Préparation de l'ADN réticulé polyacrylamide hydrogels

L’objectif global de cette procédure est de préparer des hydrogels de polyacrylamide réticulés qui peuvent se rigidifier ou se ramollir par le pipetage d’ADN simple brin dans le milieu de culture après que les cellules ont été plaquées sur le dessus. Ceci est accompli en suspendant d’abord les solutions lyophilisées SA un, SA deux L deux R deux, et en contrôlant les ADN monocaténaires dans un tampon et en polymérisant individuellement les solutions SA un et SA deux en un squelette de poly acrylamide acrylamide. La deuxième étape consiste à mélanger les solutions polymérisées SA un et SA deux avec la solution L deux pour former le gel d’ADN.

Ensuite, la solution de gel d’ADN est ensuite immobilisée sur des lamelles de verre avec de la colle optique. La dernière étape consiste à fonctionnaliser les gels en les traitant avec du sul sampa puis du PDL. En fin de compte, les cellules sont plaquées sur les gels d’ADN et l’élasticité du gel est modulée avec l’ajout de R deux, L, deux ou contrôle de l’ADN simple brin pour adoucir, rigidifier ou ne pas modifier l’élasticité du gel, respectivement.

Les résultats de ces expériences montrent que la nature dynamique du substrat sous-jacent dirige le comportement cellulaire, L’avantage d’utiliser cette technique par rapport à d’autres méthodes telles que les CRO, le lingo, les hydrogels à billes, est que les gels d’ADN n’ont pas besoin d’un stimulus tel que les UV pour moduler leur élasticité. Au lieu de cela, les gels d’ADN sont rigidifiés et ramollis par la diffusion de L deux ou R deux, ADN simple brin à travers le gel respectivement. La première centrifugeuse a lyophilisé SA un ADN simple brin à 2000 GS pendant 15 secondes pour s’assurer que tout l’ADN simple brin se trouve au fond du tube.

Après la centrifugation, préparez trois millimolaires de solution SA one en ajoutant 107 microlitres d’un tampon x tris, EDTA ou TE dans le tube Chauffez le tampon SA one NTE à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que la pastille d’ADN simple brin soit complètement dissoute. Ensuite, préparez la solution polymérisée SA one en ajoutant 45 microlitres d’acrylamide à 40 % et 18 microlitres de tampon et centrifugeuse 10 x tribo, EDTA ou TBE. Ce mélange pour faciliter le mélange.

Insérez un embout P 200, fixez-le à une source d’azote gazeux dans la solution et laissez lentement l’azote gazeux passer à travers la solution pendant deux à trois minutes. Ensuite, centrifugez l’échantillon pendant 15 secondes à 2000 Gs pour recueillir la solution Une fois terminé à 4,5 microlitres de 2 % d’ammonium par sulfate ou un PS à l’échantillon pour initier la polymérisation du gel, retournez le tube plusieurs fois pour mélanger Après avoir centrifugé l’échantillon pour recueillir la solution pour une polymérisation homogène, ajoutez 4,5 microlitres de 20 % de tétraéthylméthylène, diamine, ou teed à l’échantillon pour catalyser la polymérisation Une fois que l’échantillon a subi, le mélange et la centrifugation. Dégazez la solution avec de l’azote gazeux pendant trois à cinq minutes pour terminer la polymérisation et minimiser les monomères non réactifs.

Ensuite, incubez la solution pendant 10 minutes à température ambiante pour terminer la polymérisation et donnez à l’AS une solution polymérisée. Répétez les étapes précédentes avec de l’ADN simple brin double brin SA lyophilisé, en ajoutant respectivement 45, 18, 4, 0,5 et 4,5 microlitres d’acrylamide T-B-E-A-P-S et teed à 108 microlitres de la solution SA deux. Pour préparer les solutions L deux R deux et témoins, centrifuger, lyophilisé, ADN simple brin et ajouter les quantités suivantes de tampon TE à l’ADN simple brin lyophilisé correspondant comme décrit précédemment, chauffer la solution jusqu’à dissolution pour la solution de gel.

Les préparations chauffent les solutions polymérisées s sa one et SA two à 70 degrés Celsius pendant environ une minute. Jusqu’à ce que la viscosité de la solution soit réduite. Ajoutez 10 microlitres ou 10 parties de la solution polymérisée SA one à 10 microlitres ou 10 parties de la solution polymérisée SA two.

Mélangez ensuite les solutions polymérisées SA one et SA two en alternant le chauffage pendant 15 secondes à 70 degrés Celsius et en agitant pendant 15 secondes avec une pointe de pipette pendant un total d’une minute. Après avoir mélangé à six microlitres ou six parties de 100 % L, deux solutions pour former un gel à 100 %. Une fois que l’échantillon a été mélangé comme décrit précédemment, pipetez le gel à 100 % dans une boîte de Pétri de 60 millimètres et chauffez le gel pendant une heure à la température de recuit optimale.

Ensuite, laissez les réticulations de l’ADN continuer à se réhybrider en incubant les gels pendant quatre heures à température ambiante. Couvrez le gel avec du PBS contenant du calcium au magnésium après une nuit d’incubation à température ambiante, retirez le tampon restant de la boîte de Pétri et placez le gel dans un microtube de centrifugation. À ce stade, chauffez le gel à 100 % à 70 degrés Celsius pendant environ 30 secondes ou jusqu’à ce que le gel soit moins visqueux.

Pour le pipetage, placez le couvercle en verre sur un bloc de chaleur à 70 degrés Celsius et laissez-les chauffer pendant une à deux minutes. Ajoutez une goutte d’adhésif optique sur chaque lamelle de verre. Ajoutez ensuite 20 microlitres de gel à 100 % dans chaque lamelle en verre, et laissez le gel fondre et s’étaler dessus.

Retirez chaque verre contenant du gel du bloc de chaleur et placez-les dans une boîte de culture tissulaire de 24 puits. Exposez les gels à une lumière UV de 365 nanomètres pendant 15 minutes. Après avoir chauffé le gel pendant une heure à la température anale optimale et permis aux réticulations d’ADN de se réhybrider pendant quatre heures, ajoutez-y du PBS.

Ensuite, incubez les gels pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, retirez le tampon des puits à l’aide d’une pipette en prenant soin de ne pas aspirer le gel. Ajoutez ensuite du sulfa sampa pour couvrir chaque gel.

Une fois que les gels ont été exposés à une lumière UV de 365 nanomètres pendant 15 minutes, retirez le sulfamide sampa. Rincez les gels une fois avec du PBS pour éliminer l’excès de sulfa sampa après avoir répété les étapes précédentes, incubez les gels dans environ 300 microlitres de 0,2 milligramme par millilitre de poly de lycine pendant la nuit à quatre degrés Celsius Lorsque vous avez terminé, lavez les gels deux fois avec du PBS pendant cinq minutes pour éliminer l’excès de polylysine et ajoutez du milieu. Une fois que les gels ont été incubés dans le milieu pendant 30 minutes, retirez le milieu immédiatement avant de plaquer les cellules pour la culture cellulaire et l’imagerie.

Les fibroblastes cultivés sur des gels raidissants n’avaient aucune altération du rapport d’aspect, mais présentaient une plus grande surface de projection que les fibroblastes cultivés sur des gels à 100 %. Les fibroblastes cultivés sur des gels à 100 % avaient une surface de projection plus petite et un rapport d’aspect plus grand que les fibroblastes cultivés sur des gels à 80 %. Ces résultats indiquent que le comportement des fibroblastes dépend de la nature dynamique du microenvironnement.

Les neurones cultivés sur des gels adoucissants ne présentaient aucune différence dans le nombre de dendrites primaires ou la longueur des axones, mais présentaient des dendrites primaires plus courtes que les neurones cultivés sur des gels à 50 %. Comme dans les études sur les fibroblastes, les phénotypes neurologiques sur les gels statiques étaient différents des phénotypes neurologiques sur les gels dynamiques. Les neurones cultivés sur des gels à 50 % avaient moins de dendrites primaires et des axones plus longs que les neurones cultivés sur des gels à 100 %.

Bien qu’il soit extrêmement important de se rappeler de pipeter avec précision le gel visqueux, car les concentrations sont importantes pour éviter l’éclatement du gel, un pipetage précis peut prendre plusieurs tentatives, et nous proposons plusieurs autres options dans la partie discussion de ce protocole.