Analyse des réactions de transformation de l'ARN utilisant des cellules des systèmes gratuits: 3 'Fin de clivage de pré-ARNm substrats In vitro

L’objectif global de cette procédure est d’examiner avec succès le clivage de trois ARNm primaires in vitro. Ceci est accompli en fabriquant d’abord un extrait nucléaire transcriptionnellement actif à partir de cellules cultivées en suspension. La deuxième étape de la procédure consiste à fabriquer des substrats d’ARN radiomarqués par transcription in vitro.

La troisième étape consiste à purifier en gel les substrats d’ARN marqués. La dernière étape consiste à assembler la réaction de clivage, y compris l’extrait nucléaire et le substrat d’ARN marqué. En fin de compte, les résultats peuvent montrer trois premiers ARNm, des substrats clivés UNC et un produit clivé par électrophorèse verticale sur gel radioactif.

La démonstration visuelle de cette méthode est importante, même si elle est pratiquée depuis les années 1980, elle n’est pas facile à exécuter car il existe de nombreuses étapes spécifiques tout au long de la procédure qui sont difficiles. Avoir des cellules lavées, granulées et prêtes pour la lyse. Pour commencer ce protocole à la pastille de cellule, ajoutez un tampon avec du DTT frais.

Ajoutez cinq volumes du CPV estimé et utilisez une pipette pour briser la pastille et laisser la suspension refroidir sur de la glace. Après 10 minutes, faites tourner les cellules à quatre degrés Celsius dans un seau oscillant. La centrifugeuse aspire soigneusement le surnageant.

Le granulé aura absorbé une partie de la solution et aura gonflé en taille. Ajoutez ensuite un CPV de tampon A et brisez doucement la pastille avec une pointe de pipette. Versez la suspension dans un homogénéisateur réfrigéré et, avec cinq à 12 coups d’un pilon serré, éliminez les cellules.

Prélever une petite aliquote, appliquer du bleu trian et vérifier les cellules pour déterminer l’exhaustivité de leur lyse. Si nécessaire, continuez à homogénéiser les cellules jusqu’à ce qu’elles soient lysées à 90 %, mais n’en faites pas trop. Transférez maintenant le lysat dans un tube ultracentrifuge ultra clair.

Enregistrez le volume total et faites-le tourner comme vous l’avez fait précédemment. Aspirez le surnageant trouble et conservez-le sur de la glace. Et pour l’analyse du cytosol, veillez à ne pas déranger la pastille.

Il contient les noyaux. Ensuite, faites tourner le granulé à grande vitesse pendant 15 minutes. Retirer le petit volume de surnageant restant et le regrouper avec la collection de cytosols.

Déterminez ensuite le volume nucléaire du PACT. Ajoutez un équivalent en volume du tampon C à la pastille. Ensuite, délogez la pastille à l’aide de la pipette dans un homogénéisateur propre.

Utilisez cinq à 10 coups de pilon serrés pour réhydrater. Suspendez le granulé. Transférez l’homogénat dans un tube réfrigéré et mélangez-le par inversion pendant 30 minutes.

À quatre degrés Celsius, une plaque d’agitation peut être utilisée. Si le volume est suffisamment grand, transférez le lysat dans un tube ultracentrifuge UltraClear et, à quatre degrés Celsius, faites-le tourner vers le bas pendant 30 minutes. À environ 25 000 g, le surnageant est l’extrait nucléaire.

En suivant le protocole de texte, complétez la dialyse à partir d’un seul microgramme de modèle. Préparez la sonde par transcription in vitro à l’aide d’un kit avec un promoteur compatible SP six ou T sept. Lors du chargement de la page, utilisez trois microlitres de marqueur et les 25 microlitres de la réaction pour chaque substrat d’ARN.

Empêchez également la contamination croisée en espaçant les voies des transcrits de taille similaire. Faites fonctionner le gel de manière à ce qu’une sonde de 600 nucléotides fonctionne à 25 watts pendant environ deux heures plus tard. Pour marquer l’emplacement des bandes de gel, illuminez le film exposé avec une boîte à lumière et placez le gel enveloppé sur le dessus.

Alignez le marqueur rad automatique et le marqueur exposé sur le film. Et puis marquez l’emplacement des bandes avec un marqueur noir pour retirer les bandes Déballez le gel. Et avec une excise de lame propre, les sections de bande du gel transfèrent chaque section dans son propre tube et éluent l’ARN selon les procédures standard.

Une fois que tous les réactifs ont été préparés, chauffez l’ARN marqué à 80 degrés Celsius pendant deux minutes. Transférez ensuite l’ARN dans un vortex de glace, le PVA à 10 %, puis faites-le tourner à grande vitesse pendant quelques minutes pour éliminer les bulles, puis procédez à la fabrication des mélanges maîtres pour chaque réaction. Pour chaque réaction, distribuez 5,25 microlitres de master mix one.

Ensuite, ajoutez 6,25 microlitres du mélange d’extrait nucléaire. Ajoutez ensuite un microlitre de substrat d’ARN marqué dilué à 50 anomolaires en tout. Chaque réaction utilise moins de cinq ARN marqués en molaires anonaires.

Maintenant, faites tourbillonner doucement et faites tourner rapidement les mélanges de réaction. Laissez la réaction se produire jusqu’à deux heures à 30 degrés Celsius. Après avoir utilisé la protéinase K pour digérer la protéine dans la réaction, puis purifié la réaction À l’aide de la méthode du phénol chloroforme, exécutez les produits sur un chargement de 6 % de page, trois microlitres de marqueur ou cinq microlitres par produit de réaction et par voie.

Ensuite, faites couler le gel et démontez ensuite soigneusement l’appareil à gel. Pour recueillir le gel, appuyez fermement le papier filtre contre celui-ci et retournez-le. Appuyez fermement sur le verre pour vous assurer que le gel est entièrement saisi par le papier.

Ensuite, décollez lentement le papier filtre avec le gel attaché. Enveloppez le côté exposé du gel dans du plastique et collez l’emballage sur le papier filtre de l’autre côté. Terminez en mettant le gel dans un sèche-linge pendant 15 minutes avec le papier filtre face à l’aspirateur.

Plus tard, analysez le gel en l’exposant à un film ou à un imageur phospho. Le clivé. Le substrat de l’ARN est la bande de migration la plus lente au sommet du gel.

Le produit clivé spécifique, marqué d’une flèche en gras, s’écoule plus rapidement dans le gel à la taille attendue. Ce produit est absent du témoin avec une mutation ponctuelle dans la séquence pollier. La quantification de l’activité de clivage a été déterminée à l’aide d’un graphique métrique DS.

Comparaison du rapport entre l’ARN clivé et l’ARN clivé, normalisé par rapport au contrôle de l’ARN clivé. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles qu’un test de polyadénylation peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que l’activité de la polyA polymérase. Ce test est effectué en modifiant les conditions de réaction, telles que l’ajout de magnésium et l’élimination de l’EDTA.