La cartographie sur-AFM des propriétés élastiques de la paroi cellulaire: au tissu, cellulaire, et des résolutions Subcellular

L’objectif général de cette procédure est de cartographier les propriétés mécaniques des tissus végétaux à l’aide d’un microscope à force atomique. Préparez d’abord les lames de verre en pipetant une gouttelette d’aros à basse température de fusion sur une région gravée de la lame pour former un mince film d’aros. La deuxième étape consiste à disséquer et à monter l’échantillon.

Retirez les boutons floraux de la tige, coupez la tige de marris loin de la tige et intégrez immédiatement la tige Cut Me dans la fine pellicule Agros sur le verre. Faites glisser ensuite, ajoutez suffisamment d’agros de montage fondus pour remplir la fissure créée lorsque la tige Maris a été intégrée dans le film Aros. La dernière étape consiste à configurer le microscope à force atomique pour l’acquisition des données.

En fin de compte, l’analyse des données et les mesures du module de Young apparent des parois cellulaires génèrent une carte mécanique des propriétés des parois cellulaires simultanément à des résolutions subcellulaires et dans des régions entières de tissus. Le principal avantage de cette technique par rapport à la méthode existante est qu’elle peut mesurer les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire simultanément à la résolution subcellulaire et sur toute la région du tissu. Le milieu Aros pour l’enrobage des échantillons est préparé à partir de 0,7 % de basse température de fusion, aros dans 10 % de mannitol dans de l’eau.

À l’aide d’un instrument métallique solide tel qu’une pointe de foret, gravez une zone de 0,5 par 0,5 centimètre au centre d’un verre de microscopie. Glisser : cela rend la surface rugueuse afin de faciliter l’adhérence de l’agros pour s’assurer que l’agros media adhère ou se fixe à la glissière. Pipeda gouttelette d’environ 20 microlitres d’agros media d’enrobage sur la région gravée de la lame de verre.

Cela produit une fine pellicule d’agros. Conservez la lame de verre dans une boîte humide et attendez que le média Agros solidifie les échantillons d’Arabidopsis. Ana sera utilisé pour la microscopie à force atomique afin de préparer des échantillons de méristème.

Retirez les boutons floraux un par un de la tige en les tirant vers le bas avec une pince à épiler ultra fine. Il est important d’enlever tous les boutons floraux jusqu’aux bourgeons qui ne présentent pas de séquelles connues sous le nom de primeur P one stage. À l’aide d’une lame de rasoir ou de la pointe de la pince à épiler, coupez le méristème de la tige.

La coupe doit être parallèle à la région de la surface du méristème qui doit être mesurée avec le microscope à force atomique ou un FM. L’apex obtenu doit avoir une hauteur comprise entre 300 microns et 600 microns afin qu’il ne s’effrite pas pendant l’expérience. Poussez immédiatement l’apex dans la fine pellicule d’aros media préparée précédemment. Choisissez une position sur la lame de verre ou l’aros et poussez doucement de manière à ce que le méristème soit à la fois en contact direct avec la lame de verre et dépasse de l’aros.

L’agros se fracture lors de l’application d’une pression, de sorte que la tige mariée se trouvera maintenant dans une fissure. Il est crucial de positionner la tige de marit dans les aros quelques secondes qui suivent ses coupes de la tige. Cela empêche la tige MA de sécher.

Plusieurs tiges MA peuvent être préparées de cette manière pour l’imagerie par lots, à condition qu’elles soient de la même hauteur et qu’elles soient positionnées à moins de 500 microns les unes des autres. Sur la lame, conservez les tiges de ma préparées dans la boîte humide pendant que vous disséquez d’autres échantillons. Avant de passer à l’étape suivante, utilisez du papier filtre pour éliminer délicatement tout excès d’eau à la limite entre le méristème et les boutons floraux.

Il s’agit d’éviter que les agros fondus n’inondent l’échantillon en raison des forces capillaires. Plus tard, avec une pipette de 20 microlitres à suffisamment d’agros de montage fondus pour combler la fissure créée précédemment et pour entourer chaque méristème, les aros devraient atteindre le niveau de la cicatrice du bouton floral enlevé ou du primor gym. Pour y parvenir, il peut être nécessaire d’ajouter des agros à chaque extrémité de la fissure.

Lorsque l’agros est ajouté, il va rapidement inonder la fissure. À l’aide de la pipette, aspirez une partie des agros de montage fondus pour vous assurer que la tige est le point le plus élevé de la lame. Cela fixe la tige moi de sorte qu’elle ne peut pas bouger pendant l’imagerie des racines et des hypo coddles.

Aucune dissection n’est nécessaire dans la couche mince d’agros. Sur la lame de verre préparée, utilisez une micro-pince à épiler pour faire une rainure soit directement au-dessus d’une gravure dans le verre, soit le long d’une lamelle de verre, positionnez la racine ou l’hypo coddle dans cette rainure, en vous assurant qu’elle est en contact avec le verre sur toute sa longueur de maintien. Ajoutez des agros de montage fondus autour de l’échantillon de la même manière que pour l’échantillon de tige moi.

Un nano-sorcier JP PK. Une FM est utilisée dans cette démonstration. Pour commencer cette procédure, montez un porte-à-faux avec un engin de forme ronde sur l’A FM. Le rayon déterminera la résolution X, Y, Z et la profondeur d’indentation à laquelle une mesure précise peut être archivée.

Pour effectuer des mesures à l’échelle nanométrique à la surface de l’épiderme, utilisez une prothèse ronde de 50 nanomètres de rayon. Pour prendre des mesures à méso-échelle, utilisez une prothèse ronde de 0,5 micron de rayon, et pour prendre des mesures à l’échelle microscopique sur deux à trois cellules, utilisez une prothèse ronde de 2,5 microns de rayon et positionnez le laser à l’extrémité du porte-à-faux. Alignez le laser au milieu du capteur à l’aide du miroir.

Positionnez un verre propre sous l’approche A FM avec une cible pour le point de consigne d’un volt, sélectionnez pour la spectroscopie. Effectuez une indentation en réglant le point de consigne relatif maximal à deux volts, la vitesse d’extension à 40 microns par seconde et la longueur Z à cinq microns. Dans le menu du gestionnaire d’étalonnage, sélectionnez la partie linéaire de la courbe avant pour l’adapter à la sensibilité.

À l’aide du bouton de sélection de la plage d’ajustement, le point de consigne relatif doit être transformé de vol en mètre à 200 microlitres de solution de manitol à 10 %. Sous la pointe en porte-à-faux, réalignez le laser au milieu du capteur à l’aide du miroir, et en déplaçant le respecteur, recalibrez la sensibilité à partir du menu du gestionnaire d’étalonnage. Cliquez sur le bouton inconnu, sélectionnez quatre spectroscopies et effectuez une indentation comme indiqué précédemment.

Sélectionnez la partie linéaire de la courbe vers l’avant pour ajuster la sensibilité à l’aide du bouton de sélection de la plage d’ajustement pour commencer cette procédure, positionnez les échantillons montés sous l’A FM et ajoutez une gouttelette de 500 microlitres de solution de manitol à 10 % sur les échantillons. La solution de manitol plasmate les cellules en quelques minutes avec l’objectif pour un point de consigne de 20 nano Newtons en retrait avec un point de consigne relatif de 200 nano newtons et une vitesse d’extension de 40 microns par seconde et une longueur Z de cinq microns. Ajustez le point de consigne relatif afin d’obtenir une indentation de 100 nanomètres pour le cantilever monté sur 200 nanomètres ou de 0,5 micron pour le micron.

Mode de cartographie de la force en porte-à-faux monté sur cinq microns. Sélectionnez une région à balayer pour les tiges de 70 x 70 microns avec une résolution de 64 x 64 pour l’hypo cos et les racines de 100 x 100 microns avec une résolution de 64 x 64. Appuyez sur scan pour lancer les expériences, enregistrez la sortie.

Commencez par ouvrir le fichier de données dans le logiciel d’analyse de données. Sélectionnez ensuite le traitement par lots. Appliquer la même analyse à toutes les courbes d’une même carte.

Sélectionnez Corriger la hauteur de flexion du porte-à-faux pour extraire la profondeur d’indentation. Sélectionnez la fonction d’ajustement modulaire de Young. Cela supposera que la force est proportionnelle à la surface d’indentation.

Définissez la forme de la pointe sur parabolique pour supposer que la forme d’indentation est une parabole. Indiquez le rayon de la pointe. Ensuite, sélectionnez la courbe de retrait pour l’analyse.

La courbe de retrait est préférée à la courbe xtend car elle est moins sensible à la topographie. Réglez le rapport poso sur 0,5. Enfin, appuyez sur, analysez et enregistrez la sortie.

Des cartes modulaires typiques de A FM young de tiges florales de Mars, de jeunes et de vieux hypo coddles et de tiges MA racinaires sont montrées ici dans toutes les expériences. L’engagisme est hémisphérique, mais son rayon diffère, de sorte que différentes résolutions spatiales peuvent être obtenues. Ces cartes montrent des résultats typiques pour des empreintes à l’échelle méso à nanométrique avec un rayon de 50 nanomètres avec des empreintes de profondeur de 50 nanomètres.

Le cardiographe révèle des hétérogénéités à l’échelle microscopique dans les parois cellulaires superficielles des cellules épidermiques hypocodales. Sont également présentés des résultats typiques pour les empreintes de méso-échelle avec un rayon de 500 nanomètres avec des empreintes de profondeur de 500 nanomètres pour le méristème floral, l’hypo coddle et la racine. Ce cardiographe pour les empreintes à l’échelle microscopique avec un rayon de 2,5 microns avec des indentations de 500 nanomètres de profondeur a révélé un ramollissement des tissus lors de l’initiation de l’organe qui a précédé toute croissance visible.

Cependant, ce balayage a été interrompu en raison de la plage de hauteur de l’échantillon dépassant la plage Z maximale de la FM A. Le mouvement de l’échantillon pendant l’expérience en raison d’une mauvaise fixation peut entraîner un balayage flou, comme illustré ici. Les régions couvertes d’agros ne peuvent pas non plus être correctement mesurées, comme l’illustre cet exemple. Une fois maîtrisée, cette technique pourrait être réalisée en une heure si elle est exécutée correctement.