Isolement de CA1 nucléaires enrichies fractions de coupes d'hippocampe pour étudier l'activité dépendante nucléaire importation de Synapto nucléaires protéines Messenger

Nous fournissons un protocole détaillé pour l'induction de la potentialisation à long terme dans la région CA1 de l'hippocampe et l'isolement subséquent de fractions enrichies à partir de la zone nucléaire tétanisée de la tranche. Cette approche peut être utilisée pour déterminer l'activité dépend énormément des importations de protéines nucléaires dans des modèles cellulaires de l'apprentissage et de la mémoire.

L’objectif général de cette expérience est d’étudier la navette nucléocytoplasmique dépendante de l’activité des protéines à l’aide de coupes aiguës de l’hippocampe où la connectivité et la fonction neuronales sont bien préservées. Pour atteindre cet objectif, l’hippocampe d’un rat mâle adulte est d’abord isolé et des tranches transversales aiguës sont préparées dans un deuxième temps. Les tranches de l’hippocampe sont transférées dans la chambre d’enregistrement et la forme tardive de LTP est induite dans l’atome CA d’un stratum radi. Ensuite, les tranches potentialisées et de contrôle sont congelées, et les régions stimulées sont disséquées afin d’isoler la fraction enrichie en nucléaire pour une analyse plus approfondie de l’immuno-blott.

Les résultats basés sur l’analyse par western blot montrent des différences dans les niveaux de phosphoprotéine nucléaire entre les tranches potentialisées et les tranches témoins 30 minutes après l’induction de la LTP. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés pour deux raisons. Premièrement, la faible quantité d’échantillon de tissu, et deuxièmement, le temps critique qui se répète pour la lyse des échantillons dans le tampon de lyse hypotonique, permettant la libération des noyaux. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la préparation de la vie de l’hippocampe et l’isolement de la région C nécessitent des dissections rapides et très précises, mais il y a certaines astuces.

Pour faciliter la tâche, il faudrait suivre des instructions écrites et visualisées pour la préparation de la fraction enrichie en nucléaire à partir de la zone C un de l’hippocampe. La démonstration de la procédure sera effectuée par le laboratoire postal Pinon. Elle montrera comment préparer la lyse aiguë de l’hippocampe et induire la PLT.

Après la dissection de C une région à travers Berrag un étudiant de notre laboratoire vous montrera comment isoler le nucléaire et la destruction. Commencez cette procédure en isolant le cerveau du rat et en l’immergeant dans la solution de regard glacé pré-gazéifié. Ensuite, retirez le cervelet et une partie du cortex entéral.

Séparez les hémisphères corticaux par une coupe sagittale moyenne. Ensuite, faites une coupe de 50 à 70 degrés le long du bord dorsal de chaque hémisphère. Ensuite, placez chaque hémisphère vers le bas sur sa surface médiane, collez chaque hémisphère avec la surface fraîchement coupée sur la plate-forme de tranchage du vibrato.

Recouvrez ensuite la plate-forme avec la solution de gaz glacé précarbovine. Coupez des coupes de 350 micromètres contenant la formation de l’hippocampe des cortex subulaire et entéral de la face antérieure à la face postérieure avec le vibram. Après cela, transférez les tranches dans un incubateur en forme de U et immergé et incubez-les pendant au moins deux heures à 32 degrés Celsius avec du carbogène A CSF.

Transférez maintenant une tranche d’hippocampe dans la chambre d’enregistrement de type immergé montée sous microscope. Perfuser la tranche avec du LCR A gazéifié à raison de six millilitres par minute pendant au moins 30 minutes à 32 degrés Celsius. Après 30 minutes, remplissez les micro-électrodes capillaires en verre avec un LCR.

Placez une micro-électrode dans l’AC une fibre collatérale de Schaefer pour la stimulation, et une autre dans l’atome prêt à l’emploi d’environ une couche pour l’enregistrement EPSP sur le terrain à une distance de 300 micromètres. Ensuite, évoquez le champ EP SSP en délivrant trois à quatre volts par impulsions de courant rectangulaires phasiques aux fibres collatérales de Schafer. Effectuez le test de stimulation maximale en mesurant la relation entrée-sortie et définissez l’intensité de stimulation à 40 % de la valeur de pente EPSP du champ maximal.

Ensuite, enregistrez la ligne de base pendant au moins 15 minutes en mesurant les réponses aux stimuli du test toutes les minutes tout au long de l’expérience. Pour induire une LTP tardive, appliquez une tein à haute fréquence pour augmenter les EPSP de champ évoqué dans une région environ. Appliquer cinq micromolaires par COE sur le LCR A deux minutes avant la tétaine et rincer immédiatement après le dernier tétanos.

Arrêtez l’enregistrement. Deux minutes ou 30 minutes après l’induction tardive de la LTP, retirez les électrodes et transférez rapidement la tranche sur une plate-forme métallique pré-refroidie placée sur de la glace sèche. Ensuite, récupérez chaque tranche dans un tube eend orph de 1,5 millilitre et conservez-la à moins 80 degrés Celsius.

Dans cette étape, sortez les tranches congelées des moins 80 degrés Celsius et conservez-les sur de la glace. Ajoutez 0,5 millilitre de tampon TBS frais et froid contenant des inhibiteurs de protéase et de phosphatase dans le tube. Incuberez-les pendant deux à trois minutes avant de les transférer au stéréomicroscope.

Ensuite, disséquez la région CA one stratum parama dole de l’hippocampe en tenant la tranche avec une aiguille et en coupant la zone CA avec l’autre. Ensuite, collectez les régions disséquées d’environ cinq tranches par groupe dans un nouveau tube d’un millilitre contenant 50 microlitres de tampon de lyse. Ensuite, homogénéisez les tissus collectés en pipetant soigneusement de haut en bas avec une pipette de 200 microlitres.

Incuber le lysat sur de la glace pendant cinq à sept minutes pour permettre aux cellules de gonfler. Après cela, prenez deux microlitres de lysat et déposez-le sur une lame de microscope. Visualisez le gonflement des cellules au microscope à champ clair.

Les noyaux apparaissent comme des structures rondes et intactes avec un gonflement approprié. Maintenant, collectez 20 microlitres d’échantillon dans un tube frais de 1,5 millilitre comme fraction d’homogénat. Ajouter huit microlitres de tampon d’échantillon dénaturant quatre XSDS.

Ensuite, centrifugez le lysat restant à 1100 RCF pendant une minute. Au bout d’une minute, récupérez soigneusement le surnageant par le haut et transférez-le dans un nouveau tube. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de quatre x tampon d’échantillon.

Ensuite, mettez le granulé en suspension dans 60 microlitres de tampon hypotonique et ajoutez 20 microlitres de tampon à quatre échantillons x. Cette fraction est appelée fraction enrichie en nucléaire. Stockez les fractions homogénées, cytosoliques et enrichies en nucléaire à moins 20 degrés Celsius ou moins 80 degrés Celsius.

Pour un immuno-transfert ultérieur dans cette procédure, décongelez les échantillons et faites-les bouillir pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius avant de mesurer la concentration de protéines par test AM mito black, ou charge de test BCA, une quantité égale d’échantillons de protéines provenant des fractions homogénées, cytoplasmiques et enrichies en nucléaire. Sur une page de FDS, les échantillons de gel des tranches de contrôle et de LTP doivent être placés sur le même gel pour une comparaison directe dans le Western blot. Cette figure montre un immuno-transfert pour les fractions homogénées, cytosoliques et enrichies en substances nucléaires d’environ un lysat sondé par des marqueurs cytosoliques et nucléaires.

Il s’agit d’une analyse immuno-transfert des niveaux de PJS 180 dans l’homogénat deux minutes et 30 minutes après l’induction de la téine, et il s’agit d’une analyse immuno-sanguine des niveaux de PJS 180 dans la fraction enrichie nucléaire. Deux minutes et 30 minutes après l’isation, les niveaux de phospho Jacob sont restés inchangés dans les homogénats totaux d’une protéine CA et dans la fraction enrichie en nucléaire deux minutes après l’isation. Mais une augmentation significative a été constatée dans l’immunoréactivité de p Jacob, S 180 30 minutes après l’induction de la LTP.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser un volume approprié de valve de lyse hypotonique. De plus, le délai critique pour la lyse des échantillons doit être normalisé. En particulier, lorsque cette méthode est appliquée pour l’isolement de tissus nucléaires et fractionnels à partir d’échantillons de tissus cérébraux de rats ou de souris autres que l’hippocampe. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que la coloration immunitaire complémentaire avec des anticorps contre des protéines candidates importées dans le noyau après l’induction d’OTP ou des molécules de signalisation telles que des formes actives de kinase ou de phosphatase, peuvent être utiles pour vérifier ces résultats.

Un traitement pharmacologique peut être effectué pour répondre à des questions supplémentaires. Par exemple, quelles cascades de signalisation sont impliquées dans la translocation des protéines nucléaires synaptiques, ou comment elles influencent une fonction nucléaire. De plus, on pourrait étudier le rôle des protéines messagères nucléaires synap dans les maladies impliquant l’hippocampe.

Par exemple, la maladie d’Alzheimer.