Name: La cartographie sur-AFM des propriétés élastiques de la paroi cellulaire: au tissu, cellulaire, et des résolutions Subcellular (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Apprenez à cartographier les propriétés mécaniques des tissus végétaux par microscopie à force atomique. Cette méthode permet d'analyser les changements mécaniques des parois cellulaires lors du développement des plantes.

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Un merci tout spécial à Yves Couder pour de nombreuses discussions utiles. Nous remercions Atef Asnacios pour l&#39;étalonnage des consoles et des discussions. Nous remercions Lisa Willis, Elliot Meyerowitz, et Oliver Hamant pour la lecture critique. Ce travail a été financé en partie par Human Frontier Science Program RGP0062/2005-C de subvention; Projets de l&#39;Agence Nationale de la Recherche&#39;&#39; Growpec,&#39;&#39; et&#39;&#39; Mechastem&#39;&#39;.

1. Préparer lames de verre pour l&#39;échantillon de montage <ol><li> Préparer plongement médias agarose: 0,7% d&#39;agarose à faible point de fusion dans 10% de mannitol (dans l&#39;eau). </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un instrument de métal solide (par exemple pointe de forage, de la chaux), graver un cm x 0,5 0,5 zone dans le centre d&#39;une lame de verre de microscope. Ou plutôt, coller un petit morceau de lamelle de verre (environ 20 x 200 um) à la lame de verre avec de la colle Araldite. REMARQUE: Cette rugosité de la surface, afin de faciliter l&#39;adhérence de l&#39;agarose afin de s&#39;assurer que les bâtonnets de médias d&#39;agarose ou des corrections à la diapositive. Cette glissière peut être réutilisé. </li><li> Positionner une gouttelette d&#39;environ 20 pi d&#39;agarose à insérer de support sur la région gravée de la lame de verre. On obtient ainsi un film mince d&#39;agarose. </li><li> Conservez la lame de verre dans une boîte humide et attendre que les médias d&#39;agarose à solidifier. </li></ol> 2. Dissection et montage échantillons méristèmes <ol><li> Microdissect méristèmes pour imagination confocaleng: supprimer les boutons floraux, un par un à partir de la tige en les tirant vers le bas avec des pincettes ultra-fines. Il est important d&#39;enlever tous les bourgeons floraux à les bourgeons qui ne présentent pas de sépales (c&#39;est à dire les ébauches de P1 14). </li><li> En utilisant une lame de rasoir ou la pointe de la pince à épiler, couper le méristème loin de la tige. La coupe doit être parallèle à la région de la surface du méristème qui doit être mesurée à l&#39;aide de l&#39;AFM. Le sommet obtenu doit être comprise entre 300 um et 600 um haute pour passer sous la pointe de l&#39;AFM. </li><li> Poussez le sommet dans le film de médias agarose préparés à l&#39;étape 1.1.4. Choisir un emplacement sur la lame de verre / agarose et pousser doucement de telle sorte que le méristème est à la fois directement en contact avec la lame de verre et fait saillie hors de l&#39;agarose. Il est essentiel de positionner le méristème dans la gélose dans les quelques secondes qui suivent sa coupe de la tige. NOTE: Ceci est pour éviter le méristème de séchage. A ce stade, le méristème sera debout dans un crack parce que l&#39;agarose fracturé lors de l&#39;application de la pression. </li><li> Préparer plusieurs méristèmes de cette manière pour l&#39;imagerie par lots, à condition qu&#39;ils soient de la même hauteur et sont placées à moins de 500 pm les unes des autres sur la diapositive. Gardez les méristèmes préparés dans la zone humide tandis que la dissection des échantillons supplémentaires. NOTE: Il limite la variation venant de l&#39;étalonnage. Idéalement 2 échantillons de chaque état peuvent être préparés et mesurés de façon aléatoire. Jusqu&#39;à présent, il est sans effet observé de l&#39;imagerie de lot sur la mesure (stress induit une réponse). Cela pourrait être, grâce à la dilution de molécules de signalisation de stress dans l&#39;agar-agar et / ou de la solution de montage. En variante, la réaction de stress est la même quelle que soit la quantité de l&#39;échantillon préparé. </li><li> Avant de passer à l&#39;étape suivante, assurez-vous que la frontière entre le méristème et les boutons floraux est sec. Sinon, retirez délicatement l&#39;excès d&#39;eau avec un papier filtre. Cela devrait éviter dans l&#39;étape suivante que le fonduagarose inonde l&#39;échantillon en raison de forces de capillarité. </li><li> Avec une pipette 20 ul, ajouter suffisamment fondu de montage agarose à remplir la fissure créée à l&#39;étape 1.2.3. et à entourer chaque méristème. L&#39;agarose devrait atteindre le niveau de la cicatrice de bourgeon de fleur enlevé (de primordium). Pour ce faire, il peut être nécessaire d&#39;ajouter d&#39;agarose à chaque extrémité de la fissure. </li><li> Lorsque la gélose est ajouté, il va rapidement inonder dans la fissure; à l&#39;aide de la pipette, aspirer une partie de l&#39;agarose fondu de montage afin de s&#39;assurer que le méristème est le point le plus haut sur le coulisseau. Cela corrige le méristème de sorte qu&#39;il ne peut pas se déplacer au cours de l&#39;imagerie. </li></ol> 3. Montage des racines ou hypocotyle échantillons <ol><li> Pour les racines et les hypocotyles, aucune dissection est nécessaire. Dans le film mince d&#39;agarose sur la lame de verre préparées, faire une rainure, soit directement au-dessus d&#39;une gravure dans le verre ou le long d&#39;une lamelle de verre. Positionner la racine ou de l&#39;hypocotyle dans cette rainure en s&#39;assurant qu&#39;il est en contact avec leverre sur toute sa longueur. </li><li> Avant de passer à l&#39;étape suivante, assurez-vous que l&#39;échantillon est sec à sa surface. Sinon, retirez délicatement l&#39;excès d&#39;eau avec un papier filtre. </li><li> Ajouter fondu de montage agarose autour de l&#39;échantillon comme dans l&#39;étape 1.2.6. </li></ol> 4. AFM Préparation et Calibrage de la sensibilité (pour un JPK Nanowizard AFM) <ol><li> Monter un porte à faux sur l&#39;AFM. Le cantilever doit être monté avec pénétrateur de forme ronde. Le rayon détermine les coordonnées x, y, z de résolution et la profondeur de pénétration au cours de laquelle une mesure précise puisse être archivée. <ol><li> Pour prendre des mesures méso-échelle nanométrique à la surface de l&#39;épiderme, utiliser un pénétrateur ronde rayon de 50 nm; de prendre des mesures méso-échelle, utiliser un rayon um pénétrateur ronde 0,5; de prendre des mesures micrométriques (dans 2-3 cellules), utiliser un pénétrateur ronde 2,5 um de rayon. </li></ol></li><li> Positionner le laser à la pointe de la poutre. Aligner le laser au milieudu capteur à l&#39;aide du miroir. </li><li> Placez un verre propre sous l&#39;AFM. Remarque: le texte suivant est réglé pour transformer le signal de la position du laser sur le récepteur AFM en une déformation de la poutre et, par l&#39;évaluation de la constante de rappel du levier, pour la traduire en une force. </li><li> Approche avec une force de cible &quot;consigne&quot; de 1 V. </li><li> Sélectionnez «spectroscopie de force&quot;. Faites une entaille en réglant le maximum &quot;point de consigne par rapport&quot; à 2 V, la &quot;étendre vitesse&quot; à 40 um / s, et le &quot;z longueur&quot; à 5 um. </li><li> Dans le menu &quot;calibrage gestionnaire&quot;, sélectionnez la partie linéaire de la courbe vers l&#39;avant pour s&#39;adapter à la sensibilité à l&#39;aide du bouton «sélectionner gamme ajustement&quot;. Le &quot;point de consigne par rapport&quot; devrait être transformé de &quot;V&quot; pour &quot;mètre&quot;. </li><li> Dans le menu «gestionnaire d&#39;étalonnage&quot;, sélectionnez &quot;constante de rappel» pour évaluer l&#39;elasticity du cantilever, avec des fluctuations thermiques. Appuyez sur &quot;Exécuter&quot; pour obtenir le tracé de la densité spectrale de la poutre. Trouver le pic de résonance à la fréquence la plus basse. Monter à l&#39;aide de la touche «select gamme ajustement&quot;. NOTE 1: Pour plus de détails sur le réglage des fluctuations thermiques, lu Cook et al 15. NOTE 2: Il est préférable d&#39;utiliser une méthode directe pour évaluer l&#39;élasticité de la poutre à l&#39;aide d&#39;une console de référence (ou matériau de raideur connue). Celle utilisée ici a été gracieusement offert par Atef Asnacios 16. </li><li> Ajouter 200 pi de solution de mannitol à 10% sous la pointe du cantilever. Réaligner le laser au moyen du capteur à l&#39;aide du miroir. </li><li> Recalibrer la sensibilité: à partir du menu &quot;calibrage gestionnaire&quot;, cliquez sur le bouton «inconnu»; répétez les étapes 2.3 à 2.5. </li></ol> . 5 Acquisition de données: module de Young apparent de Cartographie <ol&gt; <li> Placer les échantillons montés sous l&#39;AFM et ajouter une goutte de 500 pl d&#39;une solution de mannitol à 10% sur l&#39;échantillon. La solution de mannitol plasmolyzes les cellules en quelques minutes. </li><li> Approche avec une force de cible (&quot;consigne&quot;) de 20 nN (&quot;de point de consigne&quot; ne devrait pas être plus de 3 V) </li><li> Retrait d&#39;un &quot;point de consigne relative» de 200 nN, un &quot;étendre vitesse&quot; de 40 um / s, et &quot;z longueur&quot; de 5 um. </li><li> Réglez le &quot;point de consigne relative&quot; afin d&#39;obtenir une empreinte de 100 nm pour le 200 nm monté en porte à faux ou 0,5 um pour la 1 pm / 5 um cantilever monté. </li><li> En mode &quot;cartographie de la force&quot;, sélectionnez une région à numériser: pour méristèmes, 70 um x 70 um avec une résolution (&quot;pixels&quot;) de 64 x 64; pour les hypocotyles et les racines, 100 um x 100 um avec une résolution de 64 x 64. </li><li> Appuyez sur SCAN pour lancer les expériences. Enregistrez la sortie. </li&gt; </ol> 6. Analyse des données: calculs de l&#39;apparente module d&#39;Young <ol><li> Ouvrir le fichier de données dans le logiciel d&#39;analyse de données. </li><li> Sélectionnez &quot;traitement par lots&quot; pour appliquer la même analyse à toutes les courbes d&#39;une seule carte. </li><li> Sélectionner &quot;corriger la hauteur de la flexion de la poutre&quot; afin d&#39;extraire la profondeur de pénétration. </li><li> Sélectionnez &quot;module fonction d&#39;ajustement de Young» qui suppose la force est proportionnelle à la surface de l&#39;indentation. Réglez la &quot;forme de pointe&quot; pour paraboliques de supposer que la forme d&#39;indentation est une parabole. </li><li> Indiquez le rayon de la pointe. </li><li> Sélectionner préférentiellement le &quot;retract&quot; courbe de l&#39;analyse, car il est moins sensible à la topographie de la courbe &quot;étendre&quot;. Cependant, si il ya adhérence importante de la sonde au cours de la &quot;rentrée&quot;, utilisez la courbe «prolonger», qui est insensible à coller. </li><li> Setle coefficient de Poisson de 0,5. Appuyez sur analyser et enregistrer la sortie. </li></ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vitro+extensibility+of+growing+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls.</a> Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).</li>
<li>Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+plant+cell+wall+extension+%28creep%29+induced+by+acidic+pH+and+by+alpha-expansin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263(2009).</li>
<li>Durachko, D. anielM., C, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Plant+Cell+Wall+Extension+%28Creep%29+Induced+by+Acidic+pH+and+by+Alpha-Expansin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin.</a> J. Vis. Exp.. , 25(2009).</li>
<li>Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onion+epidermis+as+a+new+model+to+study+the+control+of+growth+anisotropy+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants.</a> Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).</li>
<li>Parre, E., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin+and+the+role+of+the+physical+properties+of+the+cell+wall+in+pollen+tube+growth+of+Solanum+chacoense%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense.</a> Planta. 220, 582-592 (2005).</li>
<li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental biology. 334, 437-446 (2009).</li>
<li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).</li>
<li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).</li>
<li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).</li>
<li>Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanical+contributions+of+the+pectin+matrix%3A+Insights+for+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+signaling+%26+behavior%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth.</a> Plant signaling & behavior. 7, 1037-1041 (2012).</li>
<li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).</li>
<li>Agudelo, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TipChip%3A+a+modular%2C+MEMS-based+platform+for+experimentation+and+phenotyping+of+tip-growing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).</li>
<li>Miedes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xyloglucan+endotransglucosylase%2Fhydrolase+%28XTH%29+overexpression+affects+growth+and+cell+wall+mechanics+in+etiolated+Arabidopsis+hypocotyls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls.</a> Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).</li>
<li>Byrne, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+leaves1+mediates+leaf+patterning+and+stem+cell+function+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis.</a> Nature. 408, 967-971 (2000).</li>
<li>Cook, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+implementation+of+dynamic+methods+for+measuring+atomic+force+microscope+cantilever+spring+constants%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants.</a> Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).</li>
<li>Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creep+function+of+a+single+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Creep function of a single living cell.</a> Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).</li>
<li>Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+mechanics+and+growth+control+in+plants%3A+the+role+of+pectins+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+plant+science%22%5BJournal%5D)">Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited.</a> Frontiers in plant science. 3, 121(2012).</li>
<li>Mittler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+signaling%3A+the+new+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+plant+science%22%5BJournal%5D)">ROS signaling: the new wave.</a> Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).</li>
<li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana%3A+the+relationship+between+auxin+and+pectin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS%22%5BJournal%5D)">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> PLoS. 8, e57813(2013).</li>
<li>Asnacios, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanics+behind+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The mechanics behind cell polarity.</a> Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).</li>
<li>Meister, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluidFM%3A+combining+atomic+force+microscopy+and+nanofluidics+in+a+universal+liquid+delivery+system+for+single+cell+applications+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond.</a> Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).</li>
<li>Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ball+tonometry%3A+a+rapid%2C+nondestructive+method+for+measuring+cell+turgor+pressure+in+thin-walled+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+plant+growth+regulation%22%5BJournal%5D)">Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells.</a> Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).</li>
<li>Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+or+driving+force%3F+The+role+of+turgor+pressure+in+oscillatory+plant+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth.</a> PloS one. 6, e18549(2011).</li>
<li>Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+extraction+of+Arabidopsis+cell+turgor+pressure+using+nanoindentation+in+conjunction+with+finite+element+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Chez les plantes, la modification des propriétés mécaniques jouent un rôle majeur dans la direction de la croissance et de la morphogenèse. À ce jour, il ya eu de grands progrès dans le décryptage des réseaux génétiques et chimiques qui contrôlent la croissance des plantes, mais notre connaissance de la façon dont ces réseaux contribuent à et sont affectés par les changements des propriétés mécaniques est rudimentaire. Cette méthode devrait nous permettre de combler cette lacune, et il devrait donc être de grand intérêt...

La croissance des plantes est obtenue par l&#39;expansion coordonnée des parois cellulaires rigides qui entourent chacune des cellules de l&#39;organisme. L&#39;accumulation de preuves indique que c&#39;est grâce à la modification de la chimie de la paroi cellulaire des plantes qui contrôlent localement cette expansion. L&#39;expansion est pensée pour être entraînée principalement par pression sur les parois des cellules, provoquée par la haute pression de turgescence de la cellule; cette réponse en déformation à la pression de turgescence est régie par les propriétés mécaniques des parois cellulaires 1. On sait peu de ces propriétés mécaniques et comment ils changent au cours du développement. Par ailleurs on sait peu de la façon dont ces propriétés mécaniques sont contrôlés et si des évaluations contribuent à modifier la chimie de la paroi cellulaire d&#39;une manière qui est apparemment coordonné à travers un tissu. Si nous voulons comprendre le lien entre les changements chimiques et mécaniques dans les parois cellulaires de la plante au cours du développement, et, finalement, comment ces interactions microscopiques régissent une planteDe croissance macroscopique, une méthode qui peut surveiller les propriétés mécaniques des parois cellulaires dans le développement des organes à l&#39;échelle cellulaire ou tissulaire est nécessaire. La méthode microscopie à force atomique (AFM) décrit ici, qui est basé sur micromètre ou du nanomètre compressions de tissus ou entailles, a été développé précisément pour mesurer les propriétés mécaniques des parois cellulaires dans le développement des organes simultanément à des résolutions sub-cellulaires et dans des régions entières du tissu. D&#39;autres méthodes ont soit une résolution qui est trop bas ou trop élevé: l&#39;extensomètre est seulement capable de mesurer les propriétés mécaniques moyennes d&#39;un tissu tout à l&#39;échelle du millimètre 2-4, une échelle qui est par exemple trop grande pour mesurer les événements précoces l&#39;organogenèse; la microindenter peut prendre des mesures à la résolution subcellulaire à l&#39;échelle du nanomètre, mais il est limité à la mesure des cellules isolées et non des groupes de cellules ou d&#39;organes 5-7. Avec l&#39;AFM, le besoind tissulaire, cellulaire et subcellulaire des résolutions peuvent être atteints 8-10. Récemment, plusieurs protocoles ont été développés spécifiquement pour mesurer la mécanique de plantes tissus qui pourraient également être utilisés 11, 12. Nous allons présenter ici comment évaluer l&#39;élasticité des tissus grâce à la mesure du module de Young apparent 13. Le module d&#39;Young est couramment utilisé pour décrire la rigidité du matériau. Pendant petite déformation de la force requise pour déformer un matériau est proportionnelle à la surface de l&#39;indentation. Le module d&#39;Young est ce coefficient. Dans le cas d&#39;un matériau homogène continu le même coefficient sera mesuré, indépendamment du type d&#39;indentation (de taille et la forme) mais va changer avec la vitesse de la mesure. Dans le cas de la structure complexe de tissus végétaux, nous avons observé que la mesure de la force est proportionnelle à la déformation permettant la détermination deun coefficient de proportionnalité que l&#39;on nomme «module de Young apparent». En contraste à partir de supports continus dans les plantes, ce module de Young apparent est sensible à la taille de l&#39;indentation. Elle ne correspond pas à la jeune modules d&#39;une paroi cellulaire pure. Il décrit le mieux l&#39;élasticité de l&#39;échafaudage de la paroi cellulaire du tissu.

<table><tbody><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>NanoWizard</td><td>Toutes les 3 générations sont capables de faire le travail avec le même précipice.</td></tr><tr><td>Requis</td><td></td><td></td><td>pour un échantillon à faible topographie (moins de 11 & micro ; m entre le point le plus bas et le point le plus élevé dans la zone de balayage de force).</td></tr><tr><td>Optique AFM</td><td>JPK</td><td>Vue de dessus Optique</td><td>Très importante pour positionner l’échantillon. Pourrait être remplacé par des jumelles à longue portée ou un microscope.</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica</td><td>M125</td><td>N’importe quel type de stéréomicroscope peut faire l’affaire.</td></tr><tr>Nanocapteurs <td>en porte-à-faux montés 150 nm</td><td>Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchâtel, Suisse</td><td>R150-NCL-10</td><td>Pour mesurer uniquement la paroi cellulaire à la surface de l’épiderme, utilisez.</td></tr><tr><td>1 et micro ; Nanocapteurs en porte-à-faux montés Rue</td><td>Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchâtel, Suisse</td><td>SD-Sphere-NCH-S-10</td><td>Pour mesurer la mécanique de la paroi cellulaire orthogonale à la surface de l’épiderme.</td></tr><tr><td>Nanocapteurs en porte-à-faux sans pointe</td><td>Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchâtel, Suisse</td><td>TL-NCH-20</td><td>Pour mesurer la mécanique locale du tissu (2-3 cellules de large), utilisez un 5 &micro ; Cantilever monté en M. Nous avons attaché un 5 &micro ; M perle de borosilicate à un porte-à-faux sans pointe.</td></tr><tr><td>5 et micro ; m microsphères de silicium</td><td>Corpusculaire</td><td>C-SIO-5</td><td></td></tr><tr><td>Araldite</td><td>Bartik S.A. 77170 Coubet, France</td><td></td><td>Araldite pour la fixation de la perle au porte-à-faux sans pointe.</td></tr><tr><td>Agarose à bas point de fusion</td><td>Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410</td><td>BP160-100</td><td>34-45 &#176 ; C température de gélification</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA</td><td>M4125-500G</td><td></td></tr><tr><td>2 Pince à épiler en acier inoxydable n° 5</td><td>Ideal-Tek 6828 Balerna, Suisse&nbsp ;</td><td></td><td></td>951199</tr></tbody></table>

la cartographie sur-afm des propriétés élastiques de la paroi cellulaire: au tissu, cellulaire, et des résolutions subcellular

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

Nous décrivons une méthode récemment développée pour mesurer les propriétés mécaniques des surfaces de tissus végétaux en utilisant microscopie à force atomique (AFM) micro / nano-indentations, pour un JPK AFM. Plus précisément, dans ce protocole, nous mesurons le module de parois cellulaires de Young apparent à des résolutions sub-cellulaires à travers les régions de jusqu&#39;à 100 um x 100 um de méristèmes floraux, hypocotyles et les racines. Cela nécessite une préparation minutieuse de l&#39;échantillon, la sélection correcte de micro-pénétrateurs et des profondeurs d&#39;indentation. Pour tenir compte des propriétés de la paroi cellulaire seulement, les mesures sont effectuées dans des solutions fortement concentrées de mannitol en vue de plasmolyser les cellules et ainsi supprimer la contribution de la pression de turgescence des cellules. Contrairement à d&#39;autres techniques existantes, en utilisant différents pénétrateurs et les profondeurs d&#39;indentation, cette méthode permet la mesure simultanée de plusieurs échelles, <em&gt; C&#39;est à dire à des résolutions sub-cellulaires et sur ​​des centaines de cellules comprenant un tissu. Cela signifie qu&#39;il est maintenant possible de caractériser spatialement-temporellement les changements qui ont lieu dans les propriétés mécaniques des parois cellulaires au cours du développement, l&#39;activation de ces modifications pour être en corrélation avec la croissance et la différenciation. Cela représente une étape clé pour comprendre comment les changements cellulaires microscopiques coordonnées apporter sur les événements morphogénétiques macroscopiques. Toutefois, plusieurs limitations persistent: le procédé ne peut être utilisé sur des échantillons relativement petits (autour de 100 um de diamètre) et seulement sur des tissus externes; la méthode est sensible à la topographie de tissu; il ne mesure que certains aspects des propriétés mécaniques complexes du tissu. La technique se développe rapidement et il est probable que la plupart de ces limitations seront résolus dans un proche avenir.

Dans la figure 1, nous présentons des cartes de modules jeunes typiques de méristèmes floraux (Figures 1A et 1B), jeunes et vieux hypocotyles (figures 1C-F), et méristème de la racine (figure 1G et 1H). Dans toutes les expériences, le pénétrateur est hémisphérique, mais son rayon est différent de sorte que différentes résolutions spatiales peuvent être atteints figures 1C et 1D montrent...

Nous décrivons une méthode pour cartographier les propriétés mécaniques des tissus végétaux à l’aide d’un microscope à force atomique (AFM). Nous nous concentrons sur la façon d’enregistrer les changements mécaniques qui se produisent dans les parois cellulaires au cours du développement des plantes à grande échelle à grande échelle, ce qui permet de corréler ces changements avec la croissance et la morphogenèse.

La cartographie sur-AFM des propriétés élastiques de la paroi cellulaire: au tissu, cellulaire, et des résolutions Subcellular

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

L'objectif général de cette procédure est de cartographier les propriétés mécaniques des tissus végétaux à l'aide d'un microscope à force atomique. Commencez par préparer des lames de verre en pipettant une goutte d'agarose à basse température de fusion sur une zone gravée de la lame afin de former un film mince d'agarose. La deuxième étape consiste à disséquer et monter l'échantillon.Retirez les bourgeons floraux de la tige, coupez la tige de marris loin de la tige, puis immergez immédiatement la tige de me coupée dans le film Agros fin sur le verre. Ensuite, faites glisser et ajoutez suffisamment d'agarose de montage fondu pour combler la fissure créée lors de l'insertion de la tige de Maris dans le film Aros. La dernière étape consiste à préparer le microscope à force atomique pour l'acquisition des données.En fin de compte, l'analyse des données et les mesures du module apparent de Young des parois cellulaires produisent une carte mécanique des propriétés des parois cellulaires simultanément à des résolutions subcellulaires et sur des régions entières de tissu. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu'elle permet de mesurer les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire simultanément à une résolution subcellulaire et sur une région entière du tissu. Le milieu Aros pour l'encapsulation des échantillons est préparé à partir de 0,7 % de aros à basse température de fusion dans 10 % de mannitol dans l'eau.À l’aide d’un instrument métallique robuste, comme une pointe de foret, graver une zone de 0,5 sur 0,5 centimètre au centre d’une lame de microscopie en verre. Cette action rend la surface rugueuse afin de faciliter l’adhérence de l’agarose et garantir que le milieu d’agarose adhère ou s’immobilise correctement sur la lame. Déposer une goutte d’environ 20 microlitres de milieu d’agarose d’encapsulation sur la zone gravée de la lame de verre.Cela produit un film mince d'agros. Conserver la lame de verre dans une boîte humide et attendre que le milieu Agros durcisse les échantillons d'Arabidopsis. Ana sera utilisée pour la microscopie à force atomique afin de préparer les échantillons de méristème.Retirer un à un les bourgeons floraux du pédoncule en les tirant vers le bas à l’aide de pinces ultrafines. Il est important d’éliminer tous les bourgeons floraux jusqu’aux bourgeons n’affichant pas de séquelles, appelés primordiums de stade P1. À l’aide d’un rasoir ou de la pointe des pinces, couper le méristème en le détachant du pédoncule.La coupe doit être parallèle à la région de la surface du méristème qui sera mesurée au microscope à force atomique ou en MF. L'apex obtenu doit avoir une hauteur comprise entre 300 microns et 600 microns afin de ne pas s'effriter durant l'expérience. Enfoncez immédiatement l'apex dans la fine couche de milieu aros préparée précédemment. Choisissez une position sur la lame de verre ou sur le aros et enfoncez délicatement de sorte que le méristème soit en contact direct avec la lame de verre tout en dépassant légèrement du aros.L'agros se fracture lors de l'application d'une pression, de sorte que la tige de mari se retrouvera désormais dans une fissure. Il est essentiel de positionner la tige de marit dans l'aros en quelques secondes seulement après sa coupe sur la tige. Cela empêche la dessiccation de la tige de MA.Plusieurs tiges de MA peuvent être préparées de cette manière pour une imagerie en lot, à condition qu'elles aient la même hauteur et soient positionnées à moins de 500 micromètres l'une de l'autre. Sur la lame, conservez les tiges de MA préparées dans la boîte humide pendant la dissection d'autres échantillons. Avant de passer à l'étape suivante, utilisez du papier filtre pour retirer délicatement tout excès d'eau au niveau de la frontière entre le méristème et les bourgeons floraux.Cela permet d'éviter que l'agarose fondue ne déborde sur l'échantillon en raison des forces capillaires. Ensuite, à l’aide d’une pipette de 20 microlitres, ajouter suffisamment d’agarose fondue pour combler la fente créée précédemment et entourer chaque méristème ; l’agarose doit atteindre le niveau de la cicatrice du bourgeon floral ou du primordium retiré. Pour y parvenir, il peut être nécessaire d’ajouter de l’agarose à chaque extrémité de la fente.Lorsque l'agarose est ajoutée, elle envahit rapidement la fente. À l'aide de la pipette, aspirez un peu d'agarose fondue afin de vous assurer que le méristème est le point le plus élevé sur la lame. Cela fixe le méristème pour qu'il ne puisse pas bouger pendant l'observation des racines et des hypocotylés.Aucune dissection n'est nécessaire dans la mince couche d'agar. Sur la lame de verre préparée, utilisez des pinces fines pour créer un sillon soit directement au-dessus d'une entaille dans le verre, soit le long d'une lamelle de verre ; placez la racine ou l'hypocotyle dans ce sillon, en veillant à ce qu'elle soit en contact avec le verre sur toute sa longueur. Ajoutez de l'agar de montage fondu autour de l'échantillon de la même manière que celle illustrée pour l'échantillon de tige.Un expert nano JP PK. Un FM est utilisé dans cette démonstration. Pour commencer cette procédure, montez un levier avec une empreinte de forme ronde sur le FM. Le rayon déterminera la résolution X, Y, Z et la profondeur d'indentation à laquelle une mesure précise peut être obtenue.Pour effectuer des mesures à l'échelle mésoscopique à nanoscopique à la surface de l'épiderme, utilisez une empreinte ronde de rayon 50 nanomètres. Pour effectuer des mesures à l'échelle mésoscopique, utilisez une empreinte ronde de rayon 0,5 micron, et pour effectuer des mesures à l'échelle microscopique couvrant deux à trois cellules, utilisez une empreinte ronde de rayon 2,5 microns. Positionnez le laser à l'extrémité du levier. Alignez le laser au centre du capteur à l'aide du miroir.Placez un verre propre sous l'approche A FM avec une cible pour un point de consigne de un volt, sélectionnez la spectroscopie. Effectuez une indentation en réglant le point de consigne relatif maximal à deux volts, la vitesse d'extension à 40 microns par seconde et la longueur Z à cinq microns. À partir du menu du gestionnaire d'étalonnage, sélectionnez la partie linéaire de la courbe directe pour ajuster la sensibilité.À l’aide du bouton de sélection de la plage d’ajustement, le point de consigne relatif doit être transformé de vol à mètre à 200 microlitres d’une solution de mannitol à 10 %. Sous la pointe du levier, réaligner le laser au centre du capteur à l’aide du miroir, puis, en déplaçant le dispositif, recalibrer la sensibilité depuis le menu du gestionnaire d’étalonnage. Cliquer sur le bouton inconnu, sélectionner quatre spectroscopies, puis effectuer une indentation comme indiqué précédemment.Sélectionnez la partie linéaire de la courbe avant afin d'ajuster la sensibilité à l'aide du bouton de sélection de la plage d'ajustement pour démarrer cette procédure, placez les échantillons montés sous le microscope à force atomique (A FM) et ajoutez une goutte de 500 microlitres de solution de mannitol à 10 % sur les échantillons. La solution de mannitol plasmolyse les cellules en quelques minutes ; approchez avec une cible fixée à 20 nano newtons d'indentation, un point de consigne relatif de 200 nano newtons, une vitesse d'extension de 40 micromètres par seconde et une longueur Z de cinq micromètres. Ajustez le point de consigne relatif afin d'obtenir une indentation de 100 nanomètres pour le levier monté de 200 nanomètres ou de 0,5 micromètre pour celui de un micromètre.Mode de cartographie de force à cantilever monté de 5 microns. Sélectionnez une région à balayer : 70 par 70 microns pour les tiges mar, avec une résolution de 64 par 64, et 100 par 100 microns pour les racines, avec une résolution de 64 par 64. Appuyez sur balayage pour lancer les expériences, puis enregistrez les résultats.Commencez par ouvrir le fichier de données dans le logiciel d'analyse. Sélectionnez ensuite le traitement par lot afin d'appliquer la même analyse à toutes les courbes d'une carte unique.Sélectionnez la hauteur appropriée pour la flexion du levier afin d'extraire la profondeur d'indentation. Sélectionnez la fonction d'ajustement du module de Young. Celle-ci supposera que la force est proportionnelle à la surface d'indentation.Définissez la forme de la pointe comme étant parabolique afin de supposer que la forme d'indentation est une parabole. Indiquez le rayon de la pointe. Ensuite, sélectionnez la courbe de retrait pour l'analyse.La courbe de rétraction est préférée à la courbe d'extension car elle est moins sensible à la topographie. Réglez le rapport poso à 0,5. Enfin, appuyez sur analyser et enregistrez le résultat.Des cartes modulaires typiques de microscopie à force atomique (AFM) de tiges florales de jeunes et vieux plants de Mars, ainsi que des tiges méristématiques racinaires (MA), sont présentées ici dans toutes les expériences. L'empreinte est hémisphérique, mais son rayon varie afin d'obtenir différentes résolutions spatiales. Ces cartes illustrent des résultats typiques pour des empreintes à l'échelle mésoscopique à nanométrique avec un rayon de 50 nanomètres et des indentations d'une profondeur de 50 nanomètres.Le cardiographe révèle des hétérogénéités à l'échelle microscopique dans les parois cellulaires superficielles des cellules épidermiques hypodermiques. Sont également présentés des résultats typiques pour des empreintes à l'échelle mésoscopique réalisées avec un rayon de 500 nanomètres et des profondeurs d'indentation de 500 nanomètres, sur le méristème floral, l'hypoderme et la racine. Ce cardiographe pour des empreintes à l'échelle microscopique, réalisées avec un rayon de 2,5 microns et des profondeurs d'indentation de 500 nanomètres, a révélé un ramollissement tissulaire durant l'initiation des organes, précédant toute croissance visible.Cependant, cet examen a été interrompu en raison de l'amplitude de variation de la hauteur de l'échantillon dépassant la course maximale en Z du microscope à force atomique. Un déplacement de l'échantillon pendant l'expérience, dû à une fixation inadéquate, peut entraîner un examen flou, comme illustré ici. Les régions recouvertes d'agros ne peuvent pas non plus être mesurées correctement, comme le montre cet exemple. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure si elle est exécutée correctement.

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JoVE Journal

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Biologie

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Micro-Mécanique de caractérisation du tissu pulmonaire par microscopie à force atomique

Cet article démontre un protocole pour caractériser les propriétés mécaniques des cellules vivantes au moyen de microindentation aide d'un microscope à force atomique (AFM).

Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Un nouveau protocole d’imagerie a été développé à l’aide d’un actionneur mécanique motorisé personnalisé pour permettre la mesure des réponses en temps réel à la déformation mécanique dans les cellules vivantes. Pertinent pour la mécanobiologie, le système peut appliquer des contraintes allant jusqu’à 20 % tout en permettant une imagerie en temps quasi réel avec la microscopie confocale ou à force atomique.

Imagerie sur cellule vivante pendant stretch mécanique

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Résolution Quantification haut de Crystalline Cellulose Accumulation dans<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots pour surveiller cellulaire spécifique d&#39;un tissu mural Modifications

Ici, nous présentons la microscopie de force atomique (AFM), actionnée comme outil de nano- et de micro-indentation sur des cellules et des tissus. L'instrument permet l'acquisition simultanée de la topographie de surface 3D de l'échantillon et de ses propriétés mécaniques, y compris le modulus de la paroi cellulaire de Young ainsi que la pression de la turgor.

Utilisation de la microscopie de force atomique pour mesurer les propriétés mécaniques et la pression turgor des cellules et des tissus végétaux

Ce protocole vise à automatiser les mesures AFM sur des centaines de cellules microbiennes. Tout d’abord, les microbes sont immobilisés dans des microstructures de tampon PDMS, puis des mesures de spectroscopie de force sont effectuées automatiquement sur des centaines de cellules immobilisées.

Automatisation des mesures de microscope à force bioatomique sur des centaines de cellules de C. albicans

Présenté ici est le protocole de la technique Conpokal, qui combine la microscopie confoccale et de force atomique en une seule plate-forme d’instrument. Conpokal fournit la même cellule, la même région, l’imagerie confocale presque simultanée et la caractérisation mécanique des échantillons biologiques vivants.

À proximité de Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Le protocole d’indentation par microscopie à force atomique offre la possibilité de disséquer le rôle des propriétés physiques de la paroi cellulaire d’une cellule particulière d’un tissu ou d’un organe pendant une croissance normale ou contrainte (c’est-à-dire sous déficit hydrique).

Microscopie à force atomique pour étudier les propriétés physiques des cellules épidermiques des racines vivantes d’Arabidopsis

Les études de la biomécanique de la paroi cellulaire sont essentielles pour comprendre la croissance et la morphogenèse des plantes. Le protocole suivant est proposé pour étudier les parois cellulaires primaires minces dans les tissus internes des jeunes organes végétaux à l’aide de la microscopie à force atomique.

Caractérisation des propriétés mécaniques de la paroi cellulaire primaire dans les organes vivants de plantes à l’aide de la microscopie à force atomique

La quantification de la zone de contact et de la force appliquée par la pointe d’une sonde de microscope à force atomique (AFM) à une surface d’échantillon permet de déterminer les propriétés mécaniques à l’échelle nanométrique. Les meilleures pratiques pour mettre en œuvre la nanoindentation à base de porte-à-faux AFM dans l’air ou le fluide sur des échantillons mous et durs pour mesurer le module d’élasticité ou d’autres propriétés nanomécaniques sont discutées.

Microscopie à force atomique Nanoindentation basée sur le porte-à-faux: mesures des propriétés mécaniques à l’échelle nanométrique dans l’air et les fluides

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Apprenez à cartographier les propriétés mécaniques des tissus végétaux par microscopie à force atomique. Cette méthode permet d'analyser les changements mécaniques des parois cellulaires lors du développement des plantes.

La cartographie sur-AFM des propriétés élastiques de la paroi cellulaire: au tissu, cellulaire, et des résolutions Subcellular

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