Name: En utilisant lARN interférence pour étudier la réponse immunitaire innée dans les macrophages de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Découvrez la transfection d'ARN interférence dans les macrophages murins pour étudier la réponse immunitaire innée. Cette méthode utilise le système Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle et permet une analyse à haut débit des gènes candidats.

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Merci à Brad Lackford pour son aide dans l’optimisation de certaines des techniques décrites dans ce manuscrit.

1. Entretien de lignées cellulaires de macrophages <ol><li> Cultiver RAW264.7 et des lignées de cellules J774A.1 dans du DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C en présence de 5% de CO 2. Pour aider à maintenir la stérilité, ajouter 1% de pénicilline / streptomycine (pénicilline / streptomycine) aux médias (bien que ce ne soit pas strictement nécessaire). </li><li> Étape critique: Veiller à ce que les macrophages sont de plus en plus dans un état ​​sain pour la transfection efficace et knockdown gène siRNA induite. Utiliser des cellules entre passages 3 et 10 après décongélation frais, comme ces lignes de macrophages présentent la meilleure efficacité de la transfection et maintenir robuste survie post-transfection à ce stade; ne pas utiliser un numéro de passage plus élevé (&gt; 20), que l&#39;efficacité de la transfection et gène Knockdown fois diminuent considérablement. </li><li> Pour optimiser la transfection de siRNA, les cellules des plaques à 20% de confluence et les poussent un ou deux jours jusqu&#39;à ce que les cellules atteignent pas plus de 80% de confluence. Cellules envahies ne transfecter efficiently. </li></ol> 2. Programmation du système de navette à 96 puits pour la transfection <ol><li> Lancez le logiciel de navette de 96 puits sur l&#39;ordinateur connecté à la navette. Sélectionnez nouveau fichier de paramètres dans le menu en haut à gauche du fichier. </li><li> Mettez en surbrillance les puits qui seront transfectées sur le affichée plaque de 96 puits schématique. Une boîte verte indique que les puits sont sélectionnés. </li><li> Sélectionnez le programme qui correspond à la lignée cellulaire de macrophages utilisé (DS-136 pour RAW264.7 ou DS-130 pour J774A.1) et sélectionnez Appliquer, située en dessous de la plaque de 96 puits schématisé. Notez que, après la sélection d&#39;un programme, les puits de la plaque schématique seront colorés en bleu foncé. Cercles vides indiquent puits qui ne sont pas attribués un programme et ne seront pas choqués. </li></ol> 3. Préparation des réactifs pour la transfection <ol><li> Préparer la solution de travail Nucleofector ™ en mélangeant SF lignée cellulaire de 96 puits solution Nucleofector ™avec la totalité du contenu du tube en supplément joint. Laisser les réactifs mixtes à équilibrer à température ambiante avant de l&#39;utiliser. Stocker l&#39;excès de solution complète Nucleofector ™ à 4 ° C pendant 3 mois pour une utilisation future. </li><li> Préchauffer la solution saline DMEM, RPMI-1640, 0,25% de trypsine / EDTA, et tamponnée au phosphate (PBS) à 37 ° C avant de préparer les macrophages pour la transfection. </li><li> Préparer le siRNA pour la transfection par la fonte de la glace. Afin de minimiser le nombre des dégels gel du siRNA, geler de nouveaux siRNA en aliquots la première fois qu&#39;ils sont utilisés. </li><li> Dans les premières expériences, utiliser siRNA à une dose relativement élevée de 2 pm (01:10 dilué de 20 pm stocks). Titrer la suite siRNA gène qui induisent robuste démontable vers le bas à des doses plus faibles, bien que des doses plus élevées sont nécessaires en général pour effet de choc efficace de gènes dans des macrophages par rapport à d&#39;autres types de cellules. NOTE: siRNA sont disponibles à partir de nombreuses sources; assez robuste knockdown de gène peut être obtenuutilisant SmartPools de siGenome, qui sont les piscines de quatre siRNA ciblant chaque gène. Comme témoin négatif, utiliser l&#39;une des diverses piscines non-ciblage siRNA ou siRNA. </li><li> Pour contrôler l&#39;efficacité de transfection, transfecter soit le plasmide contrôle pmaxGFP (fourni dans le kit Amaxa) ou siRNA marqués par fluorescence en parallèle avec les siRNA expérimentales. Expect 30 à 50% de la transfection de plasmide GFP (analysé par cytométrie en flux ou microscopie jours après la transfection) et&gt; 99% de transfection de siRNA marqué par fluorescence (analysé par cytométrie de flux, immédiatement après la transfection et la récupération). </li></ol> 4. Préparer les macrophages pour la transfection <ol><li> Détachez les macrophages adhérents des boîtes de culture cellulaire par traitement à la trypsine. Aspirer les médias et laver les cellules deux fois avec 10 ml de PBS. Après avoir enlevé le PBS, incuber les cellules avec préchauffé 0,25% de trypsine / EDTA (1 ml / 10 cm plaque) pendant 1-2 min jusqu&#39;à ce que les cellules commencent à se détacher. Tapoter légèrement la plaque et déplacer la solution lors de l&#39;incubation de maximiser la trypsine. </li><li> Après l&#39;incubation, ajouter 9 ml de milieu DMEM + FBS, mélanger doucement de haut en bas, et de recueillir les cellules par pipetage dans un tube stérile. </li><li> Comptez le nombre de macrophages isolés à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre. Attendez environ 10 millions de macrophages par 10 cm plaque. Calculer le nombre total de macrophages nécessaires; chaque puits sur la navette 96 puits nécessite 200 000 cellules. Pensez à ajouter la valeur des cellules de quelques puits supplémentaires de cas de pertes de pipetage. </li><li> Pipeter le nombre calculé de cellules dans un tube de centrifugation. Centrifuger les cellules pendant 10 min à 150 x g à température ambiante. Ne pas centrifuger trop rapidement car cela diminue la santé des macrophages et l&#39;efficacité de la transfection. </li></ol> 5. nucléofection de macrophages avec siRNA <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un plaque de 96 puits à fond rond stérile (qui facilite le mélange tout en minimisant la perte de réactif), ajouter 2 pi de chaque siRNA à chaque puits pour être transfète. Remarque: En fonction du nombre de siRNA, ceci peut être réalisé au cours de l&#39;étape de centrifugation des macrophages. </li><li> Aspirer les médias à partir des cellules centrifugés. Resuspendre doucement les cellules de solution Nucleofector ™ SF (contenant la solution de complément), en utilisant 20 pi par 200 000 cellules sédimentées. Une fois remis en suspension, utiliser les cellules immédiatement pour la transfection optimale. </li><li> Transfert cellules remises en suspension dans une cuve stérile; à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux, le transfert de 20 pl du mélange de cellules remis en suspension dans chaque puits de la plaque à 96 puits contenant le siRNA. Mélanger doucement par aspiration et refoulement. </li><li> Transférer 20 pl du mélange de cellules / siRNA dans la plaque à 96 puits Nucleocuvette ™ étape critique:. Éviter de générer des bulles lors de l&#39;étape de transfert, car cela peut provoquer des erreurs durant nucléofection. </li><li> Après avoir placé tous les échantillons expérimentaux dans la plaque de transfection, couvrir la plaque de 96 puits avec le couvercle fourni, very touchez doucement sur une surface dure pour éliminer les bulles à partir des échantillons. </li><li> Placer la plaque de 96 puits avec couvercle dans le 96 puits navette Nucleofector et sélectionnez «télécharger et démarrer &#39;en bas à droite de l&#39;écran du programme. Avant nucléofection, suivez l&#39;invite de programme pour enregistrer les résultats. Remarque: Durant le processus nucléofection, puits transfectées avec succès seront représentés sur le 96 bien schématique à l&#39;écran par un cercle vert avec un signe plus. Un cercle rouge avec un signe moins indique une erreur, probablement en raison de bulles ou mal pipetage le volume correct de réactifs. </li></ol> 6. Récupération et placage de macrophages <ol><li> Immédiatement après nucléofection, à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux, ajouter 80 ul de pré-chauffé (37 ° C) RMP1-1640 médias à chaque puits. Ajouter les médias sur le côté de chaque puits, permettant aux médias de mélanger lentement avec les cellules transfectées, qui sont très délicat à ce stade. Ne pas ajouter les médias trop vite, comme cette volontédiminuer considérablement la viabilité. </li><li> Placer les plaques à 96 puits et transfectées avec des échantillons du milieu RPMI-1640 dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 2 min; ce qui est essentiel pour permettre aux cellules de se rétablir avant une autre manipulation. </li><li> Retirer la plaque à 96 puits à partir de l&#39;incubateur et de les transférer avec précaution le mélange à partir de chaque puits dans une plaque de culture tissulaire à 96 puits en utilisant une pipette multicanaux. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 100 ul de pré-chauffé (37 ° C) du milieu DMEM + FBS à chaque puits. </li><li> Incuber le 96 et le tissu plaque de culture avec des échantillons dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 24-36 heures (optimiser le moment exact de siRNA individuels, bien que cette plage de temps fonctionne généralement bien). </li></ol> 7. La stimulation des macrophages avec LPS <ol><li> Après le 24-36 h post-nucléofection incubation, préparer LPS (ou autre PAMP) dans un milieu frais. Préparer suffisamment milieu frais pour tous les puits (200 pi media / puits de la plaque de 96 puits et un peu plus de pipetage). Diluer le LPS à une concentration finale de 20 ng / ml dans du DMEM + FBS. </li><li> Médias aspirer délicatement de la plaque de 96 puits et ajouter les milieux frais contenant les LPS aux cellules. </li><li> Surveiller la réponse au LPS ou d&#39;autres PAMP à divers moments après la stimulation. 6 heures est suffisante pour générer une réponse de cytokine inflammatoire robuste pour des cytokines telles que l&#39;IL-6 ou TNF. </li></ol> 8. Suivi de la réponse immunitaire innée induite, Gene Knockdown, et la viabilité dans les macrophages <ol><li> Pour surveiller induite par le LPS production de cytokines, pipeter le surnageant des cellules dans une plaque de 96 puits de stockage. La production de cytokine peut être ensuite mesurée par ELISA. </li><li> Une fois que le surnageant est éliminé, surveiller la viabilité des cellules en utilisant le diacétate de fluorescéine (lorsqu&#39;il est clivé par des estérases cellulaires dans les cellules vivantes, ce composé est fluorescent). Identifier les siRNA ciblant les gènes qui contrôlent la viabilité des cellules en utilisant tson approche. Remarque: le processus de transfection lui-même devrait avoir peu d&#39;effet sur la viabilité si elle est effectuée correctement. <ol><li> Ajouter diacétate de fluorescéine (5 mg / ml dans de l&#39;acétone actions) à chaque puits (1: 100 dilution finale dans du PBS). </li><li> Incuber à température ambiante pendant une à cinq minutes, puis surveiller la fluorescence dans les cellules en utilisant un lecteur de plaque (460 nm d&#39;excitation, 515 nm émission). </li><li> Facultatif: Pour veiller à ce que la fluorescence dans les puits est uniforme, la lyse des cellules en utilisant des tampons tels que RIPA; cela fournit un signal fluorescent uniforme dans le puits, comme certains lecteurs de plaques sont configurés pour surveiller seulement une petite partie du puits; si les cellules ne sont pas étalées uniformément, le diacétate de fluorescéine pourrait donner une lecture inexacte. </li></ol></li><li> Comme alternative à la surveillance de la viabilité cellulaire, contrôler gène induite par le siRNA-knockdown par qPCR en utilisant l&#39;ARN provenant des cellules adhérentes. <ol><li> Après que le surnageant est séparé des cellules (étape 8.1 ci-dessus), annonced tampon RLT (qui est utilisé pour la lyse et la préservation de l&#39;ARN) directement aux cellules adhérentes de les lyser. </li><li> Isoler l&#39;ARN en utilisant un kit de préparation d&#39;ARN tels que le mini-kit RNeasy, et en utilisant qPCR avec des amorces spécifiques d&#39;un gène par rapport au gène surveiller démontable pour contrôler le traitement des siRNA. Utilisez amorces à Βactin ou GAPDH pour la normalisation. </li></ol></li><li> Comme autre alternative à surveiller d&#39;autres aspects de la réponse immunitaire innée, surveiller la capacité phagocytaire des macrophages par l&#39;addition marqué au FITC E. particules coli directement sur ​​les cellules adhérentes en utilisant un kit. Suivant le protocole du fabricant, qui ne prend que quelques heures, contrôler l&#39;absorption phagocytaire utilisant un lecteur de plaque ou microscopie. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents. Cet article a été parrainé par Lonza, Inc.

De nombreuses études ont été publiées dans lequel les gènes individuels ont été pris pour cible par siRNA dans les macrophages murins. Bien que la transfection médiée par des lipides a été utilisé pour fournir des siRNA pour les lignées de cellules macrophages sur une base individuelle, ces méthodes souffrent des effets potentiels sur la viabilité, knock-down de gènes limitée, et la variabilité du gène à gène. Pour développer des tests plus robustes qui pourraient être utilisés pour cibler les gènes de la mode à moyen o...

Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes efficaces pour inhiber des gènes dans des lignées cellulaires de macrophages de souris à l&#39;aide de siRNA et de surveiller les effets de ces traitements sur la réponse immunitaire innée. Ces procédures sont effectuées en format 96 puits, permettant écrans ARNi de la mode à moyen ou haut débit. En réponse à une infection, l&#39;homme une réponse immunitaire innée immédiate et une réponse immunitaire adaptative plus lente mais plus précise. Cette réponse immunitaire innée rapide comprend le recrutement et l&#39;activation des cellules immunitaires innées, y compris les macrophages phagocytaires 1. Macrophages activées de façon classique sont impliquées dans les réponses inflammatoires aiguës et produisent des protéines antimicrobiennes et composés, les cytokines et les chimiokines, et les antigènes présents 2,3. Macrophages activés alternativement jouent un rôle dans la régulation de l&#39;immunité, le maintien de la tolérance, la réparation des tissus, cicatrisation des plaies et 4-8. En raison de leur large éventail de fonctions, Les macrophages peuvent jouer un rôle dans de nombreuses maladies, y compris l&#39;athérosclérose, l&#39;arthrite, le cancer et 9. Ainsi, l&#39;étude des macrophages a été un élément clé de la recherche depuis un certain temps dans une grande variété de domaines des maladies. En dépit de leur importance dans la réponse immunitaire innée, les macrophages peut être difficile de travailler avec des cellules. En particulier, il est difficile d&#39;obtenir une transfection efficace en utilisant des réactifs lipidiques dans les macrophages sans toxicité associée 10,11. En outre, même lorsque le siRNA est rendu efficace à des macrophages, la robustesse de gène induite par ARNi démontable peut être assez souvent modérée et peut varier d&#39;un gène à gène. Pour remédier à ces difficultés techniques, nous avons optimisé la transfection et des techniques knockdown 12-16 dans deux lignées de cellules de type macrophage de souris, RAW264.7 17 et 18 J774A.1. Cette approche utilise la 96 puits système de navette Amaxa Nucleofector pour la transfection; ce systèmeutilise une combinaison de réactifs spécialisés et l&#39;électroporation pour transfecter des cellules dans un format à 96 puits 19. Après la transfection, on décrit des procédés pour optimiser la récupération et la viabilité cellulaire et de maximiser la suite gène induite par effet de choc de siRNA. Pour illustrer l&#39;utilité de cette approche, nous décrivons un protocole de délivrance d&#39;ARNi de ces lignées de cellules macrophages, stimuler ces cellules avec du lipopolysaccharide (LPS) et contrôler la réponse immunitaire innée à l&#39;échelle de la production de plusieurs cytokines pro-inflammatoires. Nous fournissons des données de l&#39;échantillon dans lequel nous ciblons la famille des récepteurs Toll-like (TLR), dont les membres sentir LPS et autres motifs moléculaires de pathogènes associés (PAMP), pour réguler l&#39;immunité innée.

<table><tbody><tr><td>Amaxa nucleofector 96-well shuttle system</td><td>Lonza</td><td>AAM-1001S</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit</td><td>Lonza</td><td>V4SC-2096</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 lignée cellulaire de macrophage de souris</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 lignée cellulaire de macrophage de souris</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td></td></tr><tr><td>siGenome smartpool siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>varie en fonction de sur le gène</td><td></td></tr><tr><td>Pool de siRNA de contrôle non ciblé</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-13-20</td><td></td></tr><tr><td>Oligo fluorescent Block-iT pour l’électroporation</td><td>Invitrogen</td><td>13750062</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure E. coli O111 :B4</td><td>LPS List Biological Laboratories</td><td>421</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, haute teneur en glucose</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pénicilline-streptomycine (Pen/Streptocoque)</td><td>Fisher</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>plaques de culture tissulaire à 96 puits</td><td>Fisher</td><td>07-200-89 &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Plaques stériles à fond rond à 96 puits (non revêtues)</td><td>Fisher</td><td>07-200-745</td><td></td></tr><tr><td>Souris IL-6 Duoset Kit ELISA</td><td>R& D Biosystems</td><td>DY406</td><td></td></tr><tr><td>Souris TNF&alpha ; Duoset ELISA kit</td><td>R& D Biosystems</td><td>DY410</td><td></td></tr><tr><td>Diacétate de fluorescéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7378</td><td></td></tr><tr><td>Tampon RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant Kit de dosage de la phagocytose</td><td>Invitrogen</td><td>V-6694</td><td></td></tr></tbody></table>

en utilisant l&#39;arn interférence pour étudier la réponse immunitaire innée dans les macrophages de souris

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Les macrophages sont des cellules immunitaires innées phagocytaires clés. Lorsque les macrophages rencontrent un agent pathogène, ils produisent des protéines et des composés antimicrobiens pour tuer l’agent pathogène, produisent diverses cytokines et chimiokines pour recruter et stimuler d’autres cellules immunitaires, et présentent des antigènes pour stimuler la réponse immunitaire adaptative. Ainsi, être capable de manipuler efficacement les macrophages avec des techniques telles que l’interférence ARN (ARNi) est essentiel à notre capacité à étudier cette importante cellule immunitaire innée. Cependant, les macrophages peuvent être techniquement difficiles à transfecter et peuvent présenter une inactivation inefficace des gènes induits par l’ARNi. Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes pour transfecter efficacement deux lignées cellulaires de macrophages de souris (RAW264.7 et J774A.1) avec des siRNA à l’aide du système de navette à 96 puits Amaxa Nucleofector et décrivons des procédures pour maximiser l’effet des siRNA sur l’inactivation des gènes. De plus, les méthodes décrites sont adaptées pour fonctionner au format 96 puits, ce qui permet des études à moyen et haut débit. Pour démontrer l’utilité de cette approche, nous décrivons des expériences qui utilisent l’ARNi pour inhiber les gènes qui régulent la production de cytokines induite par les lipopolysaccharides (LPS).

Pour démontrer l&#39;efficacité de la transfection en utilisant cette approche, nous avons suivi l&#39;absorption de FITC marqué siRNA l&#39;aide d&#39;un cytomètre de flux (Figure 1). Pour illustrer l&#39;utilité de notre approche pour le suivi de la réponse immunitaire innée, nous avons transfecté siRNA ciblant des gènes de régulation de l&#39;immunité innée connus dans la lignée cellulaire de macrophages RAW264.7, stimulé les cellules avec LPS, puis surve...

Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes pour transfecter efficacement des lignées cellulaires de macrophages murins avec des siRNA à l’aide du système de navette Amaxa Nucleofector à 96 puits, stimuler les macrophages avec des lipopolysaccharides et surveiller les effets sur la production de cytokines inflammatoires.

En utilisant l&#39;ARN interférence pour étudier la réponse immunitaire innée dans les macrophages de souris

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser l'interférence ARN pour étudier l'effet de gènes candidats sur la réponse immunitaire innée. Pour ce faire, des lignées cellulaires de macrophages murins sont trypséisées et combinées à une solution de transfection contenant les ARNsi d'intérêt. Le mélange est ensuite transféré dans une plaque 96 puits Nucleo VETE, et un système de transfection 96 puits Maxa est utilisé pour introduire l'ARNsi dans les macrophages. Après une incubation avec le milieu de culture cellulaire, des activateurs de l'immunité innée tels que le LPS ou d'autres agents sont ajoutés aux macrophages transfectés afin de les stimuler. Enfin, des ELISA sont réalisés pour mesurer la production de cytokines et évaluer l'effet du traitement par ARNsi sur la réponse immunitaire innée.L'avantage principal de cette technique par rapport à la transfection médiée par des lipides est que notre test est robuste et peut être appliqué à de nombreux gènes dans un cadre de production à haut débit. La clé de cette méthode consiste à travailler avec des cellules saines, à les manipuler délicatement et à agir efficacement durant le processus de transfection. Comme nous le démon

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo présente un test visant à examiner l’activité dépendante du récepteur de type Toll (TLR) des facteurs de transcription Nuclear Factor-kappa-B (NF-κB) et activator protein-1 (AP-1) dans les macrophages. Les TLR déclenchent une cascade de signalisation pro-inflammatoire lors de la reconnaissance des motifs moléculaires associés aux dommages (DAMPs), activant NF-κB et AP-1. Les macrophages rapporteurs modifiés produisent l’enzyme phosphatase alcaline embryonnaire (SEAP) sécrétée lors...

Un test pour la signalisation du facteur de transcription NF-&kcy ;B/AP-1 dépendante du TLR dans les macrophages

Cette vidéo présente un test basé sur des cellules rapporteures pour le criblage de nanoparticules bioactives potentielles qui inhibent la signalisation du récepteur de type Toll (TLR). Le test consiste à introduire des lipopolysaccharides (LPS) mélangés à des hybrides de nanoparticules peptide-or dans des macrophages rapporteurs exprimant les protéines rapporteures - phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée (SEAP) et luciférase. La réduction du signal TLR induit par le LPS médié par les...

Un test pour cribler des nanoparticules bioactives pour l’inhibition de la signalisation des récepteurs de type Toll

Nous décrivons un protocole pour mesurer la production de cytokine antivirale chez les souris infectées par un virus de l'herpès modèle murin gamma herpèsvirus 68 (γ HV68) qui est étroitement liée à associé au sarcome de virus de l'herpès de Kaposi humain (KSHV) et le virus d'Epstein-Barr (EBV). L'utilisation de souches de souris génétiquement modifiées et les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), nous avons évalué la production de cytokines antivirales la fois in vivo et ex vivo.

Dissection Innate Immune signalisation Evasion virale de la production de cytokines

Nous décrivons ici un protocole simple pour isoler les macrophages péritonéaux murins. Cette procédure est suivie d’une extraction de l’ARN pour effectuer une analyse de l’expression génique lors de la stimulation des récepteurs de type Toll.

Isolement d&#39;anticorps murins péritonéale macrophages pour effectuer Analyse expression génique Sur Toll-like récepteurs Stimulation

Nous décrivons la détection d’activation inflammasome NLRP3 sur base cellulaire à l’aide de la microscopie en fluorescence et coloration pour active caspase-1 et l’adaptateur, ASC. Un test de libération de lactate déshydrogénase est présenté afin de détecter la lyse pyroptotic sur une base de population. Ces techniques peuvent être adaptés afin d’étudier plusieurs aspects de la biologie inflammasome.

Détection d’Activation Inflammasome et mort cellulaire de Pyroptotic dans les Macrophages dérivés de la moelle osseuse Murine

Il est décrit une approche pour la détection en temps réel de la réponse immunitaire innée de blessures cutanées et Staphylococcus aureus infection des souris. Par comparaison LysM-EGFP souris (qui possèdent des neutrophiles fluorescents) avec un LysM-EGFP croisés souche de souris immunodéficientes, nous faire avancer notre compréhension de l’infection et l’élaboration d’approches pour lutter contre l’infection.

Un modèle de souris pour évaluer réponse immunitaire innée à l’infection par Staphylococcus aureus

Les macrophages, en particulier les macrophages primaires, sont difficiles à transfect car ils se spécialisent dans la détection de molécules de non-auto-origine. Nous décrivons un protocole qui permet une transfection très efficace des macrophages primaires avec l'ARNm généré à partir de modèles d'ADN tels que les plasmides.

Transfection très efficace des macrophages primaires avec ARNm transcrit in vitro

Pour tester l'effet d'une chimiokine sur le recrutement de macrophages in vivo, l'hybridation in situ de montage entière a été employée pour détecter l'expression ectopique de la chimiokine, et l'immunostaining a été employée pour étiqueter des macrophages. L'imagerie en direct a été utilisée pour l'observation en temps réel de la migration des macrophages.

Un modèle d'expression ectopique de chemokine pour tester le recrutement de macrophage in Vivo

Ce protocole fournit aux chercheurs une méthode rapide et indirecte de mesure de l'activité du facteur de transcription NF-B/AP-1, dépendante de TLR, dans une lignée de cellules macrophages murines en réponse à une variété de surfaces polymères et de couches protéiques adsorbées qui modélisent le microenvironnement de l'implant biomatériau.

A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces

Nous démontrons un protocole étape par étape pour l’étude de la fonction des gènes dans les macrophages résidents du tissu péritonéal in vivo, en utilisant des vecteurs lentiviraux.

Préparation de vecteur lentiviral pour une modulation efficace des gènes et des microARN de macrophages résidents dans les tissus de la cavité péritonéale in vivo chez la souris

Découvrez la transfection d'ARN interférence dans les macrophages murins pour étudier la réponse immunitaire innée. Cette méthode utilise le système Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle et permet une analyse à haut débit des gènes candidats.

En utilisant l'ARN interférence pour étudier la réponse immunitaire innée dans les macrophages de souris

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