Des cellules endothéliales Tube Formation test pour la

Le but global de cette procédure est de déterminer les gènes ou voies impliqués dans l'angiogenèse au moyen d'une méthode in vitro rapide et quantitative. Cela s'accomplit tout d'abord en privant de sérum des cellules endothéliales primaires ou immortalisées la veille du test. La deuxième étape consiste à incuber les cellules endothéliales avec du calcine pendant 30 minutes, suivie d'un lavage des cellules avec du PBS.

Ensuite, les cellules endothéliales sont traitées à la trypsine, filtrées pour éliminer les agrégats et comptées. La dernière étape consiste à combiner les cellules endothéliales avec un milieu conditionné contenant d'éventuels facteurs angiogéniques, puis à les distribuer sur un extrait de membrane basale solidifié. Enfin, une microscopie en lumière ou en fluorescence est utilisée pour visualiser les réseaux tubulaires, qui peuvent ensuite être quantifiés à l'aide de programmes informatiques spécialisés.

L'avantage principal de cette technique par rapport à d'autres méthodes d'évaluation de l'angiogenèse est qu'elle est facile à mettre en place, relativement peu coûteuse, produit des tubules en quelques heures et peut être quantifiée, ce qui illustre bien cette méthode. Erica Bullwinkle est-elle étudiante diplômante au département de biologie de l'American University ? Transférez trois cellules B 11 dans un nouveau flacon à l'aide du milieu approprié deux jours avant de commencer le dosage afin d'obtenir les meilleurs résultats ; les cellules doivent être comprises entre la deuxième et la sixième passage lorsqu'elles sont utilisées.

Ensuite, faire croître les cellules pendant 24 heures dans du dmm supplémenté. Lorsque les cellules sont prêtes, les priver de sérum. En remplaçant le milieu par un milieu à faible teneur en sérum, faire croître les cellules privées de sérum pendant 24 heures supplémentaires.

Pour obtenir les meilleurs résultats, il est important de vérifier auprès du fabricant que la concentration de la solution mère de BME est de 10 milligrammes par millilitre. Décongeler la BME à facteurs de croissance réduits au réfrigérateur. Étant donné que la BME se solidifie à température ambiante, elle doit être conservée au froid avant utilisation.

Ensuite, décongelez le milieu nécessaire pour le test destiné à la visualisation par microscopie de fluorescence ou confocale, et ajoutez du calceine AM dans le milieu à une concentration finale de deux microgrammes par millilitre. Incubez les cellules marquées au calceine AM à l’obscurité pendant environ 30 à 45 minutes. Une fois ce temps écoulé, retirez le milieu et lavez les cellules 3T3-B11 dans du DPBS. Ensuite, détachez les cellules par trypsine en ajoutant un millilitre de trypsine-EDTA. Une fois la trypsination terminée.

Resuspendez les cellules dans un volume final de 10 millilitres. Dans le dmm supplémenté, éliminez les agrégats cellulaires en filtrant les cellules à travers un tamis cellulaire de 100 micromètres. Après avoir dénombré les cellules resuspendues, ajustez-les à la concentration finale appropriée pour commencer le test de formation de tubes à refroidir.

Une plaque de 24 puits et des embouts d'un millilitre pendant 20 à 30 minutes avant le chargement. Cela empêche le BME de se solidifier prématurément. Lorsque vous êtes prêt à commencer, pipetez 250 microlitres de BME avec facteur de croissance réduit dans chaque puits d'une plaque de 24 puits. Évitez de former des bulles en ne pressant pas le piston de la pipette jusqu'à son arrêt final.

Lorsque vous pipetez, une fois les puits chargés, vérifiez qu'une quantité suffisante de BME reste au centre du puit. Lorsque le ménisque se forme, si la matrice est trop mince, les cellules ne formeront qu'une monocouche. Incubez ensuite la plaque pendant 30 minutes afin de solidifier le BME.

Une fois que le BME est solidifié, mélanger environ 300 microlitres de milieu conditionné avec 10 microlitres de trois cellules B 11 remises en suspension, puis répartir la suspension cellulaire dans les puits de la plaque. Après avoir placé la plaque dans l'incubateur, des tubes commenceront à se former en deux à quatre heures. Selon la concentration du facteur angiogénique dans le milieu conditionné, la formation maximale de tubes peut survenir entre trois et douze heures. Le moment du dosage devra être optimisé en fonction des conditions spécifiques de chaque étude.

Les tubes commencent souvent à se détériorer dans les 18 heures, et les cellules endothéliales entrent en apoptose au moment du pic de formation des tubes. Aspirez soigneusement le milieu des puits afin de ne pas perturber le réseau de tubes. Ensuite, lavez chaque puits avec un millilitre de DPBS pour une visualisation immédiate.

Ajoutez un millilitre de DPBS frais dans chaque puits et observez le réseau de tubes au microscope confocal afin de fixer un réseau de tubes pour une visualisation ultérieure. Ajoutez 4 % de paraformaldéhyde dans chaque puits aspiré et incubez 15 minutes à température ambiante. Après avoir retiré le paraformaldéhyde, lavez deux fois avec du DPBS, puis ajoutez un millilitre de DPBS frais dans chaque puits. Ces images montrent que les facteurs angiogéniques sécrétés soit par des kératinocytes, soit par des fibroblastes de souris sont capables d'induire la formation de tubes.

Au fil du temps, les cellules endothéliales migrent et commencent à former de petites branches entre une et deux heures après l'ensemencement. La formation maximale de tubes est atteinte entre quatre et six heures. Au bout de 24 heures, certaines branches persistent, mais bon nombre de cellules deviennent apoptotiques et les tubes commencent à se dissocier.

Le nombre de cellules a un impact profond sur la formation de tubes. Lorsqu'un nombre insuffisant de cellules est ensemencé, peu de tubes se forment et le réseau est minimal ; à mesure que le nombre de cellules augmente, le réseau de tubes devient plus étendu. Toutefois, à une concentration trop élevée, les cellules commencent à s'agglomérer ou à former des monocouches, et les différences entre les groupes traités deviennent masquées. Les cellules doivent avoir subi au minimum deux passages pour garantir une formation adéquate de tubes.

Le taux de croissance des cellules B11 est si rapide que 25 % des cellules passagées un jour donné produiront un flacon confluant le jour suivant. Ici, ImageJ avec le module angiogenèse est utilisé sur un réseau de tubes marqués à l’AM calcineur pour détecter le nombre total de nœuds, de tubes et de maillages en combinaison, ainsi que les éléments fusionnés sur le réseau. De plus, ce programme peut être utilisé pour détecter individuellement les nœuds, les tubes ou les maillages, qui peuvent ensuite être quantifiés.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une angiogenèse in vitro de façon rapide et fiable tout en évitant les pièges courants.