Une microplaque de dosage rapide et spécifique pour la détermination de l'ascorbate intra-et extracellulaire dans les cellules cultivées

L’objectif général de l’expérience suivante est de déterminer les niveaux d’ascorbate intracellulaires ou extracellulaires dans des cellules cultivées ou isolées. Ceci est réalisé en incubant des extraits cellulaires ou des cellules entières avec un score oxydase pour épuiser sélectivement un score BA dans les étapes suivantes. Dans la première méthode, les extraits cellulaires sont incubés avec du cyanure pour générer du ferrocyanure de manière dépendante de l’ascorbate, ce qui donne une représentation directe de la quantité d’ascorbate dans les extraits.

Ensuite, la quantité de ferrocyanure formée dans les extraits cellulaires est déterminée en oxydant quantitativement le ferrocyanure avec du fer ferrique ajouté pour former du fer ferreux afin de générer un complexe chromogène fer deux fougère S qui peut être quantifié spectrométriquement. Dans la deuxième méthode, toutes les cellules sont directement incubées avec la fougère chélatrice S et le citrate ferrique. Les résultats montrent des différences dans les niveaux d’ascorbate intracellulaires ou extracellulaires en fonction de la réduction quantitative et spécifique des complexes de fer extracellulaires qui peuvent être détectés.

Spectrométriquement. Le principal avantage de la technique actuelle par rapport aux méthodes déjà en place comme la détection basée sur HBLC est que ce dosage très spécifique des microplaques peut être effectué très rapidement et que tous les échantillons et étalons peuvent être traités en parallèle plutôt qu’en série avant de commencer cette procédure. Cultiver K 5 62 cellules en suspension et créer dans un score BA contenant un extrait cellulaire.

Ensuite, préparez une solution mère de 10 millimolaires d’acide ascorbique dans du PBS glacé. Préparez ensuite soigneusement une série d’étalons d’ascorbate entre zéro et 20 micromolaires. Retirez soigneusement quatre aliquotes de 100 microlitres de chaque étalon et ajoutez-les à une séquence horizontale de puits.

Dans une plaque à fond plat de 96 puits qui contient 25 microlitres par puits de PBS ou 45,5 unités par millilitre. La solution mère de L ascorbate oxydase ou AO dans le PBS recouvre la plaque de 96 puits d’une feuille et d’une orbitale. Mélangez-le à 550 tr/min à température ambiante pendant cinq minutes.

Une fois terminé, ajoutez 50 microlitres de cyanure de Ferris de potassium de 3,5 millimolaires dans du PBS à tous les puits pour obtenir une concentration finale de cyanure de Ferris d’un millimolaire après mélange orbital de la plaque de 96 puits, en utilisant les mêmes conditions que précédemment. Ajouter immédiatement 25 microlitres d’une solution fraîchement préparée contenant 50 % d’acide acétique et 30 % d’acide trichloracétique. Ensuite, ajoutez 100 microlitres d’une solution de dosage de cyanure Pharaoh fraîchement préparée à chaque orbitale de puits.

Mélangez la plaque dans l’obscurité à 550 tr/min pendant 30 minutes à température ambiante. Lisez ensuite les valeurs d’absorbance des puits à 593 nanomètres. Pour commencer le test.

Oxydez d’abord l’ascorbate extracellulaire dans des puits sélectionnés en ajoutant 50 microlitres de 120 unités par millilitre d’AO ou de HBSD dans des puits appariés en trois exemplaires pour obtenir une concentration finale d’AO de 10 unités par millilitre. Après cette étiquette, les puits appariés sont moins AO et plus ao. Après avoir mélangé les plaques avec un mélange orbital doux pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius, ajoutez 50 microlitres de Ferne S de 2,4 millimolaires dans tous les puits pour donner une concentration finale de fougère de 200 micromolaires, mélangez les plaques comme ci-dessus pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres de citrate ferrique micromolaire de 120 micromolaires fraîchement préparé dans tous les puits pour obtenir des concentrations finales de fer et de citrate de 10 micromolaires de fer et de 50 micromolaires de citrate respectivement. Bien mélanger à la fin du dosage de l’ascorbate FLX. Aspirez rapidement le milieu sus-jacent de chaque puits et ajoutez-le aux puits étiquetés de manière appropriée dans une plaque de 24 puits.

Ensuite, ajoutez trois aliquotes d’un microlitre du surnageant dans une plaque à 96 puits pour déterminer l’ascorbate extracellulaire. Lire les valeurs d’absorbance des puits à 593 nanomètres dans un spectrophotomètre à microplaques. Enfin, calculez la quantité d’ascorbate extracellulaire en m ascorbate par milligramme de protéine indiquée.

Voici une courbe standard typique pour un ensemble d’étalons d’ascorbate, de zéro à 20 micromolaires ou de zéro à deux ascorbates NMO par puits. Sur la plaque de 96 puits, bien qu’elle ne soit pas représentée ici, la linéarité est maintenue jusqu’à huit ascorbates NMO par puits, ce qui correspond à une concentration d’ascorbate de l’échantillon d’environ 80 micromolaires. Le test peut être utilisé pour détecter avec succès des niveaux d’ascorbate inférieurs à 0,25 ole ascorbate par puits.

K 5 62 cellules accumulent rapidement de l’ascorbate intracellulaire à partir de l’acide déhydro-ascorbique L extracellulaire, mais pas d’ascorbate. Dans cette expérience représentative, 62 cellules ont été incubées dans du PBS avec 500 micromolaires d’ascorbate déhydro, d’acide ascorbique L, d’acide ascorbique L et d’acide ascorbique 50 micromolaires, d’ascorbate de cyto B et de cyanure de cinq millimolaires, ou d’ascorbate plus 50 unités par millilitre d’AO pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. L’ascorbate intracellulaire a été déterminé comme décrit précédemment.

L’absorption de l’acide ascorbique déhydro L par les cellules K 5 62 se produit par le transport facilitateur du transporteur de glucose par le moyen du fessier pour évaluer l’implication des fessiers dans l’absorption de l’acide ascorbique déhydro L. Dans cette expérience représentative, des cellules K 5 62 ont été incubées avec des concentrations croissantes de cyto B ou de dihydro cyto B avant d’être incubées avec de l’acide ascorbique déhydro L. Il est important de noter que, alors que la cyto callin B et la dihydro cyto B inhibent les processus mobiles à des concentrations micromolaires, seule la cyto callin B, qui diffère de la dihydrocyto B par la présence d’une seule double liaison, inhibe le transport dépendant des fessiers à de faibles concentrations micromolaires.

Par conséquent, comme l’absorption de l’acide ascorbique déhydro L a été inhibée par la cytose B avec une CI 50 inférieure à 2,5 micromolaires, mais n’a pas été inhibée par la cytocyto. B dehydro. L’absorption de l’acide ascorbique L se produit probablement par transport par les fessiers.

Alternativement, les cellules lavées ont été exposées à des concentrations croissantes de l’analogue du glucose 3 O méthyl D glucose transportable par le fessier, mais non métabolisable, ou de l’isomère stéréo du glucose L glucose non transportable par le fessier pendant l’incubation avec de l’acide ascorbique déhydro L. Encore une fois, les résultats indiquent l’implication de la glu dans l’importation d’acide ascorbique déhydro L, car l’inhibition de l’accumulation intracellulaire d’ascorbate ne se produit qu’en présence de l’analogue du glucose transportable par le fessier. Dans le deuxième essai.

Le taux d’efflux d’ascorbate des cellules cultivées peut être déterminé. Ce test spécifique est important car la libération d’ascorbate par les cellules semble être cruciale pour l’absorption cellulaire régulée par l’ascorbate du fer non lié à la transferrine par les cellules. L’absorption du fer non lié à la transferrine est considérée comme pertinente pour la physiopathologie des troubles de la surcharge en fer, tels que l’hémochromatose, ainsi que pour l’échange de fer et l’homéostasie des neurones astrocytaires dans le cerveau des mammifères.

En effet, le principal neurotransmetteur excitateur L glutamate déclenche la libération d’ascorbate pour les astrocytes d’une manière qui dépend du L glutamate, de l’absorption par le verre et probablement du GLT un et du gonflement cellulaire ultérieur qui déclenche la libération d’ascorbate par les VSO putatives. Par analogie, la libération d’un score A à partir d’astrocytes chargés d’un score A B peut être stimulée par l’acide aminé excitateur L aspartate, mais pas par l’acide aminé non excitateur L glutamine. Cet effet est décrit ici, qui montre les courbes dose-réponse pour la stimulation de la libération d’ascorbate par l’aspartate et la glutamine à partir de cultures primaires d’astrocytes de souris chargés d’ascorbate Une fois maîtrisé.

Cette technique peut être réalisée en aussi peu que deux heures si elle est exécutée correctement.