Imaging Plasma Membrane déformations Avec pTIRFM

L’objectif de cette procédure est de montrer comment la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale basée sur la polarisation est mise en œuvre pour l’étude du remodelage membranaire lors de l’exocytose régulée. Pour ce faire, il faut d’abord s’assurer que les éléments optiques, à savoir la plaque quart d’onde et les cubes polarisants, sont correctement positionnés pour générer des polarisations d’excitation p et s discrètes. La deuxième étape consiste à vérifier que les faisceaux p et s sont colinéaires, passent à travers l’axe optique du microscope et éclairent la même partie du champ de vision lorsqu’ils sont en fluorescence à réflexion interne totale ou TIRF.

Ensuite, les cellules à imager sont colorées avec la matrice de cyanure de carbo et stimulées avec des stimuli dépolarisants pour déclencher l’exocytose. La dernière étape consiste à capturer des images de la fusion de vésicules à noyau dense en TIRF. En fin de compte, P-T-I-R-F est utilisé pour acquérir des images en temps réel afin de surveiller les changements topologiques membranaires qui résultent de l’exocytose des cellules chrominiques.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la pyrométrie et la capacité membranaire, est que le ptro F signale une courbure de la membrane et, par extension, une dilatation directe de l’orifice de fusion. La partie la plus raide de la courbe d’apprentissage avec cette technique est d’abord d’apprendre à aligner les polarisations d’excitation p et s, de sorte qu’elles se déplacent en coligne à travers l’axe optique du microscope et éclairent la même partie du champ d’imagerie. Une deuxième question qui se pose souvent concerne la coloration cellulaire, à savoir combien de temps exposer les cellules à dd et ce qui constitue une cellule bien colorée par rapport à une cellule mal colorée.

La démonstration de la procédure sera faite par TA square row, un étudiant diplômé de notre laboratoire. Pour commencer à mettre sous tension tous les composants du microscope, les lasers et les ordinateurs dirigent un faisceau du laser de 488 nanomètres vers le plan focal arrière de la lentille à ouverture numérique de 1,49. Si le faisceau laser est focalisé sur le plan focal arrière, il émergera, s’assemblera et apparaîtra comme un petit point bien défini au plafond directement au-dessus de l’objectif.

Ajustez ensuite le miroir du galvanomètre X de manière à ce que le faisceau laser soit déplacé hors de l’axe et émerge de l’objectif à des angles de plus en plus raides par rapport à la normale de l’objectif. Ensuite, vérifiez que la réflexion interne totale ou TIR est obtenue. Ajouter 10 microlitres de microsphères fluorescentes à un volume d’un millilitre de solution saline physiologique et une parabole à fond en verre.

La détection de microsphères flottantes indique que l’angle entre la lumière incidente et la normale objective est insuffisant. Pour l’imagerie basée sur la polarisation, utilisez le faisceau aligné de 488 nanomètres comme guide et ajustez la position du faisceau laser brut de 561 nanomètres afin qu’il se déplace le long d’un chemin optique identique. Le laser de 561 nanomètres sera utilisé pour l’imagerie du colorant cyanure de carbo.

Une lentille et des miroirs divergents se trouvent en aval du laser de 561 nanomètres. À l’aide des boutons de réglage sur les miroirs, ajustez le faisceau de manière à ce qu’il soit aligné avec le faisceau de 488 nanomètres et que le spot soit net sur le plafond. Lorsque les miroirs du galvanomètre sont en position zéro, un cube de polarisation réfléchit la composante verticale du champ électrique et passe la composante horizontale.

Il est placé en aval du faisceau polarisé elliptiquement sur une petite platine de translation. Pour faciliter l’alignement ultérieur de la polarisation, les trajets du faisceau utilisent un deuxième cube polarisant et des miroirs pour recombiner les faisceaux. Un obturateur est placé entre le premier cube de polarisation et le miroir de la composante verticale.

Un deuxième obturateur est placé entre le miroir de la composante horizontale et le deuxième cube de polarisation. Ces obturateurs sont contrôlés par le logiciel d’imagerie, ce qui permet à l’utilisateur de choisir rapidement entre les polarisations du faisceau. Utilisez un filtre polarisant pour vérifier l’orientation du champ électrique dans chaque trajet du faisceau.

Un filtre polarisant ne permettra une transmission que dans l’axe du filtre. Vérifiez que les composantes verticales et horizontales du faisceau laser sont alignées les unes avec les autres et avec le faisceau de 488 nanomètres, effectuez les ajustements nécessaires. Les trois faisceaux doivent tous être focalisés sur le plan focal arrière et émerger assemblés de l’objectif au même endroit au plafond.

Cet endroit peut être marqué d’un X pour faciliter l’alignement futur. Ensuite, placez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif. Placez la parabole contenant des microsphères fluorescentes.

Sur l’objectif, entrez TIR en déplaçant le miroir du galvanomètre X dans le logiciel de déplacement de miroir dans TIR. La composante verticale du faisceau est la polarisation S et la composante horizontale du faisceau est maintenant le centre de polarisation P, une plaque quart d’onde ou qw dans le trajet du faisceau. Immédiatement en aval de l’ouverture du laser, visualisez chaque champ évanescent polarisé avec un échantillon de bâtonnet, qui est prédit pour être orienté de manière aléatoire.

Faites pivoter la plaque qw pour qu’elle corresponde à l’intensité moyenne des pixels. Isolez les cellules chrominiennes saines de la glande surrénale du chat comme décrit dans le protocole textuel, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et préparez-vous pour la transfection des cellules transfectives avec de l’ADN codant pour la protéine d’intérêt à l’aide du système d’électroporation conformément aux recommandations du fabricant. Les paramètres qui offrent le meilleur équilibre entre l’efficacité de la transfection et le taux de survie cellulaire.

Pour cette préparation de cellules de chromine bovine, il s’agit de 1, 100 volts, 40 millisecondes et d’une impulsion suivant doucement les cellules de plaque de transfection sur des plats traités à la poly de lycine et au collagène dans un millilitre de média électro paradant chauffé. Placez la vaisselle dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Ajoutez un millilitre de deux antibiotiques dans chaque plat Après six heures, remplacez le milieu par un milieu normal le lendemain.

Les cellules de chromine sont généralement imagées 48 à cinq jours après l’électroporation avec le système d’imagerie sur le logiciel d’acquisition de démarrage. Vérifiez que les lasers sont alignés. Vérifiez le profil de champ évanescent à l’aide de microsphères.

Préparer le système de profusion global et local. Nettoyez les réservoirs de solution avec de l’eau désionisée filtrée et remplissez-les de solutions salines physiologiques basales et stimulantes. Avant d’imager les cellules chrominées, vérifiez que la polarisation P et l’excitation de polarisation S éclairent la même région du champ de visualisation et que les intensités d’éclairage sont à peu près équivalentes, comme détaillé dans le protocole texte.

Procédez maintenant à la coloration des cellules chromatiques bovines avec DD.Rincez les milieux de culture de la boîte contenant les cellules chrominiques et remplacez-les par deux millilitres de solution saline physiologique basale. Ajoutez 10 microlitres de DD de 10 millimolaires directement dans la boîte contenant les cellules. Agitez doucement le plat pendant deux à 10 secondes avant de retirer la solution.

Lavez la vaisselle trois à quatre fois avec une solution saline physiologique basale pour éliminer tout DD résiduel, les cellules sont maintenant colorées et prêtes à l’emploi. Ajoutez une goutte d’huile d’immersion dans l’objectif. Placez la parabole contenant des cellules de chromine colorées Dai D sur le dessus de l’objectif.

Positionnez l’aiguille de perfusion locale de manière à ce qu’elle soit à environ 100 microns de la cellule. Concentrez-vous sur la membrane cellulaire et activez le matériel de mise au point automatique immédiatement avant l’acquisition de l’image de stimulation cellulaire. Commencer l’acquisition d’images en perfusant les cellules pendant 10 secondes avec une solution basale, puis pendant 60 secondes avec une solution dépolarisante de chlorure de potassium de 56 millimolaires.

Acquérez des images tout en obturant rapidement entre une polarisation P de 561 nanomètres et une polarisation s de 561 nanomètres pour surveiller les changements dans les émissions de P et S d’excitation DD et 488 nanomètres. Pour imager la sonde vésiculaire transfectée, le marquage membranaire exubérant des cellules chrominiques est réalisé après une brève incubation avec Dai D.In cet exemple, la membrane cellulaire est bien colorée. Une cellule adhérente saine présentera des différences distinctes dans les émissions de p et de s.

L’image d’émission P montre une bordure de cellule plus claire par rapport au reste de la cellule. L’image d’émission S montre une fluorescence à peu près uniforme sur l’ensemble de l’empreinte cellulaire, calculée pixel par pixel P sur S et p plus deux s. Les images sont sensibles à la courbure de la membrane et à la concentration du colorant respectivement.

Le CHRO et la cellule montrés ont également été transfectés avec le synap OIN d’un florin pour marquer les vésicules sécrétoires. Le CHRO et la cellule sont stimulés avec du chlorure de potassium pour dépolariser la membrane cellulaire et déclencher l’exocytose. Un certain nombre de taches fluorescentes à juste titre deviennent soudainement évidentes lorsque des vésicules à noyau dense fusionnent.

Pour analyser cet événement de fusion, image par image, les changements d’intensité d’image ont été examinés : un florin po, VS et p plus deux s intensités d’image ont été examinés. L’intensité de la fluorescence de CIT one diminue rapidement à mesure que la protéine se diffuse loin du site de fusion. L’indentation représentant le complexe de membrane plasmique de la vésicule fusionnée diminue à un rythme relativement plus lent.

Cette illustration illustre une interprétation de ces mesures. La déformation rapide et localisée de la membrane est le résultat d’un stimulus évoqué : l’influx de calcium, la dépolarisation membranaire provoque une augmentation significative de la fluorescence G Camp 5G, ce qui signifie une augmentation des niveaux de calcium subplasmalique. Une région de 30 x 20 pixels de la cellule est sélectionnée et image par image change en G camp 5G PS et p plus deux s.

Les intensités des pixels sont indiquées dans les images et les graphiques. Le temps zéro désigne le cadre avant qu’un changement de PS ne soit évident. Les pointes de flèches blanches indiquent que la déformation de la membrane s’accompagne d’une diminution de l’émission de p plus deux S.

La protéine cytosolique G CAMP 5G est exclue de la zone par la vésicule centrale dense fusionnée. Notons également la diminution soudaine de l’intensité de la 5G au camp G à parfois zéro. L’augmentation à longue durée de vie du POS et la diminution de p plus deux s suggèrent un pore de fusion qui se dilate lentement, comme illustré.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de construire un système PTU F et d’imager les cellules pour observer les changements topologiques de la membrane pendant le terrain après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer les changements de forme de la membrane lors de l’exocytose, de l’endocytose, de la cytokinèse et de la motilité cellulaire dans les cellules vivantes.