Name: En utilisant lARN interférence pour étudier la réponse immunitaire innée dans les macrophages de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Découvrez la transfection d'ARN interférence dans les macrophages murins pour étudier la réponse immunitaire innée. Cette méthode utilise le système Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle et permet une analyse à haut débit des gènes candidats.

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Merci à Brad Lackford pour son aide dans l’optimisation de certaines des techniques décrites dans ce manuscrit.

1. Entretien de lignées cellulaires de macrophages <ol><li> Cultiver RAW264.7 et des lignées de cellules J774A.1 dans du DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C en présence de 5% de CO 2. Pour aider à maintenir la stérilité, ajouter 1% de pénicilline / streptomycine (pénicilline / streptomycine) aux médias (bien que ce ne soit pas strictement nécessaire). </li><li> Étape critique: Veiller à ce que les macrophages sont de plus en plus dans un état ​​sain pour la transfection efficace et knockdown gène siRNA induite. Utiliser des cellules entre passages 3 et 10 après décongélation frais, comme ces lignes de macrophages présentent la meilleure efficacité de la transfection et maintenir robuste survie post-transfection à ce stade; ne pas utiliser un numéro de passage plus élevé (&gt; 20), que l&#39;efficacité de la transfection et gène Knockdown fois diminuent considérablement. </li><li> Pour optimiser la transfection de siRNA, les cellules des plaques à 20% de confluence et les poussent un ou deux jours jusqu&#39;à ce que les cellules atteignent pas plus de 80% de confluence. Cellules envahies ne transfecter efficiently. </li></ol> 2. Programmation du système de navette à 96 puits pour la transfection <ol><li> Lancez le logiciel de navette de 96 puits sur l&#39;ordinateur connecté à la navette. Sélectionnez nouveau fichier de paramètres dans le menu en haut à gauche du fichier. </li><li> Mettez en surbrillance les puits qui seront transfectées sur le affichée plaque de 96 puits schématique. Une boîte verte indique que les puits sont sélectionnés. </li><li> Sélectionnez le programme qui correspond à la lignée cellulaire de macrophages utilisé (DS-136 pour RAW264.7 ou DS-130 pour J774A.1) et sélectionnez Appliquer, située en dessous de la plaque de 96 puits schématisé. Notez que, après la sélection d&#39;un programme, les puits de la plaque schématique seront colorés en bleu foncé. Cercles vides indiquent puits qui ne sont pas attribués un programme et ne seront pas choqués. </li></ol> 3. Préparation des réactifs pour la transfection <ol><li> Préparer la solution de travail Nucleofector ™ en mélangeant SF lignée cellulaire de 96 puits solution Nucleofector ™avec la totalité du contenu du tube en supplément joint. Laisser les réactifs mixtes à équilibrer à température ambiante avant de l&#39;utiliser. Stocker l&#39;excès de solution complète Nucleofector ™ à 4 ° C pendant 3 mois pour une utilisation future. </li><li> Préchauffer la solution saline DMEM, RPMI-1640, 0,25% de trypsine / EDTA, et tamponnée au phosphate (PBS) à 37 ° C avant de préparer les macrophages pour la transfection. </li><li> Préparer le siRNA pour la transfection par la fonte de la glace. Afin de minimiser le nombre des dégels gel du siRNA, geler de nouveaux siRNA en aliquots la première fois qu&#39;ils sont utilisés. </li><li> Dans les premières expériences, utiliser siRNA à une dose relativement élevée de 2 pm (01:10 dilué de 20 pm stocks). Titrer la suite siRNA gène qui induisent robuste démontable vers le bas à des doses plus faibles, bien que des doses plus élevées sont nécessaires en général pour effet de choc efficace de gènes dans des macrophages par rapport à d&#39;autres types de cellules. NOTE: siRNA sont disponibles à partir de nombreuses sources; assez robuste knockdown de gène peut être obtenuutilisant SmartPools de siGenome, qui sont les piscines de quatre siRNA ciblant chaque gène. Comme témoin négatif, utiliser l&#39;une des diverses piscines non-ciblage siRNA ou siRNA. </li><li> Pour contrôler l&#39;efficacité de transfection, transfecter soit le plasmide contrôle pmaxGFP (fourni dans le kit Amaxa) ou siRNA marqués par fluorescence en parallèle avec les siRNA expérimentales. Expect 30 à 50% de la transfection de plasmide GFP (analysé par cytométrie en flux ou microscopie jours après la transfection) et&gt; 99% de transfection de siRNA marqué par fluorescence (analysé par cytométrie de flux, immédiatement après la transfection et la récupération). </li></ol> 4. Préparer les macrophages pour la transfection <ol><li> Détachez les macrophages adhérents des boîtes de culture cellulaire par traitement à la trypsine. Aspirer les médias et laver les cellules deux fois avec 10 ml de PBS. Après avoir enlevé le PBS, incuber les cellules avec préchauffé 0,25% de trypsine / EDTA (1 ml / 10 cm plaque) pendant 1-2 min jusqu&#39;à ce que les cellules commencent à se détacher. Tapoter légèrement la plaque et déplacer la solution lors de l&#39;incubation de maximiser la trypsine. </li><li> Après l&#39;incubation, ajouter 9 ml de milieu DMEM + FBS, mélanger doucement de haut en bas, et de recueillir les cellules par pipetage dans un tube stérile. </li><li> Comptez le nombre de macrophages isolés à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre. Attendez environ 10 millions de macrophages par 10 cm plaque. Calculer le nombre total de macrophages nécessaires; chaque puits sur la navette 96 puits nécessite 200 000 cellules. Pensez à ajouter la valeur des cellules de quelques puits supplémentaires de cas de pertes de pipetage. </li><li> Pipeter le nombre calculé de cellules dans un tube de centrifugation. Centrifuger les cellules pendant 10 min à 150 x g à température ambiante. Ne pas centrifuger trop rapidement car cela diminue la santé des macrophages et l&#39;efficacité de la transfection. </li></ol> 5. nucléofection de macrophages avec siRNA <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un plaque de 96 puits à fond rond stérile (qui facilite le mélange tout en minimisant la perte de réactif), ajouter 2 pi de chaque siRNA à chaque puits pour être transfète. Remarque: En fonction du nombre de siRNA, ceci peut être réalisé au cours de l&#39;étape de centrifugation des macrophages. </li><li> Aspirer les médias à partir des cellules centrifugés. Resuspendre doucement les cellules de solution Nucleofector ™ SF (contenant la solution de complément), en utilisant 20 pi par 200 000 cellules sédimentées. Une fois remis en suspension, utiliser les cellules immédiatement pour la transfection optimale. </li><li> Transfert cellules remises en suspension dans une cuve stérile; à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux, le transfert de 20 pl du mélange de cellules remis en suspension dans chaque puits de la plaque à 96 puits contenant le siRNA. Mélanger doucement par aspiration et refoulement. </li><li> Transférer 20 pl du mélange de cellules / siRNA dans la plaque à 96 puits Nucleocuvette ™ étape critique:. Éviter de générer des bulles lors de l&#39;étape de transfert, car cela peut provoquer des erreurs durant nucléofection. </li><li> Après avoir placé tous les échantillons expérimentaux dans la plaque de transfection, couvrir la plaque de 96 puits avec le couvercle fourni, very touchez doucement sur une surface dure pour éliminer les bulles à partir des échantillons. </li><li> Placer la plaque de 96 puits avec couvercle dans le 96 puits navette Nucleofector et sélectionnez «télécharger et démarrer &#39;en bas à droite de l&#39;écran du programme. Avant nucléofection, suivez l&#39;invite de programme pour enregistrer les résultats. Remarque: Durant le processus nucléofection, puits transfectées avec succès seront représentés sur le 96 bien schématique à l&#39;écran par un cercle vert avec un signe plus. Un cercle rouge avec un signe moins indique une erreur, probablement en raison de bulles ou mal pipetage le volume correct de réactifs. </li></ol> 6. Récupération et placage de macrophages <ol><li> Immédiatement après nucléofection, à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux, ajouter 80 ul de pré-chauffé (37 ° C) RMP1-1640 médias à chaque puits. Ajouter les médias sur le côté de chaque puits, permettant aux médias de mélanger lentement avec les cellules transfectées, qui sont très délicat à ce stade. Ne pas ajouter les médias trop vite, comme cette volontédiminuer considérablement la viabilité. </li><li> Placer les plaques à 96 puits et transfectées avec des échantillons du milieu RPMI-1640 dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 2 min; ce qui est essentiel pour permettre aux cellules de se rétablir avant une autre manipulation. </li><li> Retirer la plaque à 96 puits à partir de l&#39;incubateur et de les transférer avec précaution le mélange à partir de chaque puits dans une plaque de culture tissulaire à 96 puits en utilisant une pipette multicanaux. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 100 ul de pré-chauffé (37 ° C) du milieu DMEM + FBS à chaque puits. </li><li> Incuber le 96 et le tissu plaque de culture avec des échantillons dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 24-36 heures (optimiser le moment exact de siRNA individuels, bien que cette plage de temps fonctionne généralement bien). </li></ol> 7. La stimulation des macrophages avec LPS <ol><li> Après le 24-36 h post-nucléofection incubation, préparer LPS (ou autre PAMP) dans un milieu frais. Préparer suffisamment milieu frais pour tous les puits (200 pi media / puits de la plaque de 96 puits et un peu plus de pipetage). Diluer le LPS à une concentration finale de 20 ng / ml dans du DMEM + FBS. </li><li> Médias aspirer délicatement de la plaque de 96 puits et ajouter les milieux frais contenant les LPS aux cellules. </li><li> Surveiller la réponse au LPS ou d&#39;autres PAMP à divers moments après la stimulation. 6 heures est suffisante pour générer une réponse de cytokine inflammatoire robuste pour des cytokines telles que l&#39;IL-6 ou TNF. </li></ol> 8. Suivi de la réponse immunitaire innée induite, Gene Knockdown, et la viabilité dans les macrophages <ol><li> Pour surveiller induite par le LPS production de cytokines, pipeter le surnageant des cellules dans une plaque de 96 puits de stockage. La production de cytokine peut être ensuite mesurée par ELISA. </li><li> Une fois que le surnageant est éliminé, surveiller la viabilité des cellules en utilisant le diacétate de fluorescéine (lorsqu&#39;il est clivé par des estérases cellulaires dans les cellules vivantes, ce composé est fluorescent). Identifier les siRNA ciblant les gènes qui contrôlent la viabilité des cellules en utilisant tson approche. Remarque: le processus de transfection lui-même devrait avoir peu d&#39;effet sur la viabilité si elle est effectuée correctement. <ol><li> Ajouter diacétate de fluorescéine (5 mg / ml dans de l&#39;acétone actions) à chaque puits (1: 100 dilution finale dans du PBS). </li><li> Incuber à température ambiante pendant une à cinq minutes, puis surveiller la fluorescence dans les cellules en utilisant un lecteur de plaque (460 nm d&#39;excitation, 515 nm émission). </li><li> Facultatif: Pour veiller à ce que la fluorescence dans les puits est uniforme, la lyse des cellules en utilisant des tampons tels que RIPA; cela fournit un signal fluorescent uniforme dans le puits, comme certains lecteurs de plaques sont configurés pour surveiller seulement une petite partie du puits; si les cellules ne sont pas étalées uniformément, le diacétate de fluorescéine pourrait donner une lecture inexacte. </li></ol></li><li> Comme alternative à la surveillance de la viabilité cellulaire, contrôler gène induite par le siRNA-knockdown par qPCR en utilisant l&#39;ARN provenant des cellules adhérentes. <ol><li> Après que le surnageant est séparé des cellules (étape 8.1 ci-dessus), annonced tampon RLT (qui est utilisé pour la lyse et la préservation de l&#39;ARN) directement aux cellules adhérentes de les lyser. </li><li> Isoler l&#39;ARN en utilisant un kit de préparation d&#39;ARN tels que le mini-kit RNeasy, et en utilisant qPCR avec des amorces spécifiques d&#39;un gène par rapport au gène surveiller démontable pour contrôler le traitement des siRNA. Utilisez amorces à Βactin ou GAPDH pour la normalisation. </li></ol></li><li> Comme autre alternative à surveiller d&#39;autres aspects de la réponse immunitaire innée, surveiller la capacité phagocytaire des macrophages par l&#39;addition marqué au FITC E. particules coli directement sur ​​les cellules adhérentes en utilisant un kit. Suivant le protocole du fabricant, qui ne prend que quelques heures, contrôler l&#39;absorption phagocytaire utilisant un lecteur de plaque ou microscopie. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents. Cet article a été parrainé par Lonza, Inc.

De nombreuses études ont été publiées dans lequel les gènes individuels ont été pris pour cible par siRNA dans les macrophages murins. Bien que la transfection médiée par des lipides a été utilisé pour fournir des siRNA pour les lignées de cellules macrophages sur une base individuelle, ces méthodes souffrent des effets potentiels sur la viabilité, knock-down de gènes limitée, et la variabilité du gène à gène. Pour développer des tests plus robustes qui pourraient être utilisés pour cibler les gènes de la mode à moyen o...

Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes efficaces pour inhiber des gènes dans des lignées cellulaires de macrophages de souris à l&#39;aide de siRNA et de surveiller les effets de ces traitements sur la réponse immunitaire innée. Ces procédures sont effectuées en format 96 puits, permettant écrans ARNi de la mode à moyen ou haut débit. En réponse à une infection, l&#39;homme une réponse immunitaire innée immédiate et une réponse immunitaire adaptative plus lente mais plus précise. Cette réponse immunitaire innée rapide comprend le recrutement et l&#39;activation des cellules immunitaires innées, y compris les macrophages phagocytaires 1. Macrophages activées de façon classique sont impliquées dans les réponses inflammatoires aiguës et produisent des protéines antimicrobiennes et composés, les cytokines et les chimiokines, et les antigènes présents 2,3. Macrophages activés alternativement jouent un rôle dans la régulation de l&#39;immunité, le maintien de la tolérance, la réparation des tissus, cicatrisation des plaies et 4-8. En raison de leur large éventail de fonctions, Les macrophages peuvent jouer un rôle dans de nombreuses maladies, y compris l&#39;athérosclérose, l&#39;arthrite, le cancer et 9. Ainsi, l&#39;étude des macrophages a été un élément clé de la recherche depuis un certain temps dans une grande variété de domaines des maladies. En dépit de leur importance dans la réponse immunitaire innée, les macrophages peut être difficile de travailler avec des cellules. En particulier, il est difficile d&#39;obtenir une transfection efficace en utilisant des réactifs lipidiques dans les macrophages sans toxicité associée 10,11. En outre, même lorsque le siRNA est rendu efficace à des macrophages, la robustesse de gène induite par ARNi démontable peut être assez souvent modérée et peut varier d&#39;un gène à gène. Pour remédier à ces difficultés techniques, nous avons optimisé la transfection et des techniques knockdown 12-16 dans deux lignées de cellules de type macrophage de souris, RAW264.7 17 et 18 J774A.1. Cette approche utilise la 96 puits système de navette Amaxa Nucleofector pour la transfection; ce systèmeutilise une combinaison de réactifs spécialisés et l&#39;électroporation pour transfecter des cellules dans un format à 96 puits 19. Après la transfection, on décrit des procédés pour optimiser la récupération et la viabilité cellulaire et de maximiser la suite gène induite par effet de choc de siRNA. Pour illustrer l&#39;utilité de cette approche, nous décrivons un protocole de délivrance d&#39;ARNi de ces lignées de cellules macrophages, stimuler ces cellules avec du lipopolysaccharide (LPS) et contrôler la réponse immunitaire innée à l&#39;échelle de la production de plusieurs cytokines pro-inflammatoires. Nous fournissons des données de l&#39;échantillon dans lequel nous ciblons la famille des récepteurs Toll-like (TLR), dont les membres sentir LPS et autres motifs moléculaires de pathogènes associés (PAMP), pour réguler l&#39;immunité innée.

<table><tbody><tr><td>Amaxa nucleofector 96-well shuttle system</td><td>Lonza</td><td>AAM-1001S</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit</td><td>Lonza</td><td>V4SC-2096</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 lignée cellulaire de macrophage de souris</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 lignée cellulaire de macrophage de souris</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td></td></tr><tr><td>siGenome smartpool siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>varie en fonction de sur le gène</td><td></td></tr><tr><td>Pool de siRNA de contrôle non ciblé</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-13-20</td><td></td></tr><tr><td>Oligo fluorescent Block-iT pour l’électroporation</td><td>Invitrogen</td><td>13750062</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure E. coli O111 :B4</td><td>LPS List Biological Laboratories</td><td>421</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, haute teneur en glucose</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pénicilline-streptomycine (Pen/Streptocoque)</td><td>Fisher</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>plaques de culture tissulaire à 96 puits</td><td>Fisher</td><td>07-200-89 &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Plaques stériles à fond rond à 96 puits (non revêtues)</td><td>Fisher</td><td>07-200-745</td><td></td></tr><tr><td>Souris IL-6 Duoset Kit ELISA</td><td>R& D Biosystems</td><td>DY406</td><td></td></tr><tr><td>Souris TNF&alpha ; Duoset ELISA kit</td><td>R& D Biosystems</td><td>DY410</td><td></td></tr><tr><td>Diacétate de fluorescéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7378</td><td></td></tr><tr><td>Tampon RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant Kit de dosage de la phagocytose</td><td>Invitrogen</td><td>V-6694</td><td></td></tr></tbody></table>

en utilisant l&#39;arn interférence pour étudier la réponse immunitaire innée dans les macrophages de souris

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Les macrophages sont des cellules immunitaires innées phagocytaires clés. Lorsque les macrophages rencontrent un agent pathogène, ils produisent des protéines et des composés antimicrobiens pour tuer l’agent pathogène, produisent diverses cytokines et chimiokines pour recruter et stimuler d’autres cellules immunitaires, et présentent des antigènes pour stimuler la réponse immunitaire adaptative. Ainsi, être capable de manipuler efficacement les macrophages avec des techniques telles que l’interférence ARN (ARNi) est essentiel à notre capacité à étudier cette importante cellule immunitaire innée. Cependant, les macrophages peuvent être techniquement difficiles à transfecter et peuvent présenter une inactivation inefficace des gènes induits par l’ARNi. Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes pour transfecter efficacement deux lignées cellulaires de macrophages de souris (RAW264.7 et J774A.1) avec des siRNA à l’aide du système de navette à 96 puits Amaxa Nucleofector et décrivons des procédures pour maximiser l’effet des siRNA sur l’inactivation des gènes. De plus, les méthodes décrites sont adaptées pour fonctionner au format 96 puits, ce qui permet des études à moyen et haut débit. Pour démontrer l’utilité de cette approche, nous décrivons des expériences qui utilisent l’ARNi pour inhiber les gènes qui régulent la production de cytokines induite par les lipopolysaccharides (LPS).

Pour démontrer l&#39;efficacité de la transfection en utilisant cette approche, nous avons suivi l&#39;absorption de FITC marqué siRNA l&#39;aide d&#39;un cytomètre de flux (Figure 1). Pour illustrer l&#39;utilité de notre approche pour le suivi de la réponse immunitaire innée, nous avons transfecté siRNA ciblant des gènes de régulation de l&#39;immunité innée connus dans la lignée cellulaire de macrophages RAW264.7, stimulé les cellules avec LPS, puis surve...

Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes pour transfecter efficacement des lignées cellulaires de macrophages murins avec des siRNA à l’aide du système de navette Amaxa Nucleofector à 96 puits, stimuler les macrophages avec des lipopolysaccharides et surveiller les effets sur la production de cytokines inflammatoires.

En utilisant l&#39;ARN interférence pour étudier la réponse immunitaire innée dans les macrophages de souris

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser l'interférence ARN pour étudier l'effet de gènes candidats sur la réponse immunitaire innée. Pour ce faire, des lignées cellulaires de macrophages murins sont trypséisées et combinées à une solution de transfection contenant les ARNsi d'intérêt. Le mélange est ensuite transféré dans une plaque 96 puits Nucleo VETE, et un système de transfection 96 puits Maxa est utilisé pour introduire l'ARNsi dans les macrophages. Après une incubation avec le milieu de culture cellulaire, des activateurs de l'immunité innée tels que le LPS ou d'autres agents sont ajoutés aux macrophages transfectés afin de les stimuler. Enfin, des ELISA sont réalisés pour mesurer la production de cytokines et évaluer l'effet du traitement par ARNsi sur la réponse immunitaire innée.L'avantage principal de cette technique par rapport à la transfection médiée par des lipides est que notre test est robuste et peut être appliqué à de nombreux gènes dans un cadre de production à haut débit. La clé de cette méthode consiste à travailler avec des cellules saines, à les manipuler délicatement et à agir efficacement durant le processus de transfection. Comme nous le démontrerons, ce protocole utilise la lignée cellulaire de macrophages murins brute 2 64 0.7, cultivée comme décrit dans le document accompagnant.En prévision de la plaque pour la transfection INA, les cellules doivent être à une confluence de 20 % et être cultivées un ou deux jours jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence maximale de 80 %. Il est important de se rappeler d'utiliser des cellules comprises entre les passages trois et dix. Après décongélation, commencer cette procédure en programmant le système 96 puits Shuttle qui sera utilisé pour la transfection.Pour ce faire, lancez le logiciel de transfert 96 puits sur l'ordinateur connecté au dispositif de transfert à partir du menu Fichier situé en haut à gauche. Sélectionnez un nouveau fichier de paramètres. Sélectionnez les puits qui seront transfectés sur le schéma de la plaque 96 puits affiché.Une boîte verte indiquera les puits sélectionnés. Choisissez le programme correspondant à la lignée cellulaire de macrophages utilisée pour les cellules brutes 2 64 0,7. Sélectionnez DS 1 36, puis cliquez sur Appliquer.Remarquez que, après avoir sélectionné un programme, les puits sur le schéma de la plaque seront colorés. Les cercles vides bleu foncé indiquent les puits qui n'ont pas été attribués à un programme et qui ne seront pas soumis à un choc électrique. Ensuite, préparez la solution efficace de travail en mélangeant la solution efficace pour ligne cellulaire SF en plaque de 96 puits avec la totalité du contenu du tube de supplément fourni.Laisser les réactifs mélangés équilibrer à température ambiante. Réchauffer le D-M-E-M-R-P-M-I 1640, la trypsine 0,25 % EDTA et le PBS à 37 degrés Celsius. Préparer le plasmide témoin S-I-R-N-A-P max GFP expérimental ou les ARNi marqués de façon fluorescente en les décongelant sur de la glace afin de détacher les macrophages adhérents des boîtes de culture cellulaire.Aspirez le milieu et lavez les cellules deux fois avec 10 millilitres de PBS. Ensuite, après avoir retiré le PBS, incubez les cellules avec un millilitre de trypsine 0,25 % EDTA préchauffée par plaque jusqu'à ce que les cellules commencent à se détacher. Cette étape prend de une à deux minutes.Tapotez doucement la plaque et agitez la solution pendant l'incubation afin d'optimiser la trypsination. Une fois les cellules détachées, ajoutez neuf millilitres de DMEM additionné de mélange de FBS en pipetant doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas, puis récupérez les cellules par pipetage dans un tube stérile. Comptez le nombre de macrophages isolés à l’aide d’un hémacytomètre.Prévoir environ 10 millions de macrophages par plaque de 10 centimètres. Calculer le nombre total de macrophages nécessaires, sachant que chaque puits de la plaque de 96 puits nécessite 200 000 cellules. Prélever au micropipette le nombre calculé de cellules dans un tube de centrifugation.Faire centrifuger les cellules pendant 10 minutes à 150 G à température ambiante vers une plaque stérile de 96 puits à fond rond, ce qui facilite le mélange tout en minimisant la perte de réactif. Ajouter deux microlitres de chaque ARNi dans chaque puits à transfecter. Remarque : selon le nombre d'ARNi, cette étape peut être réalisée pendant la centrifugation des macrophages.Le point le plus délicat de cette procédure est l'électroporation ; les points clés consistent à manipuler les cellules très délicatement et à travailler très rapidement. Une fois les cellules placées dans une solution de transfection toxique, aspirez le milieu après centrifugation des cellules, puis resuspendez-les délicatement dans la solution nucléofector contenant la solution de supplément SF.Transférez immédiatement les cellules dans une cuvette stérile à l’aide d’une pipette multipuce, en transférant 20 microlitres du mélange cellulaire resuspendu dans chaque puits de la plaque 96 puits contenant les ARNsi, puis mélangez délicatement par aspiration et expulsion répétées. Ensuite, transférez 20 microlitres du mélange cellulaire INA dans la plaque nucleo vete 96 puits. Il est essentiel d’éviter la formation de bulles lors de cette étape, car cela pourrait induire des erreurs durant la nucléofection.Après avoir placé tous les échantillons expérimentaux dans la plaque de transfection, couvrez-la avec le couvercle fourni et tapez très doucement sur une surface dure. Pour éliminer les bulles d'air, placez la plaque 96 puits dans le module d'insertion 96 puits du nucleo effector shuttle, puis en bas à droite de l'écran du programme, sélectionnez « télécharger et démarrer ». Suivez ensuite les instructions à l'écran pour enregistrer les résultats pendant le processus de nucléofection dans les puits avec succès.Les puits transfectés seront représentés sur le schéma de la plaque 96 puits à l'écran par un cercle vert avec un signe plus. Un cercle rouge avec un signe moins indique une erreur, probablement due à la présence de bulles ou à un volume incorrect de réactifs pipetté juste après la nucléofection. Utilisez une pipette multicanal pour ajouter 80 microlitres de RPMI 1640 préchauffé.Ajouter le milieu lentement sur le côté de chaque puits, en laissant le milieu se mélanger progressivement avec les cellules transfectées, qui sont très fragiles à ce stade. Ajouter le milieu trop rapidement réduirait fortement la viabilité.Placer la plaque de 96 puits contenant les échantillons transfectés et le RPMI 1640 dans une étuve à 37 degrés Celsius avec 5 %CO2 pendant deux minutes ou plus. Il est essentiel de permettre aux cellules de se rétablir avant toute manipulation ultérieure. Après avoir retiré la plaque de l’étuve, utiliser une pipette multipipette pour transférer soigneusement le mélange de chaque puits vers une plaque de culture tissulaire de 96 puits.Ensuite, à l’aide de la pipette multicanal, ajoutez 100 microlitres de DMEM avec du SFB à chaque puits. Incubez pendant 24 à 36 heures, puis réalisez immédiatement après la transfection et la récupération une cytométrie en flux. Pour évaluer l’efficacité de la transfection des siARN marqués de façon fluorescente, plus de 99 % des cellules doivent être transfectées le jour suivant la transfection. Pour l’efficacité de la transfection du plasmide GFP, 30 à 50 % des cellules doivent exprimer GFP. À l’issue de l’incubation de 24 à 36 heures, préparez le LPS ou d’autres activateurs de l’immunité innée dans du milieu frais, en diluant le LPS à une concentration finale de 20 nanogrammes par millilitre dans du DMEM avec du SFB.Ensuite, aspirez soigneusement le milieu de la plaque 96 puits et ajoutez le milieu frais contenant le LPS aux cellules. Placez la plaque dans un incubateur afin de surveiller la réponse au LPS ou à d'autres stimulateurs de l'immunité innée à différents moments après la stimulation. Prélevez le surnageant des cellules à l’aide d’une pipette et transférez-le dans une plaque de stockage 96 puits pour analyse par Eliza.Après avoir éliminé le surnageant pour surveiller la viabilité cellulaire, ajouter 100 microlitres d'un mélange de diacétate de fluorescéine dilué au 1/100 dans du PBS dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant une à cinq minutes. Surveiller la fluorescence dans les cellules à l'aide d'un lecteur de plaques, la fluorescence apparaissant suite au clivage par les estérases cellulaires dans les cellules vivantes. Ce composé devient fluorescent, illustrant ainsi l'utilité de cette approche pour le suivi de la réponse immunitaire innée.Des ARNsi ciblant des gènes régulateurs connus de l'immunité innée ont été transfectés dans la lignée cellulaire macrophagique RAW 264.7. Les cellules ont ensuite été stimulées par le LPS et la production des cytokines pro-inflammatoires IL-6 et TNF-α a été mesurée par ELISA, comme indiqué ici.Inhibition du récepteur de type Toll quatre, le récepteur du LPS, mais pas des autres TLR. À l'aide de SIR, une production fortement réduite de l'IL six et du TNF alpha induits par le LPS. Remarquez que l'inhibition de l'IL six par ARNi diminue la production d'IL six, mais n'affecte pas la production de TNF alpha.Ces données suggèrent une bonne efficacité et une bonne spécificité du silençage ARNi des régulateurs candidats de l'immunité innée. Il est important de garder à l'esprit que la clé d'un bon transfert et d'une bonne récupération cellulaire réside dans l'utilisation de cellules très saines, qu'il faut manipuler délicatement pendant les procédures de transfection et de récupération, et travailler rapidement une fois les cellules placées dans une solution nucléaire effector. Après avoir suivi cette procédure, de nombreux autres tests peuvent être réalisés, notamment la PCR quantitative pour surveiller le silençage génique et de nombreux autres essais destinés à étudier la réponse immunitaire innée.

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JoVE Journal

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