Name: Un flux Essai dadhésion à étudier Leucocyte recrutement pour hépatiques humaines sinusoïdales endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-21T15:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Découvrez un essai d'adhésion en flux pour étudier le recrutement des leucocytes sur l'endothélium sinusoïdal hépatique humain sous contrainte de cisaillement physiologique. Cette méthode permet d'identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans les maladies inflammatoires chroniques du foie.

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SS est financé par une bourse de recherche clinique Wellcome Trust intermédiaire, CW par une affectation spéciale du Programme Wellcome.

Une. Microslide Préparation <ol><li> Pré-revêtement d&#39;une microplaque à six canaux avec la queue de rat de collagène de type I (RTC, dilué au 1:100 dans du PBS donnant une dilution de travail de 220 pg / ml). Ceci est réalisé en injectant 30 ul d&#39;une solution diluée RTC directement dans les canaux et en incubant pendant 2 heures à 37 ° C, suivie de trois lavages avec du PBS. </li></ol> 2. Les cellules d&#39;ensemencement en microplaques <ol><li> Dissocier un flacon T75 confluente de cellules hépatiques humaines cultivées sinusoïdales endothéliales (SSEC) (isolé à partir de tissu de foie comme décrit précédemment 13) dans de la trypsine-EDTA, les laver dans du PBS, et remettre en suspension à 3 x 10 6 cellules / ml dans du milieu complet (endothéliales humaines support de base supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline et de la streptomycine 100μg/ml, 10% de sérum AB humain inactivé à la chaleur, 10 ng / ml de facteur de croissance vasculaire endothéliale et de 10 ng / ml d&#39;hépatocytes facteur de croissance). Injecter 30 ul de suspension cellulaire désastreusescte dans chaque canal. </li><li> Laisser cellules d&#39;adhérer pendant 1 h dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec une atmosphère de CO 2 de 5% sur une grille coulissante. Après avoir laissé les cellules adhérer à remplir les orifices de chaque côté de chaque canal avec le milieu complet (figure 1). </li></ol> 3. Stimulation des cellules cytokine <ol><li> Laisser les cellules dans l&#39;incubateur pendant 24 heures. Évaluer la croissance des cellules en utilisant un microscope à contraste de phase inversé. 24 heures avant l&#39;essai d&#39;adhérence, de stimuler les monocouches endotheliales avec des cytokines en remplaçant le milieu de croissance avec du milieu complet supplémenté en facteur de nécrose tumorale alpha et de l&#39;interféron gamma, les deux à 10 ng / ml. </li></ol> 4. Isolement des lymphocytes du sang périphérique <ol><li> Isoler des lymphocytes du sang périphérique à partir de sang total en purifiant d&#39;abord la fraction mononucléaire par centrifugation en gradient de densité sur un milieu de centrifugation de séparation de cellules approprié pendant 25 min à 800x g. Incuber les cellules de plastique pendant 1 heure pour permettre l&#39;adhérence des monocytes. </li><li> Après l&#39;adhésion à aspirer plastique lymphocyte enrichi surnageant. Laver les lymphocytes et les remettre en suspension (typiquement de 1 x 10 6 cellules / ml dans un milieu d&#39;écoulement (milieux de base endotheliales contenant 0,1% (v / v) d&#39;albumine de sérum bovin (BSA)). </li></ol> 5. Prétraitement de l&#39;endothélium ou leucocytes avec inhibiteurs <ol><li> Préparer des dilutions recommandées de la fonction de blocage des anticorps ou des inhibiteurs de petites molécules de l&#39;endothélium media/0.1% (v / v) de BSA. Remplacer le milieu complet avec la solution de blocage anticorps / inhibiteur dans le canal de microplaque choisi 30 min avant de s&#39;écouler dosage. </li><li> Lorsque le prétraitement des récepteurs de chimiokines sur les lymphocytes sont prévues, remettre en suspension les leucocytes isolés dans une solution de RPMI contenant 0,1% (v / v) de BSA et incuber avec 200 ng / ml de la toxine coquelucheuse pour bloquer la protéine G activité de récepteur couplé à des récepteurs de chimiokines, en alternative diluer spécifique fonctiondes anticorps de blocage ou des inhibiteurs à petites molécules de récepteurs de chimiokine à la dilution recommandée. Incuber leucocytes à 37 ° C pendant 30 min, puis laver et remettre en suspension dans un milieu d&#39;écoulement. </li></ol> 6. Configuration des flux de système de dosage <ol><li> Préchauffer une chambre transparente à commande thermostatique de 37 ° C. La chambre doit avoir des orifices pour l&#39;insertion d&#39;un tube de silicone et la fourniture électronique d&#39;une électrovanne qui permet à commutation électronique entre les cellules et le milieu pratiquement sans volume mort. L&#39;enceinte est montée sur un microscope inversé pour permettre la microscopie à contraste de phase. Figure 2 montre la chambre de dosage d&#39;écoulement et le microscope et microlame placé sur la platine du microscope. </li><li> Pré-remplir une seringue en verre de 50 ml avec un luer lock avec 10 ml d&#39;eau distillée stérile et attacher une longueur de tube en silicone de 25 cm de l&#39;orifice de la seringue. Insérer dans une pompe à seringue. Altérer le débit de la pompe de seringue de prélèvement selon lales instructions du fabricant de la microplaque pour maintenir une contrainte de cisaillement de 0,05 Pa (0,5 dyne / cm 2, figure 3). </li><li> Prenez deux seringues de 5 ml, jeter les plongeurs et fixer les barils pour les deux ports de flux d&#39;une électrovanne électronique en utilisant un tube de silicone. <ol><li> Attacher de 12 cm de tube de silicone à la soupape de sortie de flux. La valve permet l&#39;alternance entre une connexion d&#39;un tampon de lavage de cellules (endothéliales de media/0.1% (v / v) de BSA) et la suspension de lymphocytes. </li><li> Rincer l&#39;électrovanne électronique par l&#39;insertion du tampon de lavage dans les deux corps de seringue et assurant tampon s&#39;écoule d&#39;un canon à travers la soupape et dans le tube de silicone de sortie de flux. </li><li> Utiliser le commutateur de vanne à alternance à l&#39;autre cylindre et d&#39;assurer le tampon est fluide et que toutes les bulles sont éliminées du système. Retirez le tampon de lavage de l&#39;un des barils et la remplacer par une suspension de lymphocytes figure 4a. </li></ol></li><li> Connectez le tubin de siliconeg à partir de la pompe à seringue à un orifice d&#39;un canal de microplaque choisi par l&#39;intermédiaire d&#39;un adaptateur de microplaque. Ensuite, connecter le tube de silicone à partir de la soupape d&#39;échappement opposée à l&#39;orifice par l&#39;intermédiaire d&#39;un adaptateur de microplaque. Assurez-vous que le tube de silicone et les adaptateurs sont remplis avec du tampon de lavage avant la connexion pour empêcher les bulles d&#39;air entrant dans le système (figure 4b). </li><li> Une fois connecté au système d&#39;écoulement, placer la microplaque sur la platine du microscope et fixer avec des agrafes ou de ruban adhésif pour empêcher le mouvement. Régler le microscope à l&#39;objectif 10X avec le réglage de phase approprié. S&#39;assurer que la monocouche endothéliale est visualisée et la mise au point en utilisant la lentille oculaire. S&#39;assurer que les images peuvent être capturées par l&#39;intermédiaire d&#39;un appareil photo qui est fixé sur le microscope grâce à quoi les images peuvent être transmises à un écran et enregistrées. </li></ol> 7. Débit de dosage Technique et enregistrement de l&#39;adhérence pour l&#39;analyse <ol><li> Perfuser la couche endothéliale avec du tampon de lavage pendant 2 minutes en commençant withdrawal de la pompe de la seringue pour enlever les débris ou anticorps bloquant non lié, puis passer la vanne pour permettre à 5 min bolus de solution de leucocytes à une contrainte de cisaillement de paroi constante de 0,05 Pa. </li><li> Pendant les 2 dernières minutes du bol de leucocytes, enregistrer 10 champs aléatoires le long de la longueur de la microplaque. Cela permet une analyse hors ligne des lymphocytes roulement / modem sur la monocouche endothéliale. Enregistrer chaque domaine pour environ 10 secondes avant de passer à la prochaine et veiller à ce que les enregistrements sont effectués sur le sens de l&#39;écoulement pour éviter l&#39;enregistrement deux fois de suite la même cellule de roulement. </li><li> Suivre le bolus de leucocytes avec un bolus de 5 min de tampon de lavage par retour de la soupape à sa position de départ. Au cours de la 2 min finale de ce bolus effectuer une deuxième phase d&#39;enregistrement en choisissant au moins 10 champs choisis au hasard le long de la longueur de la microplaque. Enregistrer chaque champ pendant environ 5 secondes avant de passer à la prochaine et veiller à ce que la monocouche endothéliale et leucoc adhérentytes sont en orientation claire. Ceci permet une analyse hors ligne du motif d&#39;adhérence. </li></ol>

<ol><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Wong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+role+for+selectins+in+the+recruitment+of+leukocytes+into+the+inflamed+liver+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature.</a> Clin. Invest. , 2782-2790 (1997).</li>
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<li>Finger, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+through+L-selectin+requires+a+threshold+hydrodynamic+shear%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adhesion through L-selectin requires a threshold hydrodynamic shear.</a> Nature. 379, 266-269 (1996).</li>
<li>Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold+levels+of+fluid+shear+promote+leukocyte+adhesion+through+selectins+%28CD62L%2CP%2CE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+biol%22%5BJournal%5D)">Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E).</a> J. Cell biol. 136, 717-727 (1997).</li>
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<li>Lalor, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+adhesion+protein-1+mediates+adhesion+and+transmigration+of+lymphocytes+on+human+hepatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Vascular adhesion protein-1 mediates adhesion and transmigration of lymphocytes on human hepatic endothelial cells.</a> J. Immunol. 169, 983-992 (2002).</li>
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<li>Oo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+CCR4+and+CXCR3+in+the+recruitment+and+positioning+of+regulatory+T+cells+in+the+inflamed+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for CCR4 and CXCR3 in the recruitment and positioning of regulatory T cells in the inflamed human liver.</a> J. Immunol. 184, 2886-2898 (2010).</li>
<li>Weston, C. J., Shepherd, E. L., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+localization+and+trafficking+of+vascular+adhesion+protein-1+as+revealed+by+an+N-terminal+GFP+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Transm%22%5BJournal%5D)">Cellular localization and trafficking of vascular adhesion protein-1 as revealed by an N-terminal GFP fusion protein.</a> J. Neural Transm. , (2013).</li>
<li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> J. Immunol. 186, 4147-4155 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents

L&#39;étape la plus critique pour effectuer avec succès un essai de flux fait en sorte que d&#39;une monocouche confluente en bonne santé et de cellules endothéliales est prêt avant l&#39;essai d&#39;adhérence de l&#39;écoulement. Cellules endothéliales primaires peut être difficile à la culture et sensible aux modifications dans les méthodes de culture. Il est important que 1) chambres d&#39;écoulement sont suffisamment et uniformément revêtues de cellules endothéliales en monocouche, par SSEC nous utilisons rat de type queue de collagène de type I, mais cela peut varier pour d&#39;autres populations endothéliales, 2) milieu de culture est approprié pour le type de cellule, pour SSEC nous avons décrit notre milieu complet dans la section de protocole. Autres étapes essentielles comprennent réglage de la pompe de la seringue au taux approprié de tenir compte des niveaux physiologiques de la contrainte de cisaillement. Au cours de l&#39;essai d&#39;écoulement, il est nécessaire d&#39;empêcher les bulles d&#39;air dans le circuit d&#39;écoulement qui peut endommager la monocouche endothéliale ou bandes cellules immunitaires de la surface de l&#39;endothélium. Ceci peut être évité par enRANTISSANT que tous les tubes de silicone et adaptateurs sont perfusées avec le tampon de lavage avant la connexion, que toutes les bulles d&#39;air sont éliminées et que les médias sont préchauffé avant utilisation. Lors de la connexion des adaptateurs pour les ports de la microplaque, il est très important qu&#39;il y ait une interface liquide / liquide lors de la connexion, s&#39;il ya un air alors ce sera de former un espace d&#39;air dans le système qui va perturber la monocouche endothéliale lors du retrait de la seringue étape. La solution de leucocytes dans le corps de la seringue doit agitation régulière pour s&#39;assurer que les cellules ne se déposent pas, maintenant ainsi une densité de cellules constant tout au long de l&#39;expérience. Au cours des étapes d&#39;enregistrement, il est important de veiller à l&#39;image de la couche endothéliale est correctement centré et claire pour permettre une analyse hors ligne exacte, et que lors de la deuxième étape de l&#39;essai de débit (poste leucocytes d&#39;un bolus) que suffisamment de temps est laissé pendant le tampon de lavage la phase avant l&#39;enregistrement est repris à veiller à ce quetous les leucocytes non adhérentes sont éliminées. De même, il est essentiel d&#39;utiliser des cellules endothéliales dans une monocouche de densité appropriée pour éviter la perte de cellules qui peuvent interférer avec des motifs d&#39;écoulement dans les capillaires étroits et peut également être difficile de discriminer à partir de leucocytes de moins grandes adhérentes microscopie à contraste de phase. Nous avons décrit la densité de semis optimale pour les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques humains mais cela peut varier entre les différentes populations endothéliales et des espèces. Des progrès significatifs ont été accomplis dans l&#39;étude du recrutement des leucocytes dans des modèles animaux de la microscopie intravitale. L&#39;avantage majeur de la méthode de l&#39;essai d&#39;adhérence de l&#39;écoulement est que le recrutement de leucocytes peut être étudiée dans un système binaire avec des cellules endotheliales humaines primaires. En outre, ces interactions peuvent être étudiées sous les niveaux pertinents physiologiques du stress de cisaillement. Il est important de confirmer les résultats des études chez l&#39;animal avec intravitale systèmes cellulaires humains comme il peut y avoir differences dans les propriétés endothéliales entre les espèces. L&#39;une des limites de l&#39;analyse d&#39;écoulement, c&#39;est que le recrutement de leucocytes est étudiée dans un environnement unicellulaire de la monocouche endothéliale. En outre, une fois les leucocytes ont adhéré et transmigré à travers l&#39;endothélium ils ne peuvent pas être présents dans suffisamment de numéros à être isolées et soumises à des procédés en aval. En dépit de ces limitations, une fois que le test d&#39;adhésion d&#39;écoulement a été maîtrisé il peut être mis au point pour effectuer une analyse plus approfondie de la cascade d&#39;adhérence leucocytaire et adapté pour récapituler un environnement multicellulaire. Enregistrement prolongé de champs simples et l&#39;utilisation de logiciels de suivi peut être utilisé pour analyser le comportement rampant des leucocytes. De plus lors de l&#39;achèvement de l&#39;essai d&#39;écoulement des microplaques peuvent être interrogés à l&#39;aide microscopie à balayage laser confocal et marquage immunofluorescent pour étudier l&#39;adhérence et la transmigration de manière plus détaillée. De plus, nous avons précédemment élaborered un modèle in vitro, où les leucocytes circulant pourraient interagir avec l&#39;endothélium hépatique conditionnée par la présence d&#39;hépatocytes. Ce test peut également être développé pour étudier les sous-populations de leucocytes: notre groupe a effectué des études de sous-ensembles, tels que des cellules régulatrices T, cellules B, et le foie infiltration des leucocytes. Ces études sont la preuve que le test d&#39;adhésion de flux est un outil puissant pour étudier le recrutement de leucocytes spécifique générale et organes dans les systèmes humains.

Il est maintenant bien établi que le recrutement des leucocytes en général suit le paradigme de l&#39;adhérence à plusieurs étages en cascade 1. Cela implique la capture des leucocytes à partir du sang circulant par les cellules endothéliales qui tapissent la paroi du vaisseau. Initialement, les leucocytes sont soumis à une étape de roulage qui est médiée par les récepteurs sélectine ou des membres de la superfamille des immunoglobulines. Cela permet à des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) exprimés à la surface des leucocytes pour être activé par les chimiokines présentées sur le glycocalyx endothéliale. Cela conduit à la modification de la confirmation de l&#39;intégrine à un état «à forte affinité» sur la surface de leucocytes et l&#39;adhérence ferme et l&#39;arrêter à l&#39;endothélium. Adhésion ferme est alors suivie par le changement de forme et exploration de l&#39;leucocytes sur le navire. L&#39;étape finale est la transmigration à travers la monocouche endothéliale, ce qui peut se produire par des voies d&#39;paracellulaire ou transcellulaire. Bien que l&#39;adhérence cascade à plusieurs étapes décrivents le mécanisme général de recrutement de leucocytes dans le corps il ya des différences spécifiques d&#39;organe. Dans le foie, la majorité du recrutement des leucocytes se produit dans les sinusoïdes hépatiques contrairement à d&#39;autres organes où le recrutement se produit généralement dans les veinules post-capillaires 2. Les sinusoïdes hépatiques sont un environnement de faible cisaillement et leucocytes subissent une brève étape d&#39;attache avant de raffermir l&#39;adhésion qui est sélectine indépendant 2. Ces canaux sont bordés par l&#39;endothélium sinusoïdal hépatique qui est discontinu et contient fenestrae, des pores ouverts de 100 à 200 nm de diamètre, et manquent d&#39;une membrane basale 3. Élucider les mécanismes moléculaires qui interviennent dans le recrutement des leucocytes à travers l&#39;endothélium sinusoïdal hépatique humain pourrait identifier organe cibles thérapeutiques spécifiques pour les maladies inflammatoires du foie. tests d&#39;adhésion de débit sont des outils essentiels dans l&#39;étude du recrutement des leucocytes. Ils permettent la reconstruction de leucocytes recruitment en présence d&#39;une contrainte de cisaillement pour analyser l&#39;adhérence sous des forces bien définies. L&#39;utilisation la plus fréquente pour l&#39;analyse est l&#39;étude adhésion des leucocytes à des monocouches endothéliales en culture ou des substrats purifiés. Disponibles dans le commerce chambres d&#39;écoulement sont utilisés pour perfuser les cellules dans des conditions d&#39;écoulement laminaire entre deux surfaces planes, et ensuite de visualiser le processus dynamique d&#39;adhérence sur un microscope 4. Groupes précédents ont démontré que certaines interactions adhésives n&#39;ont lieu que sous flux et ne peuvent pas être étudiés dans des essais statiques 5,6. Nous avons utilisé cette technique pour récapituler les sinusoïdes hépatiques et étudier le recrutement des leucocytes dans des conditions de faible contrainte de cisaillement. SSEC humaine sont mises en culture primaire en microplaques et des leucocytes peut alors être perfusé sur cette monocouche à un débit d&#39;écoulement calculé à reproduire la contrainte de cisaillement au sein de sinusoïdes hépatiques. La contrainte de cisaillement est une contrainte qui est appliquée en parallèle ou tangentielle à une surface comme oppOSED à contrainte normale qui est perpendiculaire. Tout liquide qui se déplace le long d&#39;une frontière va exercer une contrainte de cisaillement sur cette frontière. La contrainte de cisaillement a été montré pour être une composante essentielle de lymphocytes transmigration 7. Dans ces conditions, chaque étape de la cascade d&#39;adhérence peut être visualisée par microscopie à contraste de phase. Cette méthode a permis à des informations importantes sur le recrutement des leucocytes dans le foie, y compris l&#39;étude des molécules d&#39;adhérence classiques 8, le rôle des chimiokines et des récepteurs de chimiokines 9-11, et les molécules d&#39;adhésion atypiques tels que l&#39;adhérence vasculaire protein-1 (VAP-1 ) 8,12 et lymphatique commun et de l&#39;endothélium vasculaire récepteur-1 (CLEVER-1) 13. Bien que cet essai a été mentionné dans plusieurs publications de notre groupe, sa description a été brève et nous avons profité de cette occasion pour fournir une étape détaillé par étape pour faciliter le dépannage et éviter les erreurs techniques lors de la tentativement le dosage. En outre, nous avons récemment changé l&#39;approvisionnement en chambres de Microslide qui permet des modifications précises à la contrainte de cisaillement. Nous croyons que cette élargit l&#39;applicabilité de l&#39;analyse à d&#39;autres cellules endothéliales et immunitaires. Le procédé suivant décrit la préparation et de la technique pour la réalisation d&#39;une analyse de l&#39;adhérence à base de flux avec des cellules endotheliales sinusoïdales hépatiques humains et des lymphocytes de sang périphérique.

<table><tbody><tr><td>Chambre d’écoulement microslide VI 0.4 à six canaux&nbsp ;</td><td>Ibidi</td><td>80601</td><td>D’autres tailles de canaux et lames pré-revêtues sont disponibles en fonction des exigences du test.</td></tr><tr><td>Adaptateurs de débit&nbsp ; microslide VI 0.4</td><td>Ibidi</td><td>80646</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de dosage de flux</td><td>Solent Scientific</td><td>33-3322</td><td>Ces chambres sont fabriquées sur mesure par la société en fonction du modèle de microscope et des accessoires.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microscope inversé IX2</td><td>Olympus, Royaume-Uni</td><td>Modèle IX50</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Pompe à seringue Harvard</td><td>Apparatus, Royaume-Uni</td><td>702101</td><td></td></tr><tr><td>Électrovanne électronique</td><td>Lee Products Limited, Royaume-Uni</td><td>Numéro de pièce LFYA1226032H</td><td></td></tr><tr><td>Tube en silicone grand Fisher Scientific</td><td></td><td>FB50855</td><td>2 mm de diamètre intérieur, 4 mm de diamètre extérieur</td></tr><tr><td>Tube en silicone-petit</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50853</td><td>1 mm de diamètre intérieur, 3 mm de diamètre extérieur</td></tr><tr><td>Seringue en verre de Harvard</td><td>Harvard Apparatus, UK</td><td>55-0962</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de séparation cellulaire/Lympholyte</td><td>VH Bio</td><td>CL-5020</td><td></td></tr><tr><td>Collagène de queue de rat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td></td></tr></tbody></table>

un flux essai d&#39;adhésion à étudier leucocyte recrutement pour hépatiques humaines sinusoïdales endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Infiltration leucocytaire dans les tissus du foie humain est un processus commun à toutes les maladies inflammatoires du foie adultes. Infiltration chronique peut entraîner le développement de la fibrose et de la progression vers la cirrhose. La compréhension des mécanismes moléculaires qui interviennent dans le recrutement de leucocytes au niveau du foie pourrait identifier des cibles thérapeutiques importantes pour les maladies du foie. L&#39;interaction clé lors du recrutement de leucocytes est celle des cellules inflammatoires avec endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement. Recrutement pour le foie survient dans les canaux à faible cisaillement des sinusoïdes hépatiques qui sont bordées par des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques (SSEC). Les conditions dans les sinusoïdes hépatiques peuvent être récapitulées par perfusion leucocytes à travers des canaux bordés de monocouches SSEC humains à des débits spécifiques. Dans ces conditions, les leucocytes sont soumis à une étape d&#39;attache bref suivi d&#39;une activation et une adhésion ferme, suivie d&#39;une étape ultérieure rampants et la transmigration à travers l&#39;endothéliumcouche. En utilisant la microscopie à contraste de phase, chaque étape de ce &#39;adhérence cascade »peut être visualisé et enregistré suivie d&#39;une analyse hors ligne. Des cellules endothéliales ou des leucocytes peuvent être prétraitées avec des inhibiteurs de déterminer le rôle de molécules spécifiques au cours de ce processus.

Ce dosage possède la capacité de visualiser l&#39;adhérence de l&#39;écoulement à plusieurs étages en cascade et d&#39;élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents en comparant les résultats des expériences de contrôle pour ceux avec des inhibiteurs moléculaires. Différents lits vasculaires peuvent être récapitulés en incorporant les cellules endothéliales spécifiques et modifiant les conditions de contrainte de cisaillement. Chaque étape de la cascade d&#39;adhérence peut être analysé en mode hors connexion en suivant le procédé d&#39;enregistrement décrit dans le protocole. La première étape de la cascade d&#39;adhérence est le roulement des leucocytes qui peuvent être exprimés en pourcentage du total des cellules adhérentes. Analyse hors ligne permet le nombre de cellules adhérentes à être énumérée dans chaque domaine enregistré au cours du bolus de leucocytes. La lecture de l&#39;image permet la comparaison des cellules qui sont fermement adhérentes et celles qui sont en cours de un mouvement de roulement à travers l&#39;endothélium. Mouvement de roulement peut être visualisée à l&#39;aide de cette technique, chaque domaine est enregistré pendant au moins 10 secondes. Cellules de roulement sont identifiés par leur vitesse réduite sur la surface endothéliale par rapport aux cellules qui coule. Ce comportement doit être démontrée pendant au moins 5 secondes sans détachement. La cascade d&#39;adhérence dans les sinusoïdes hépatiques a lieu dans un environnement à faible cisaillement et des études in vivo ont confirmé roulement minimal avec seulement une brève étape d&#39;attache. Nous avons confirmé que l&#39;essai d&#39;écoulement reflète l&#39;environnement des sinusoïdes hépatiques en démontrant que moins de 10% de leucocytes adhérents constamment stimulé rouler sur SSEC dans ces essais. L&#39;étape suivante de la cascade d&#39;adhérence est adhésion ferme. Adhérence totale peut être calculée à partir de la deuxième étape de l&#39;enregistrement pendant le bolus de tampon de lavage (étape 7.3). Analyse hors ligne permet le nombre total de cellules adhérentes fermement à être compté dans chaque domaine (figure 5). Cellules fermement adhérentes sont définies comme des cellules qui sont à l&#39;arrêt ou shapechanged avec le comportement de ramper lentement.Le nombre moyen de cellules par champ peut alors être calculée. Cette figure peut alors être utilisée, en conjonction avec la surface totale du champ de vision (déterminé à l&#39;aide d&#39;un réticule ou équivalent), de la concentration des lymphocytes (typiquement 1 x 10 6 cellules / ml) et de la vitesse d&#39;écoulement à exprimer l&#39;étendue de l&#39;adhésion des lymphocytes comme les cellules adhérentes / mm 2/10 6 cellules perfusé. L&#39;étude de la structure de l&#39;adhésion implique l&#39;analyse des deux dernières étapes de la cascade d&#39;adhérence y compris le changement de forme, ramper et migration trans. Les leucocytes adhérents à la surface supérieure de la monocouche SSEC apparaissent phase lumineuse, tandis que ceux qui ont migré à travers la monocouche apparaissent phase d&#39;obscurité (figure 6). Les cellules peuvent ensuite être classés comme présentant une adhérence «statique» (nonmigrated / tour), la morphologie «de forme changé» ou comme «migré» et les différentes catégories sont ensuite exprimés en pourcentage de lala population totale de l&#39;adhésif. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1.jpg" /> Figure 1. Monocouche de cellules primaires humaines hépatiques sinusoïdales endothéliales dans la chambre d&#39;écoulement. A) microplaques remplis de milieux contenant une monocouche de cellules endothéliales avant le début de l&#39;écoulement adhérence dosage. B) de l&#39;image à contraste de phase de confluence endothéliale monocouche, les cellules endotheliales doivent être ensemencées en microplaque qui ont été pré-revêtu (pour les cellules endotheliales hépatiques humaines cela devrait être avec Type de queue de rat de collagène 1) et il est essentiel que les cellules endothéliales sont en bonne santé dans la culture et confluentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src= &quot;/ Files/ftp_upload/51330/51330fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51330/51330fig2.jpg&quot; /&gt; Figure 2. Couler chambre de dosage. Une chambre de dosage à écoulement set-up peut être vu ici, il est constitué d&#39;une chambre transparente qui est montée sur un microscope inversé. Un dispositif de chauffage est placé dans la chambre et doit être contrôlé par thermostat pour maintenir une température de 37 ° C. Il devrait y avoir des ports disponibles pour connecter un tube de silicone à partir d&#39;une microplaque à l&#39;intérieur de la chambre à une pompe à seringue, qui est situé à l&#39;extérieur. La microplaque est placé directement sur ​​la platine du microscope. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3.jpg" /> Figure 3. Seringue pompe. Une pompe à seringue est connected silicone par l&#39;intermédiaire d&#39;un tube de la chambre d&#39;écoulement. La pompe est réglée à un taux de retrait spécifique en fonction de la contrainte de cisaillement désiré requis pour le dosage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4.jpg" /> Figure 4. Raccordement de soupape à la chambre à circulation. A) Une électrovanne électronique permet la commutation entre les deux cylindres de seringue contenant soit des cellules ou des milieux avec pratiquement aucun espace mort. B) Une fois que la vanne est vidée et les deux barillets sont mis en place, le tube de silicone à partir de la soupape est reliée à la chambre d&#39;écoulement. Il est essentiel que lors de la connexion de l&#39;adaptateur sur le tube de silicone à l&#39;orifice de la chambre de circulation, il ya une interface liquide / liquide. &lt;a href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir l&#39;image. <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5.jpg" /> Figure 5. Mesure de l&#39;adhérence leucocytaire totale. Pendant les deux dernières minutes de l&#39;étape de bolus de tampon de lavage (tel que décrit dans le protocole), un minimum de dix champs aléatoires doit être enregistré. Ceux-ci peuvent être analysées hors ligne et le nombre total de cellules fermement adhérentes peuvent être comptés dans chaque champ. Adhérence totale de leucocytes peut être comparé entre les chambres de contrôle et ceux prétraitée avec des anticorps bloquants, nous montrons ici un champ représentatif d&#39;un tiroir de commande et un coulisseau prétraitée avec adhérence intracellulaire molécule-1 (ICAM-1) un anticorps bloquant. Les flèches ont été ajoutés pour mettre en évidence les leucocytes adhérents, dans la représentationTive domaine de la lame de contrôle, il ya un total de 25 leucocytes identifié et dans le bloc coulissant ICAM-1, il ya un total de 13 leucocytes identifié. Barres d&#39;échelle = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6.jpg" /> Figure 6. L&#39;analyse de la tendance de l&#39;adhésion des leucocytes sur des monocouches endotheliales par microscopie à contraste de phase. Analyse hors ligne des champs enregistrés peut également être utilisé pour étudier la direction et la vitesse de l&#39;adhésion des leucocytes. Les étapes spécifiques de la cascade d&#39;adhérence peuvent être visualisées et quantifiées en utilisant l&#39;imagerie par contraste de phase. Phase cellules lumineuses qui sont fermement adhérente mais pas activé peuvent être qualifiées adhésion «rondes», les cellules qui sont activated et la phase lumineuse peuvent être qualifiées de «forme changé» et les cellules qui sont phase sombre sont les cellules qui ont subi migration trans et peuvent être appelés «migré». L&#39;image montre des exemples de chaque motif d&#39;adhérence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> .

le recrutement de leucocytes dans le foie se produit dans les canaux spécialisés des sinusoïdes hépatiques qui sont bordées par des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques uniques. Phase microscopie en contraste de recrutement de leucocytes à travers l&#39;endothélium sinusoïdal hépatique humaine dans des conditions de stress de cisaillement physiologique peut faciliter l&#39;élucidation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent ce processus.

Un flux Essai d&#39;adhésion à étudier Leucocyte recrutement pour hépatiques humaines sinusoïdales endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier les mécanismes du recrutement des leucocytes à travers les cellules endothéliales humaines du foie en présence de niveaux physiologiques de contrainte de cisaillement. Cet objectif est atteint en préparant tout d'abord une monocouche confluente de cellules endothéliales sinusoidales hépatiques humaines dans une chambre de microscopie, puis en stimulant ces cellules avec des cytokines inflammatoires. La deuxième étape consiste à isoler les lymphocytes à partir du sang périphérique.Ensuite, la lame microscopique est connectée à un système d'essai d'écoulement et perfusée avec des lymphocytes en présence d'un cisaillement physiologiquement pertinent. La dernière étape consiste à visualiser les interactions des lymphocytes dans des conditions d'écoulement à l'aide d'un microscope à contraste de phase. Enfin, l'analyse hors ligne des images en contraste de phase acquises pendant l'essai d'écoulement est utilisée pour comparer l'effet de divers inhibiteurs sur le recrutement des lymphocytes à travers les cellules endothéliales hépatiques.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'hépatologie, comme quelles combinaisons de protéines d'adhésion et de récepteurs chimiotactiques sont importantes pour le recrutement de diverses populations de cellules immunitaires à travers l'endothélium sinusoïdal et vers le parenchyme hépatique. Les implications de cette technique s'étendent au traitement des maladies hépatiques inflammatoires chroniques, dont la majorité sont provoquées par le recrutement de lymphocytes dans le tissu hépatique. La compréhension des mécanismes moléculaires pourrait conduire à de nouvelles thérapies anti-inflammatoires.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le recrutement des cellules inflammatoires vers le foie humain. Elle peut également être appliquée à d'autres types cellulaires, tels que les cellules endothéliales, isolées de la veine ombilicale ou d'autres lits vasculaires. Pour commencer, préparez une solution working à 200 microgrammes par millilitre de collagène de queue de rat, de type I, en la diluant à partir d'une solution mère dans du PBS stérile.Ensuite, injecter 30 microlitres du collagène dilué dans chaque canal d'une lame microscopique à six canaux et incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Préparer ensuite le milieu complet en complétant le milieu basal endothélial humain avec du L-glutamine, de la pénicilline et de la streptomycine inactivées par la chaleur, du sérum humain, du facteur de croissance endothélial vasculaire et du facteur de croissance hépatocytaire. Puis, à l’aide de la trypsine-EDTA, récolter les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques humaines cultivées à confluence à partir d’un flacon T 75, centrifuger les cellules, les laver dans du PBS, puis les resuspendre à une concentration de trois fois 10 à la puissance six cellules par millilitre dans le milieu complet.Ensuite, lavez la lame microscopique trois fois avec du PBS, puis ajoutez 30 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque canal de la lame microscopique revêtue de collagène. Laissez les cellules adhérer pendant une heure dans un incubateur humide à 37 degrés Celsius avec une atmosphère de 5 % CO2. Une fois les cellules adhérentes, remplissez les orifices situés de chaque côté de chaque canal avec du milieu complet et replacez-les dans l'incubateur pendant 24 heures.Après 24 heures, utilisez un microscope inversé à contraste de phase pour vérifier que la croissance cellulaire a atteint 80 % de confluence. Ensuite, préparez les cytokines pour la stimulation cellulaire en ajoutant 10 nanogrammes par millilitre de TNF alpha et 10 nanogrammes par millilitre d'interféron gamma à un millilitre de milieu complet. Puis, 24 heures avant de réaliser le test d'adhérence, remplacez le milieu de culture cellulaire par 0,1 millilitre de milieu enrichi en cytokines afin de stimuler les cellules, et purifiez la fraction mononucléée à partir de sang total par centrifugation en gradient de densité sur un milieu de séparation cellulaire approprié, tel que le lympho light, pendant 25 minutes à 800 × g.Ensuite, transférez la fraction mononucléaire dans un nouveau tube et complétez avec du PBS contenant 0,1 % volume par volume de BSA. Centrifugez le tube pendant 10 minutes à 125 ×g pour éliminer les plaquettes de la solution. Lavez ensuite le culot avec du PBS contenant 0,1 % volume par volume de BSA, puis centrifugez pendant 10 minutes à 800 ×g. Resuspendez le culot dans 10 millilitres de RPMI contenant 0,1 % volume par volume de BSA, placez les cellules dans un flacon T 75 traité pour culture tissulaire et incubez pendant une heure afin de permettre l'adhésion des monocytes présents dans la fraction.Ensuite, retirez soigneusement le surnageant enrichi en lymphocytes et faites tomber les cellules par centrifugation à 800 fois la gravité pendant 10 minutes. Prétraitez alors les lymphocytes isolés par resuspension dans une solution RPMI contenant 0,1 % volume par volume de BSA et soit 200 nanogrammes par millilitre d'anticorps bloquant spécifiquement la fonction de la toxine de la coqueluche, soit des inhibiteurs spécifiques des récepteurs des chimioattractants. Incubez les lymphocytes dans la solution d'inhibiteur pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, puis faites tomber les cellules par centrifugation et rincez-les dans du PBS contenant 0,1 % volume par volume de BSA.Ensuite, centrifuger à nouveau les cellules, puis les resuspendre dans du milieu d'écoulement à une concentration de un fois dix puissance six cellules par millilitre. Préchauffer une chambre environnementale transparente à commande thermostatique à 37 degrés Celsius. La chambre doit comporter des orifices permettant l'insertion de tubulures en silicone et une alimentation électrique pour une vanne solénoïde.Remplissez une seringue en verre de 50 millilitres munie d'un système de verrouillage d'appât avec 10 millilitres d'eau distillée stérile. Ensuite, fixez un morceau de tube en silicone de 25 centimètres à l'orifice de la seringue et insérez la seringue dans une pompe à seringue. Réglez la vitesse d'aspiration de la pompe conformément aux instructions du fabricant de la microplaque afin de maintenir une contrainte de cisaillement de 0,05 pascal ou 0,5 dyne par centimètre carré.Jetez les pistons de deux seringues de cinq millilitres et fixez les cylindres aux deux orifices d'entrée d'un électrovanne à l'aide d'un centimètre de tubulure en silicone. Ensuite, fixez douze centimètres de tubulure en silicone à l'orifice de sortie de la vanne. Insérez du tampon de lavage sans cellules dans les deux valves de seringue et rincez l'électrovanne.Veillez à ce que le tampon circule d'un fût à travers le robinet et dans le tube en silicone de sortie. Ensuite, tournez l’interrupteur du robinet vers l'autre fût et assurez-vous que le tampon continue de circuler. Éliminez toutes les bulles d'air du système.Ensuite, remplacez le tampon de lavage dans l'un des fûts par la suspension de lymphocytes contenant un fois 10 à la puissance six cellules par millilitre. Connectez le tube en silicone provenant de la pompe à seringue à un orifice d'un canal microscopique choisi à l'aide d'un adaptateur pour lame microscopique. Puis, reliez le tube en silicone provenant de la vanne de sortie à l'orifice opposé du même canal microscopique, également à l'aide d'un adaptateur pour lame microscopique.Ensuite, fixez la lame microscopique sur la platine du microscope à l'aide de pinces ou de ruban adhésif afin d'éviter tout déplacement. Réglez le microscope sur l'objectif 10 x avec le réglage de contraste de phase approprié avant de commencer la perfusion. Assurez-vous qu'une caméra est correctement fixée au microscope et prête à transmettre les images sur un écran pour l'enregistrement.Veillez à ce que la monocouche endothéliale soit au point en utilisant une pompe à seringue pour perfuser la couche endothéliale avec un tampon de lavage sans cellules pendant deux minutes, en commençant par la rétraction de la pompe à seringue afin d'éliminer tous les débris ou les anticorps bloquants non liés. Ensuite, basculez le robinet pour permettre une injection en bolus de solution de lymphocytes pendant cinq minutes à une paroi constante. Un cisaillement de contrainte de 0,05 pascals pendant les deux dernières minutes du bolus de lymphocytes.Enregistrez 10 champs aléatoires le long de la longueur de la lame microfluidique pendant 10 secondes. Chaque déplacement entre les enregistrements doit être effectué contre le sens du flux. Pour éviter d’enregistrer deux fois la même cellule roulante après le bolus de lymphocytes, remettez la valve en position initiale, puis appliquez un bolus de cinq minutes de tampon de lavage sans cellules.Enregistrez un deuxième passage sur 10 champs sélectionnés aléatoirement pendant cinq secondes chacun. Pendant les deux dernières minutes de ce bolus, le mouvement de roulement des lymphocytes peut être facilement visualisé à l’aide de cette technique de test d’écoulement. Les cellules en roulement sont identifiées par leur vitesse réduite à la surface endothéliale par rapport aux cellules en circulation.Dans cet essai d'écoulement, moins de 10 % des lymphocytes adhérents roulaient de manière persistante sur les cellules endothéliales stimulées, ce qui confirme que l'essai d'écoulement reflète l'environnement des sinusoides hépatiques. L'enregistrement provenant du bolus de tampon de lavage est utilisé pour évaluer l'adhérence totale des lymphocytes.Les cellules adhérentes fermement sont définies comme des cellules stationnaires ou ayant changé de forme, présentant un comportement de rampe lent. On observe ici des champs représentatifs provenant d'une lame témoin et d'une lame prétraitée avec une molécule d'adhésion intercellulaire, ainsi qu'un anticorps bloquant. Le degré d'adhérence des lymphocytes dans chaque condition est exprimé en nombre de cellules adhérentes par millimètre carré par million de cellules perfusées.Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes peuvent être réalisées, comme la microscopie confocale, afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la localisation exacte de la migration transendothéliale ou les modifications du cytosquelette survenant lors du recrutement sous contrainte de cisaillement après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs étudiant l'inflammation hépatique ou d'autres organes, leur permettant d'explorer la manière dont les populations spécifiques de cellules endothéliales régulent le processus de recrutement des leucocytes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de l'évaluation du recrutement des lymphocytes à travers les cellules endothéliales humaines du foie, ainsi que du dénombrement des cellules immunitaires à différents stades de la cascade d'adhésion.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Ce rapport fournit une représentation visuelle des plaques parallèles d'analyse chambre d'écoulement pour l'étude des interactions des leucocytes endothéliales sous la contrainte de cisaillement physiologique. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier le rôle de l'endothélium (E)-sélectine et la E-sélectine leucocytaire ligands qui déclenchent des leucocytes roulant sur la surface des cellules endothéliales.

Analyse des leucocytes roulant physiologique E-sélectine-Mediated sur l&#39;endothélium microvasculaire

C'est une méthode pour visualiser l'adhésion des leucocytes à l'endothélium dans les vaisseaux sous pression récoltés. La technique permet l'étude de l'adhérence vasculaires sous flux de cisaillement avec différentes pressions intraluminale jusqu'à 200 mmHg donc imitent-ment les conditions physiopathologiques de l'hypertension artérielle.

Adhésion leucocytaire imagerie de l&#39;endothélium vasculaire au Haute pression intraluminale

Chambres d'écoulement microfluidiques gravés par photolithographie et fabriqué à partir de PDMS sont appliqués à sonder les résultats fonctionnels associés à une dysfonction CE et de l'inflammation. Dans une expérience représentative, la capacité de contrainte de cisaillement différentiel de moduler l'adhésion cellulaire monocytaire à cytokine activé monocouches CE est démontrée.

On-Chip phénotypage endothélium inflammatoire

Cette vidéo présente un test basé sur le flux laminaire pour caractériser l’interaction des leucocytes et des partenaires cellulaires tels que les cellules endothéliales. Cette méthode fournit des informations dynamiques sur l’adhésion, la deadhesion et la transmigration des leucocytes lorsqu’ils sont perfusés sur une couche intacte et confluente de cellules vasculaires.

Un test basé sur le flux laminaire pour étudier les interactions entre les leucocytes et les cellules endothéliales

Les chambres d’écoulement utilisées dans les expériences d’adhérence sont généralement constituées de voies d’écoulement linéaires et nécessitent plusieurs expériences à différents débits pour générer une carte d’adhérence par cisaillement.  SynVivo-SMN permet de générer une carte d’adhérence au cisaillement à l’aide d’une seule expérience utilisant des volumes de microlitres, ce qui permet de réaliser des économies significatives de temps et de consommables.

Génération de cisaillement d&#39;adhésion Carte Utilisation SynVivo réseaux microvasculaires synthétique

Un procédé de quantification de l'adhésion des neutrophiles est rapporté. Cette méthode permet de créer un environnement dynamique d'écoulement semblable à celle rencontrée dans un vaisseau sanguin. Il permet à l'enquête de l'adhésion des neutrophiles soit à des molécules purifiées d'adhésion (ligand) ou substrat de cellules endothéliales (HUVEC) dans un contexte similaire à l'environnement in vivo avec contrainte de cisaillement.

Human neutrophiles Chambre flux Essai d&#39;adhésion

Ici, nous présentons un protocole qui permet à l'enquêteur d'évaluer la dynamique du recrutement de leucocytes ex vivo en connectant une chambre revêtue d'adhérence des molécules dérivées de l'endothélium dans le système circulatoire d'une souris. Cette méthode offre des avantages importants, car il permet l'évaluation de leucocytes dans des conditions biologiques relatives.

Évaluer les interactions de leucocytes-endothélial dans des conditions d'écoulement dans un Ex Vivo Autoperfused Microflow Chambre Assay

Ce test d'adhésion de flux fournit un modèle d'impact simple, élevé d'interactions cellulaires de cellules épithéliales T. Une pompe à seringue est utilisée pour générer une contrainte de cisaillement, et la microscopie confocale capture des images pour la quantification. Le but de ces études est de quantifier efficacement l'adhérence des cellules T en utilisant des conditions d'écoulement.

Dosage de Adhérence Sous contrainte de cisaillement pour l&#39;étude des lymphocytes T-Adhesion Molecule Interactions

Leucocytes avidement interagissent avec les cellules vasculaires et plaquettes après blessure de mur de navire ou lors d’une inflammation. Nous décrivons ici un simple test à flux laminaire pour caractériser les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions entre les leucocytes et leurs partenaires cellulaires.

Analyses d’enquêter sur le recrutement des leucocytes sur les cellules vasculaires et plaquettes adhérentes à flux laminaire

Nous présentons ici un protocole intégré qui mesure la sous-population de monocyte traite sous flux in vitro par l’utilisation de marqueurs de surface spécifiques et la microscopie confocal fluorescence. Ce protocole peut être utilisé pour explorer les étapes séquentielles de recrutement aussi bien quant à profil autres sous-types de leucocytes à l’aide d’autres marqueurs de surface spécifiques.

Étude simultanée du recrutement des sous-populations de Monocyte sous flux In Vitro

Ce protocole étape par étape fournit une description détaillée du montage expérimental et analyse des données pour l’évaluation des réponses inflammatoires hiPSC-ECs et l’analyse de l’adhérence des leucocytes dans un écoulement physiologique.

Microfluidique analyse pour l’évaluation de l’adhésion leucocytaire à humaine Induced Pluripotent Stem Cell dérivé des cellules endothéliales (hiPSC-ce)

Découvrez un essai d'adhésion en flux pour étudier le recrutement des leucocytes sur l'endothélium sinusoïdal hépatique humain sous contrainte de cisaillement physiologique. Cette méthode permet d'identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans les maladies inflammatoires chroniques du foie.

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Un flux Essai d'adhésion à étudier Leucocyte recrutement pour hépatiques humaines sinusoïdales endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement

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