Pour éliminer les bulles d'air, placez la plaque 96 puits dans le module d'insertion 96 puits du nucleo effector shuttle, puis en bas à droite de l'écran du programme, sélectionnez « télécharger et démarrer ». Suivez ensuite les instructions à l'écran pour enregistrer les résultats pendant le processus de nucléofection dans les puits avec succès.

Les puits transfectés seront représentés sur le schéma de la plaque 96 puits à l'écran par un cercle vert avec un signe plus. Un cercle rouge avec un signe moins indique une erreur, probablement due à la présence de bulles ou à un volume incorrect de réactifs pipetté juste après la nucléofection. Utilisez une pipette multicanal pour ajouter 80 microlitres de RPMI 1640 préchauffé.

Ajouter le milieu lentement sur le côté de chaque puits, en laissant le milieu se mélanger progressivement avec les cellules transfectées, qui sont très fragiles à ce stade. Ajouter le milieu trop rapidement réduirait fortement la viabilité.

Placer la plaque de 96 puits contenant les échantillons transfectés et le RPMI 1640 dans une étuve à 37 degrés Celsius avec 5 %CO2 pendant deux minutes ou plus. Il est essentiel de permettre aux cellules de se rétablir avant toute manipulation ultérieure. Après avoir retiré la plaque de l’étuve, utiliser une pipette multipipette pour transférer soigneusement le mélange de chaque puits vers une plaque de culture tissulaire de 96 puits.

Ensuite, à l’aide de la pipette multicanal, ajoutez 100 microlitres de DMEM avec du SFB à chaque puits. Incubez pendant 24 à 36 heures, puis réalisez immédiatement après la transfection et la récupération une cytométrie en flux. Pour évaluer l’efficacité de la transfection des siARN marqués de façon fluorescente, plus de 99 % des cellules doivent être transfectées le jour suivant la transfection. Pour l’efficacité de la transfection du plasmide GFP, 30 à 50 % des cellules doivent exprimer GFP. À l’issue de l’incubation de 24 à 36 heures, préparez le LPS ou d’autres activateurs de l’immunité innée dans du milieu frais, en diluant le LPS à une concentration finale de 20 nanogrammes par millilitre dans du DMEM avec du SFB.

Ensuite, aspirez soigneusement le milieu de la plaque 96 puits et ajoutez le milieu frais contenant le LPS aux cellules. Placez la plaque dans un incubateur afin de surveiller la réponse au LPS ou à d'autres stimulateurs de l'immunité innée à différents moments après la stimulation. Prélevez le surnageant des cellules à l’aide d’une pipette et transférez-le dans une plaque de stockage 96 puits pour analyse par Eliza.

Après avoir éliminé le surnageant pour surveiller la viabilité cellulaire, ajouter 100 microlitres d'un mélange de diacétate de fluorescéine dilué au 1/100 dans du PBS dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant une à cinq minutes. Surveiller la fluorescence dans les cellules à l'aide d'un lecteur de plaques, la fluorescence apparaissant suite au clivage par les estérases cellulaires dans les cellules vivantes. Ce composé devient fluorescent, illustrant ainsi l'utilité de cette approche pour le suivi de la réponse immunitaire innée.

Des ARNsi ciblant des gènes régulateurs connus de l'immunité innée ont été transfectés dans la lignée cellulaire macrophagique RAW 264.7. Les cellules ont ensuite été stimulées par le LPS et la production des cytokines pro-inflammatoires IL-6 et TNF-α a été mesurée par ELISA, comme indiqué ici.

Inhibition du récepteur de type Toll quatre, le récepteur du LPS, mais pas des autres TLR. À l'aide de SIR, une production fortement réduite de l'IL six et du TNF alpha induits par le LPS. Remarquez que l'inhibition de l'IL six par ARNi diminue la production d'IL six, mais n'affecte pas la production de TNF alpha.

Ces données suggèrent une bonne efficacité et une bonne spécificité du silençage ARNi des régulateurs candidats de l'immunité innée. Il est important de garder à l'esprit que la clé d'un bon transfert et d'une bonne récupération cellulaire réside dans l'utilisation de cellules très saines, qu'il faut manipuler délicatement pendant les procédures de transfection et de récupération, et travailler rapidement une fois les cellules placées dans une solution nucléaire effector. Après avoir suivi cette procédure, de nombreux autres tests peuvent être réalisés, notamment la PCR quantitative pour surveiller le silençage génique et de nombreux autres essais destinés à étudier la réponse immunitaire innée.