Isolement de cellules souches du cancer à partir d'échantillons cancer de la prostate humaine

L'isolement des cellules souches cancéreuses (CCM) directement à partir de tissus humains est nécessaire pour leur caractérisation biologique. Ce manuscrit décrit une méthodologie pour l'isolement des CSC de la prostate à partir de tissus humains, tout en offrant des conseils sur le dépannage des mesures difficiles.

L’objectif général de cette procédure est de décrire l’isolement de cellules souches du cancer de la prostate à partir de tissus humains par télécopieur. Ceci est accompli en traitant d’abord le tissu cancéreux de la prostate prélevé sur des échantillons chirurgicaux. Dans la deuxième étape, une suspension cellulaire est générée à partir des sections de tissu et les cellules sont marquées avec des anticorps fluorescents.

Dans la dernière étape, les cellules souches du cancer de la prostate sont triées par faits. En fin de compte, les attributs moléculaires et fonctionnels des cellules isolées peuvent être caractérisés par la xénotransplantation et le profilage de l’expression génique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer de la prostate en facilitant la caractérisation moléculaire et fonctionnelle des cellules souches cancéreuses à partir d’échantillons humains.

Samuel Vidal, un étudiant au doctorat en médecine, Aiden Quinn, un étudiant à la maîtrise, et jania feront la démonstration de la procédure. Notre recherche A du laboratoire Commencez par prélever l’excès de tissu en vrac des échantillons de cancer non nécessaires au diagnostic clinique dans un tube conique de 50 millilitres contenant 15 millilitres de milieu. Conservez immédiatement le tube à quatre degrés Celsius pour le traiter dans les 24 heures suivant la résection, puis travaillez dans une enceinte de biosécurité avec un scalpel stérile et une pince.

Obtenez des coupes horizontales de tissu de deux à quatre millimètres d’épaisseur à partir des nodules tumoraux macroscopiques dans l’échantillon de tissu cancéreux. Placez ces sections dans un nouveau tube de 50 millilitres contenant du fluide. Ensuite, séparez une partie et fixez-la dans du formol à 10 % pour une analyse histologique afin de confirmer la présence de tissu cancéreux de la prostate pour générer des suspensions cellulaires à partir du tissu tumoral.

Ensuite, transférez chacune des sections de tissu de deux à quatre millimètres dans une boîte de culture de 60 x 15 millimètres contenant un millilitre de PBS stérile Tritrate mécaniquement les échantillons à l’aide d’un scalpel stérile et d’une pince et regroupez les suspensions cellulaires résultantes dans un seul tube conique stérile de 50 millilitres. Ajoutez un autre millilitre de PBS dans la boîte d’échantillon, en répétant l’itération trois à quatre fois jusqu’à ce que chaque section de tissu soit complètement dissociée. Ensuite, utilisez une pipette de cinq millilitres pour mélanger la solution cellulaire.

Vortex les solutions cellulaires à vitesse maximale pendant une minute, puis filtrez la boue cellulaire résultante à travers une crépine cellulaire de 35 micromètres dans un deuxième tube conique stérile de 50 millilitres. Faites tourner les cellules filtrées pendant 10 minutes à 450 fois G à température ambiante. Ensuite, mettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de tampon de lyse des globules rouges.

Après cinq minutes, faites tourner à nouveau les cellules. Resus suspendant la pastille libre de globules rouges dans une petite quantité de PBS complétée par 5 % FBS pour le comptage par exclusion du bleu trian. Après avoir quantifié le nombre de cellules viables, diluez les cellules à une fois 10 à six cellules par millilitre de suspension et stockez-les sur de la glace pendant pas plus d’une heure.

Pour isoler les cellules souches du cancer de la prostate, commencez par étiqueter cinq tubes coniques de 15 millilitres, comme il a été démontré qu’ils excluent les cellules hématopoïétiques et endothéliales lors du tri. Répartissez la suspension cellulaire générée à partir des sections de tissu tumoral entre les cinq tubes, puis incubez les cellules avec les anticorps appropriés à une dilution de un à 250 pendant 30 minutes sur de la glace. Ensuite, faites tourner les cellules, puis lavez les granulés dans du PBS stérile complété par 10 %FBS Après le lavage, incubez les granulés dans 10 microgrammes par millilitre de DPI et filtrez les solutions finales à travers des capuchons de crépine de 35 micromètres dans des tubes de polystyrène de 12 par 75 millimètres.

Utilisez les quatre premiers tubes pour régler les portes pour la diffusion latérale avant dpi, fite et pe. Enfin, utilisez le tube cinq pour recueillir les populations HLA de classe un négatif et HLA de classe 1 positives dans des tubes coniques stériles individuels de 15 millilitres contenant deux millilitres de RPMI complétés par 10 % de FBS. Ensuite, faites tourner les suspensions cellulaires triées et remettez les granulés en suspension dans 200 à 500 microlitres de milieu pour la quantification des cellules viables par exclusion du bleu trian.

Le protocole démontré facilite l’isolement de cellules souches de cancer de la prostate HLA négatives de classe un à partir d’échantillons chirurgicaux humains. Ces images illustrent les nodules tumoraux macroscopiques grossièrement visibles qui peuvent être traités puis confirmés par microscopie. Comme démontré, les cellules viables sont isolées par leur coloration DAPI négative, la fréquence des cellules souches négatives du cancer de la prostate de classe un HLA peut alors être déterminée.

Le nombre de cellules souches du cancer de la prostate de classe 1 HLA négatives varie d’un patient à l’autre, mais représente généralement 0,5 à 8 % de la population vivante totale après cette procédure. D’autres méthodes, comme le profilage de l’expression génique et la xénotransplantation, peuvent être utilisées afin de mieux caractériser les mécanismes qui contribuent à la résistance à la chimiothérapie et à la progression de la maladie.