Name: Préparation de lADN réticulé polyacrylamide hydrogels (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Apprenez à préparer des hydrogels de polyacrylamide réticulés par ADN pour étudier la rigidité tissulaire et son effet sur le comportement cellulaire. Cette méthode permet de moduler l'élasticité du gel via l'ajout d'ADN monocaténaire.

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Les auteurs tiennent à remercier: Dr Frank Jiang, le Dr David Lin, le Dr Bernard Yurke et le Dr Uday Chippada pour leurs contributions sur le développement de la technologie d&#39;ADN sur gel; Dr Norell Hadzimichalis, Smit Shah, Kimberly Peterman, Robert Arter pour leurs commentaires et modifications de ce manuscrit; sources de financement, y compris la Commission du New Jersey sur la moelle épinière de la recherche (subvention no 07A-019-SCR1, NAL) et du New Jersey Institut des Neurosciences (MLP); et les éditeurs de génie tissulaire, la partie A pour obtenir la permission de réimprimer les figures 2 et 4 et des biomatériaux pour l&#39;autorisation de reproduire la figure 3.

<ol><li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+focal+adhesion+assembly+A+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).</li>
<li>Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+equilibrium+swelling+behaviour+of+ph-sensitive+hydrogels+containing+2-hydroxyethyl+methacrylate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate.</a> Biomaterials. 11 (9), 635-644 (1990).</li>
<li>Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+elastomeric+biomaterials+based+on+resilin-like+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic elastomeric biomaterials based on resilin-like polypeptides.</a> Soft Matter. 5 (18), 3412-3416 (2009).</li>
<li>Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cell+behavior+on+shape+memory+polymer+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates.</a> Biomaterials. 32 (9), 2285-2293 (2011).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophys J. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Gray, D. S., Tien, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repositioning+of+cells+by+mechanotaxis+on+surfaces+with+micropatterned+youngs+modulus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned youngs modulus.</a> J Biomed Mater Res A. 66 (3), 605-614 (2003).</li>
<li>Homma, M., Seida, Y., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ions+on+the+dynamic+behavior+of+an+electrodriven+ionic+polymer+hydrogel+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of ions on the dynamic behavior of an electrodriven ionic polymer hydrogel membrane.</a> Journal of applied Polymer Science. 82 (1), 76-80 (2001).</li>
<li>Horkay, F., Tasaki, I., Basser, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+swelling+of+polyacrylate+hydrogels+in+physiological+salt+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions.</a> Biomacromolecules. 1 (1), 84-90 (2000).</li>
<li>Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+on+a+DNA+crosslinked+hydrogel+with+tunable+stiffnesses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses.</a> Ann Biomed Eng. 36 (9), 1565-1579 (2008).</li>
<li>Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+dynamic+stiffness+of+the+substrates+on+neurite+outgrowth+by+using+a+DNA-crosslinked+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (6), 1873-1889 (2010).</li>
<li>Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+fibroblast+growth+and+the+dynamic+stiffnesses+of+a+DNA+crosslinked+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel.</a> Biomaterials. 31 (6), 1199-1212 (2010).</li>
<li>Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+photodegradable+hydrogels+as+dynamically+tunable+cell+culture+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms.</a> Nat Protoc. 5 (12), 1867-1887 (2010).</li>
<li>Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+a+reversible%2C+DNA-crosslinked+polyacrylamide+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of a reversible, DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel.</a> J Biomech Eng. 126 (1), 104-110 (2004).</li>
<li>Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+rigid+spherical+inclusions+in+young%27s+moduli+determination%3A+Application+to+DNA-crosslinked+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Use of rigid spherical inclusions in young's moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels.</a> J Biomech Eng. 127 (4), 571-579 (2005).</li>
<li>Luo, Y., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+immobilization+of+biomolecules+to+agarose+hydrogels+for+controlled+cellular+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response.</a> Biomacromolecules. 5 (6), 2315-2323 (2004).</li>
<li>Marklein, R. A., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+controlled+hydrogel+mechanics+to+modulate+stem+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Spatially controlled hydrogel mechanics to modulate stem cell interactions.</a> Soft Matter. 6 (1), 136-143 (2010).</li>
<li>Pelham Jr, R. J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li>
<li>Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+DNA-crosslinked+polyacrylamide+hydrogels+with+increasing+crosslinker+density%5BTitle%5D)+AND+%22BioResearch+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density.</a> BioResearch Open Access. 1 (5), 256-259 (2012).</li>
<li>Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+and+cell+density+on+primary+hippocampal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures.</a> J Biosci Bioeng. 110 (4), 459-470 (2010).</li>
<li>Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Langrana, N. A., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendrite+arborization+by+substrate+stiffness+is+mediated+by+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendrite arborization by substrate stiffness is mediated by glutamate receptors.</a> Ann Biomed Eng. 38 (12), 3733-3743 (2010).</li>
<li>Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+morphology+on+dynamic+softening+of+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels.</a> Ann Biomed Eng. 40 (5), 1061-1072 (2012).</li>
<li>Saxena, T., Gilbert, J., Stelzner, D., Hasenwinkel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+characterization+of+the+injured+spinal+cord+after+lateral+spinal+hemisection+injury+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mechanical characterization of the injured spinal cord after lateral spinal hemisection injury in the rat.</a> J Neurotrauma. 29 (9), 1747-1757 (2012).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+growth+in+3d+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Neurite growth in 3d collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnol Bioeng. 102 (2), 632-643 (2009).</li>
<li>Wozniak, M. A., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+in+development+A+growing+role+for+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction in development A growing role for contractility.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).</li>
<li>Wuerfel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mr-elastography+reveals+degradation+of+tissue+integrity+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Mr-elastography reveals degradation of tissue integrity in multiple sclerosis.</a> Neuroimage. 49 (3), 2520-2525 (2012).</li>
<li>Zaari, N., Rajagopalan, P., Kim, S. K., Engler, A. J., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photopolymerization+in+microfluidic+gradient+generators+Microscale+control+of+substrate+compliance+to+manipulate+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Photopolymerization in microfluidic gradient generators Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response.</a> Adv Mater. 16 (23-24), 2133-2137 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

La capacité de gels d&#39;ADN pour adoucir ou raidir avant et après l&#39;adhésion cellulaire en fait un modèle idéal pour étudier le rôle de la raideur dynamique en fonction du tissu cellulaire. Ces trois modèles ont été utilisés dans les études biologiques et mécaniques. Toutefois, les trois modèles ont des élasticités semblables à différents pourcentages de réticulation, indiquant la longueur de réticulation n&#39;influence pas l&#39;élasticité de gel d&#39;ADN (tableau 2). En revanche, la concentrat...

Substrats statiques et dynamiques sont deux catégories de biomatériaux qui ont été développés pour étudier les effets de l&#39;élasticité des tissus ou de la rigidité sur la fonction cellulaire. Substrats statiques sont incapables de modifier leurs propriétés physiques après ils sont fabriqués et / ou une fois les cellules sont étalées. Polyacrylamide (PA) ont été les premiers gels, des substrats statiques à deux dimensions qui ont été synthétisés pour les enquêtes sur mécanobiologie 5,17. Gels PA sont faciles à préparer, peu coûteux, polyvalent, et peuvent être fabriqués avec une large gamme de modules d&#39;élasticité. Bien que ces avantages techniques font PA gélifie un substrat communément appliqué, substrats statiques ne sont pas représentatifs de la nature dynamique de la matrice extracellulaire (MEC) et entourant environnement cellulaire in vivo. Par exemple, l&#39;ECM subit des altérations rigidité à la suite de blessures, le développement ou la maladie. Substrats dynamiques sont donc favorisés que les modèles de substrat tissus imitant dans les études de mécanobiologie <sup&gt; 22,24,25. De nombreux synthétique, deux dimensions, biomatériaux, en trois dimensions, statiques, dynamiques et naturelles ont été développées pour imiter la rigidité des tissus 1,3,6,16,23,26. Certains supports dynamiques ont besoin de chaleur, UV, le courant électrique, les ions, et des changements de pH de modifier leurs propriétés mécaniques 2,4,7,8,12,15,16, mais ces stimuli peuvent restreindre bio-demande de l&#39;hydrogel. Hydrogels de polyacrylamide ADN réticulé (gels d&#39;ADN) sont des substrats élastiques en deux dimensions dynamiques. réticulations d&#39;ADN permettent la modulation temporelle, spatiale et réversible de rigidité de gel de l&#39;ADN par addition de l&#39;ADN simple brin (ADNsb) un support ou un tampon 9-11,13,14,18,21. Contrairement aux gels dynamiques mentionnées ci-dessus, où les stimuli sont appliqués pour la modulation de l&#39;élasticité, les gels d&#39;ADN s&#39;appuient sur la diffusion de l&#39;ADN sb appliquée pour la modification de l&#39;élasticité. Par conséquent, la surface supérieure du gel, où les cellules sont cultivées, la première zone est modulé en raison du taux of élasticité modulation dépend de l&#39;épaisseur du gel. des gels d&#39;ADN sont identiques à leurs homologues de gel PA en ce sens qu&#39;ils ont un squelette de polyacrylamide, cependant, les liaisons croisées de bis-acrylamide sont remplacées par des liaisons transversales composées d&#39;ADN (Figure 1). Deux ADNsb (SA1 et SA2) s&#39;hybrident avec un brin d&#39;agent de réticulation (L2) pour compenser les réticulations d&#39;ADN du gel. SA1 et SA2 ont des séquences distinctes qui contiennent tous deux une modification Acrydite à la fin 5&#39;pour l&#39;incorporation effective dans le réseau d&#39;aires protégées. Pour la préparation de gels, SA1 et SA2 sont polymérisés individuellement dans un squelette PA et, par la suite, le SA1 et SA2 polymérisé sont mélangés ensemble. L2, l&#39;agent de réticulation, on ajoute à la SA1 et SA2 mélange. La séquence de bases L2 est complémentaire à la fois des séquences SA1 et SA2 et L2 s&#39;hybride avec SA1 SA2 ainsi que pour former les liaisons de reticulation de l&#39;ADN. Initial, le gel de l&#39;ADN est déterminée par l&#39;élasticité des deux concentrations de réticulation et L2 (tableaux 1 </strong&gt; et 2). gels d&#39;ADN contenant des quantités stoechiométriques égales de L2, SA1, SA2 et les gels rigides parce SA1 et SA2 sont 100% réticulé par L2 (désigné comme 100% de gels). Des concentrations plus faibles de résultat L2 dans un pourcentage plus faible de l&#39;ADN réticulation et, par conséquent, plus doux gels d&#39;ADN. Gels aussi bas que 50% réticulé (désigné comme 50% de gels) ont été construits 9-11. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/51323/51323fig1highres.jpg" /> Figure 1: gel de l&#39;ADN réticulation et uncrosslinking schématique 9-11,13,14,18,21. Etape 1: SA1 (rouge) et SA2 (bleu) sont polymérisés individuellement dans un squelette de polyacrylamide (noir). Après la polymérisation, les solutions polymérisées SA1 et SA2 sont mélangés ensemble. Etape 2: L2 (en vert) est ajouté et s&#39;hybride avec SA1 SA2 en plus pour former les liaisons de reticulation du gel. Étape 3: R2 s&#39;hybride avec til prendre pied de L2. Étape 4: hybridation prendre pied de R2 propulse la décompression de L2 de SA1 et SA2. Contrairement gels PA, gels d&#39;ADN peuvent durcir et adoucir après la synthèse. Pour cette raison, les cellules cultivées sur des gels d&#39;ADN peuvent être soumis à des modifications de la raideur dynamique. Pour rigidifier les gels de cellules adhérentes, L2 peut être ajouté au milieu de culture de gels faibles pourcentages d&#39;augmenter le pourcentage de liaisons de réticulation. Pour ramollir des gels de cellules adhérentes, L2 peut être enlevé pour diminuer le pourcentage de liaisons transversales 10,13,21. L2 a une séquence complémentaire de prendre pied à l&#39;extrémité 3 &#39;afin de permettre à L2 uncrosslink de SA1 et SA2 (tableau 1). L&#39;élimination de L2 est réalisée par hybridation d&#39;un brin d&#39;inversion appelé R2. R2 est complémentaire de la longueur de L2 et s&#39;hybride avec le premier prendre pied L2. Prendre pied hybridation propulse la décompression de L2 de SA1 et SA2, ce qui élimine la réticulation et réduit la rigidité de gel. Dans le présent rapport etvidéo, étape par étape, des instructions sont fournies pour la préparation de gels de raidissement et l&#39;adoucissement de l&#39;ADN. Alors que 100% et 80% des préparations de gel sont décrits, ce protocole peut être adapté pour créer des gels d&#39;ADN d&#39;autres pourcentages réticulé initial et final. En général, 100% et 80% de gels sont préparés, immobilisées sur des lamelles de verre, fonctionnalisés, et ensemencées avec des cellules. L2 est ajouté au milieu de 80% de gels et R2 est ajouté au milieu de 100% de gels, de 48 h après l&#39;ensemencement. L&#39;ajout de L2 aux médias raidit 80% de gels à 100% réticulé, tandis que l&#39;addition de R2 aux médias adoucit 100% de gels à 80% réticulé. Gels raidies sont désignés comme 80 → 100% de gels et gels adoucies sont désignés comme 100 → 80% de gels dans le texte. Pour le contrôle ou gels statiques, ADN simple brin constitué de Ts ou As est livré à un autre ensemble de 100% et 80% de gels. Après un minimum de deux jours suivants élasticité modulation, les cellules peuvent être traitées et analysées. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:kEEP-together.within page = &quot;always&quot;&gt; <tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> ADN réticulation </td><td rowspan="2"> # De bases </td><td> Séquence (prendre pied) </td><td rowspan="2"> Modification </td><td rowspan="2"> La température de fusion (T m, ° C) </td><td rowspan="2"> Commentaires </td></tr><tr><td> 5 &#39;→ 3&#39; </td></tr><tr><td rowspan="4"> Design 1 </td><td> SA1 </td><td> 10 </td><td> GCA CCT TTG C </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 34,9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 10 </td><td> GTC AGA ATG A </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 23,6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 30 </td><td> TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG </td><td></td><td> 56 </td><td>Une séquence de 10 pb prendre pied est inclus. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 30 </td><td> CAA GTG TAG CCG CAC TTT GCG TCA GAA TGA </td><td></td><td></td><td> R2 est complémentaire de L2 </td></tr><tr><td rowspan="4"> Design 2 </td><td> SA1 </td><td> 14 </td><td> CGT GGC ATA GGA CT </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 46,9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 14 </td><td> GTT TCC CAA TCA GA </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 40,2 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCT GAT TGG GAA AC A GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C </td><td></td><td> 65,9 </td><td> Une séquence prendre pied 12 pb est inclus. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 40 </td><td> GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A </td><td></td><td> 65,9 </td><td> R2 est complémentaire de L2 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Design 3 </td><td> SA1 </td><td> 20 </td><td> ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 55 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 20 </td><td> CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 56,6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG TTG G ACA ACA CAT CCT GCC T </td><td></td><td> 68,8 </td><td> Prendre pied n&#39;est pas inclus. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Contrôle </td><td rowspan="2"> Contrôle </td><td rowspan="2"> 20-40 </td><td> AAA AAA (etc.) ou </td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td> TTT TTT (etc.) </td></tr></tbody></table> Tableau 1: séquences de base pour ssADN 9-11,13,14,18,21. Cellulaire et des études mécaniques ont utilisés plusieurs dconceptions de réticulation ifférents pour générer des gels d&#39;ADN avec une gamme de propriétés mécaniques statiques et dynamiques. Les paramètres modulés dans la conception de réticulation sont séquence de base et durée de la séquence ou de la longueur de réticulation. Les caractères gras et en italique illustrent appariement de bases entre SA1 et SA2 entre L2 et L2 et, respectivement. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="8"> Conception </td></tr><tr><td colspan="3"> 1 </td><td colspan="3"> 2 </td><td colspan="2"> 3 </td></tr><tr><td> Acrylamide Concentration (%) </td><td colspan="3"> 10 </td><td colspan="3"> 10 </td><td> 10 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SA1 SA2, plus hybride à L2 (% réticulé) </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> &lt;strong&gt; Elasticité (kPa, moyenne ± SEM) </td><td> 6,6 ± 0,6 </td><td> 17,1 ± 0,8 </td><td> 29,8 ± 2,5 </td><td> 5,85 ± 0,62 </td><td> 12,67 ± 1,33 </td><td> 22,88 ± 2,77 </td><td> 25,2 ± 0,5 </td><td> 10,4 ± 0,6 </td></tr></tbody></table> Tableau 2 Le module de Young (E) de gels d&#39;ADN. 9-11,13,14,18,21 concentration de l&#39;acrylamide, le pourcentage de reticulation, et la durée de reticulation peut être modulée dans des gels d&#39;ADN. Designs 1, 2, et 3 ont 20, 28 et 40 pb longueurs de réticulation, respectivement. 100% de gels pour tous les modèles ont des modules semblables indiquant la longueur de réticulation ne pas affecter gel élasticité. Cependant, les variations de la concentration d&#39;acrylamide modifient gel d&#39;ADN élasticité.

<table><tbody><tr><td>ssDNA</td><td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com</td><td></td><td>Ne vortex pas d’ADNsb. Retournez doucement la solution du flacon et/ou de la pipette pour mélanger.</td></tr><tr><td>PBS avec calcium et magnésium</td><td></td><td></td><td>N’importe quelle marque.</td></tr><tr><td>100x tampon Tris-EDTA (tampon TE)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>10x tampon Tris-Borate-EDTA (tampon TBE)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>93290</td><td>TBE est une toxine pour la reproduction.</td></tr><tr><td>Solution d’acrylamide à 40 %</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td> <td>BP14021</td><td>L’acrylamide est une toxine.</td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium (APS)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>A3678</td><td>Préparer une solution à 2 % dans un tampon TE. Le SAPL est une toxine et un irratant.</td></tr><tr><td>Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>T9281</td><td>Préparer une solution à 20 % dans un tampon TE. TEMED est inflammable, corrosif et toxique.</td></tr><tr><td>Verre de protection rond de 12 mm de diamètre</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, Pennsylvanie fishersci.com</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Adhésif optique Norland 72</td><td>Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com</td><td>NOA72</td><td></td></tr><tr><td>Plaque</td><td></td><td></td> de culture tissulaire à 24 puits <td>N’importe quelle marque.</td></tr><tr><td>Microtubes à centrifuger</td><td></td><td></td><td>N’importe quelle marque.</td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>ProteoChem ou Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com ou thermofisher.com</td><td>C111 ou 22589</td><td>Préparer une solution à 0,315 mg/ml dans l’eau immédiatement avant l’utilisation. Dissoudre à 37 &deg ; C et filtrer stériliser. Il est normal d’observer du sulfo-SANPAH non dissous dans le filtre. Sulfo-SANPAH est sensible à la lumière et, par conséquent, la solution doit être protégée de la lumière jusqu’à l’exposition aux UV.</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>P6407</td><td>Préparer une solution à 0,2 mg/ml dans l’eau et filtrer la stérilisation.</td></tr><tr><td>Collagène de type I</td><td>Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com</td><td>13813</td><td>Préparez une solution à 0,2 mg/ml dans de l’acide acétique 0,2 N. La solution doit rester froide à tout moment pour éviter la polymérisation. L’acide acétique est un produit inflammable, toxique et corrosif.</td></tr><tr><td>22 x 60 verre de couverture</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Pipette à déplacement positif</td><td>Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com</td><td>F148504</td><td></td></tr><tr><td>Heat</td><td>block Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Source</td><td></td><td></td> de lumière UV <td>Placez les gels aussi près que possible de la lumière UV. La lumière UV peut causer des lésions cutanées ou oculaires.</td></tr><tr><td>Thermomètre</td><td></td><td></td><td>N’importe quelle marque.</td></tr><tr><td>Azote gazeux</td><td>GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/</td> <td>NI 5.0UH-R</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation de l&#39;adn réticulé polyacrylamide hydrogels

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mécanobiologie est un domaine scientifique émergent qui porte sur le rôle critique de repères physiques dans la direction de la morphologie et de la fonction des cellules. Par exemple, l&#39;effet de l&#39;élasticité des tissus sur la fonction cellulaire est un domaine de recherche important de mécanobiologie car la rigidité des tissus module à la maladie, le développement, et les blessures. Statique des matériaux de tissus imitant ou des matériaux qui ne peuvent pas modifier la rigidité fois que les cellules sont étalées, sont principalement utilisés pour étudier les effets de la rigidité des tissus sur les fonctions cellulaires. Bien que les informations recueillies à partir d&#39;études statiques est précieux, ces études ne sont pas représentatifs de la nature dynamique du microenvironnement cellulaire in vivo. Pour mieux cerner les effets de la rigidité dynamique sur la fonction cellulaire, nous avons développé un système hydrogel de polyacrylamide ADN réticulé (gels d&#39;ADN). Contrairement à d&#39;autres substrats dynamiques, des gels d&#39;ADN sont capables de diminuer ou d&#39;augmenter la rigidité après la fabrication sans stimuli. les gels sont constitués d&#39;ADN de l&#39;ADN crossldes encres qui sont polymérisés dans un squelette de polyacrylamide. Ajout et suppression de liaisons transversales par délivrance d&#39;ADN simple brin permet temporelle, spatiale, et le contrôle réversible de gel élasticité. Nous avons montré que dans les rapports précédents modulation dynamique de gel d&#39;ADN élasticité influe sur le comportement des fibroblastes et des neurones. Dans le présent rapport et la vidéo, nous fournissons un schéma qui décrit le gel d&#39;ADN mécanismes de réticulation et des instructions étape-par-étape sur les gels d&#39;ADN de préparation.

Avant nos études, les interactions cellule-ECM ont été observés sur les biomatériaux conformes statiques ou dynamiques sur des substrats irréversibles et unidirectionnels. Ces substrats ne reflètent pas fidèlement la nature dynamique du microenvironnement cellulaire. Notre travail déplace les paradigmes techniques existantes en fournissant un modèle plus physiologique pour étudier les interactions cellule-ECM sur le ramollissement et de renforcement des biomatériaux dynamiques. Dans des études précédentes, nous avons an...

Notre laboratoire a développé des hydrogels de polyacrylamide ADN réticulé, un système d&#39;hydrogel dynamique, afin de mieux comprendre les effets de la modulation de la rigidité des tissus sur la fonction cellulaire. Ici, nous fournissons des schémas, des descriptions et des protocoles pour préparer ces hydrogels.

Préparation de l&#39;ADN réticulé polyacrylamide hydrogels

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

L'objectif général de cette procédure est de préparer des hydrogels de polyacrylamide réticulés par de l'ADN capables de s'attendrir ou de se rigidifier par pipetage d'ADN simple brin dans le milieu de culture après ensemencement des cellules en surface. Cette étape est réalisée en resuspendant d'abord les ADN simple brin lyophilisés SA un, SA deux L deux R deux et le témoin dans un tampon, puis en polymérisant individuellement les solutions SA un et SA deux dans un squelette de polyacrylamide. La deuxième étape consiste à mélanger les solutions polymérisées SA un et SA deux avec la solution L deux pour former le gel d'ADN.Ensuite, la solution de gel d'ADN est immobilisée sur des lamelles en verre à l'aide d'une colle optique. La dernière étape consiste à fonctionnaliser les gels en les traitant avec du sul sampa, puis du PDL. Enfin, des cellules sont ensemencées sur les gels d'ADN et l'élasticité des gels est modulée par l'ajout de R deux L deux ou d'ADN simple brin contrôle afin d'assouplir, de rigidifier ou de ne pas modifier l'élasticité du gel, respectivement.Les résultats de ces expériences montrent que la nature dynamique du substrat sous-jacent oriente le comportement cellu

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JoVE Journal

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Nous présentons des protocoles pour les 3 dimensions (3D) d'encapsulation des cellules à l'intérieur des hydrogels synthétiques. La procédure d'encapsulation est décrite pour les deux méthodes couramment utilisées de réticulation (type Michael addition et la lumière à l'initiative gratuite mécanismes radicale), ainsi qu'un certain nombre de techniques pour évaluer le comportement des cellules encapsulées.

Encapsulation Cellulaire dans les hydrogels 3D pour l&#39;ingénierie tissulaire

L'effet de la rigidité des substrats sur la fonction cellulaire peut être...

Étudier les effets de matrice de rigidité sur la fonction cellulaire en utilisant l&#39;acrylamide basée hydrogels

Dans cette vidéo, nous démontrons les techniques expérimentales utilisées pour fabriquer conforme, la matrice extracellulaire (ECM) substrats recouverts adapté à la culture cellulaire, et qui se prêtent à la microscopie à force de traction et en observant les effets de la rigidité d'ECM sur le comportement cellulaire.

Préparation des matrices plainte pour quantifier la contraction cellulaire

Nous présentons une nouvelle hydrogel de polyacrylamide, appelé hydroxy-PAAm, qui permet une liaison directe de protéines de la MEC avec un coût ou une expertise minimale. La combinaison de l'hydroxy-PAAm hydrogels avec l'impression microcontact facilite le contrôle indépendant de nombreux indices du microenvironnement cellulaire naturel pour l'étude mechanostransduction cellulaire.

Préparation des hydroxy-PAAm hydrogels pour découplage des effets de la mécanotransduction Cues

Rigidité mécanique dans le microenvironnement de la tumeur joue un rôle crucial dans la conduite de comportement malin en augmentant l'activité de invadopodes et contractilité actomyosin. En utilisant des gels de polyacrylamide (PaaS), invadopodes et de force de traction tests peuvent être utilisés pour étudier les propriétés invasives et contractiles des cellules cancéreuses en réponse à la matrice de rigidité.

gels de polyacrylamide pour invadopodes et la force de traction Les essais sur les cellules cancéreuses

Ici, une méthode qui permet une préparation rapide, efficace et peu coûteuse de gels de polyacrylamide dans un format de plaque multipuits est décrite. La méthode ne nécessite aucun équipement spécialisé et pourrait être facilement adoptée par n’importe quel laboratoire de recherche. Il serait particulièrement utile dans les recherches axées sur la compréhension des réponses cellulaires dépendantes de la rigidité.

Multiwell Rigidité Essai pour l&#39;étude des réponses cellulaires Rigidité-dépendantes simple à base de polyacrylamide

La différenciation cellulaire est régulée par une foule de facteurs microenvironnement, y compris les propriétés de la composition de la matrice et de matériaux de substrat. Nous décrivons ici une technique utilisant des puces à ADN de cellules en conjonction avec une force de traction au microscope pour évaluer la différenciation des cellules et les interactions cellule-substrat biomécaniques en fonction du contexte microenvironnement.

Un haut-débit Plate-forme Cell biopuces pour corrélative Analyse de la différenciation des cellules et des forces de traction

Ce protocole décrit la caractérisation de la synthèse de l’ADN polymérase d’ADN modifié grâce à l’observation des changements à l’ADN fluorescent étiqueté proche infrarouge à l’aide de l’électrophorèse sur gel et gel de l’imagerie. Gels d’acrylamide sont utilisés pour l’imagerie haute résolution de la séparation des acides nucléiques courts, qui migrent à des vitesses différentes selon la taille.

Analyse d’activité de l’ADN polymérase utilisant l’ADN marqué Fluorescent proche infrarouge visualisée par électrophorèse sur Gel d’Acrylamide

Bien que la rigidité de la matrice extracellulaire (MEC) soit un régulateur clé du comportement cellulaire, les mécanismes sous-jacents de détection et de transduction restent flous. Pour y remédier, nous proposons des protocoles permettant de créer des substrats à base de polyacrylamide et de silicone avec une rigidité réglable afin de faire progresser notre compréhension de la diaphonie cellulaire-ECM.

Génération de substrats de matrice extracellulaire en polyacrylamide et silicone avec rigidité définie pour des applications en biologie cellulaire

Traditionnellement, la tranche verticale et de toute la préparation de montage de la rétine ont été utilisés pour étudier la fonction des circuits de la rétine. Ici, nous décrivons le roman tranchage méthode pour préserver la morphologie dendritique des neurones rétiniens intacte.

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Apprenez à préparer des hydrogels de polyacrylamide réticulés par ADN pour étudier la rigidité tissulaire et son effet sur le comportement cellulaire. Cette méthode permet de moduler l'élasticité du gel via l'ajout d'ADN monocaténaire.

Préparation de l'ADN réticulé polyacrylamide hydrogels

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