Name: Extracellulaire fil Tetrode enregistrement dans le cerveau des insectes Marcher librement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-01T16:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: Apprenez l'enregistrement extracellulaire par tétrade dans le cerveau de blattes en mouvement libre. Cette technique synchronise l'activité neuronale avec les comportements locomoteurs pour étudier la fonction cérébrale.

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Les auteurs remercient Nick Kathman suggestions et aider à la préparation du manuscrit. Cette technique a été développée en collaboration avec les travaux soutenus par le AFOSR sous subvention FA9550-10-1-0054 et la National Science Foundation Grant No. 1120305 IOS-RER.

Une. Préparation des fils TETRODE <ol><li> Tirez un très mince fil de nichrome (12 um de diamètre, revêtement PAC) d&#39;environ 1,1 m de longueur. Fixez une étiquette de bande à chaque extrémité. Accrocher le fil sur une tige filetée horizontale de telle sorte que les deux extrémités sont à la même hauteur près de la paillasse. </li><li> Répétez l&#39;étape 1.1 pour un second fil, faisant deux autres extrémités pour un total de 4, et placez-le à côté du premier fil (environ 1 cm entre les deux). </li><li> Collez les quatre extrémités avec une étiquette de bande et l&#39;attacher à un dispositif d&#39;enroulement rotatif motorisé. Ce dispositif peut être réalisé à partir d&#39;un moteur à courant continu peu coûteux. </li><li> Enroulez la tétrode dans un sens pendant 2 min (60 min) et détendez-vous dans la direction opposée pendant 30 sec. </li><li> Utilisez un pistolet à air chaud pour faire fondre les fils ensemble. Ne touchez pas les fils avec le pistolet. Utilisez trois de haut en bas passe de directions alternées, à chaque passage de prendre environ 10 secondes. </li><li> Couper le haut et le bas des fils enroulés. Les quatre fils sont torsadés und La fusionnés ensemble à une extrémité mais se séparer à l&#39;autre. </li><li> Ajouter le tube de support. Couper une longueur de 30 cm d&#39;un tube en polyéthylène (diamètre: 0,28 mm à l&#39;intérieur, à l&#39;extérieur de 0,61 mm). Enfilez la tétrode très lentement et avec précaution dans le tube de support de sorte qu&#39;il n&#39;est pas tordu. </li><li> Une fois que l&#39;extrémité fondue apparaît sur l&#39;autre côté, le passer à travers de sorte qu&#39;il existe une longueur égale de fil aux deux extrémités du tube de guidage. </li><li> Prenez l&#39;extrémité séparée de chaque fil avec une pince. Utilisation de la base de la flamme d&#39;un brûleur à gaz, brûler soigneusement l&#39;isolation hors du 2 ou 3 derniers mm de chaque fil. Chauffer le fil jusqu&#39;à ce qu&#39;il brille, mais ne pas se courber. </li><li> Connectez la tétrode avec un IC adaptateur prise mâle-femelle qui s&#39;adapte à votre appareil d&#39;enregistrement. Mettre l&#39;extrémité de chaque fil deinsulated dans une autre prise de l&#39;adaptateur avec une pince. Stabiliser le fil dans la prise avec une petite broche en laiton. Utilisez un fer à souder pointe fine et remplir la douille avec la soudure fondue. Attention à ne pas communiquerle fil fragile avec le fer à souder. </li><li> Vérifier l&#39;impédance de chaque fil et le inter impédance de chaque paire de fils. <ol><li> Placer l&#39;, extrémité torsadée condensé dans un récipient de solution saline et de connecter un conducteur de fil de cuivre à partir de la solution saline à l&#39;ohmmètre. </li><li> Connecter l&#39;autre extrémité de l&#39;appareil de mesure à l&#39;axe de la douille contenant le fil. L&#39;impédance de chaque fil doit être inférieure à 3 MQ. </li><li> Si les valeurs ci-dessus ne sont pas atteints, retenter les connexions à souder. </li><li> Retirez les fils de la solution saline, rincez-les avec de l&#39;eau, et de tester l&#39;impédance entre de fil pour chaque paire (n = 6). L&#39;impédance entre devrait être supérieure à 5 MQ. </li><li> Si les valeurs ci-dessus ne sont pas atteints, découper une petite quantité de la pointe d&#39;envoi à la fin fondu et retester. </li><li> Jeter n&#39;importe quel fil ensemble qui ne répond pas à la fois des exigences d&#39;impédance pour tous les fils. </li></ol></li><li> Fixez la tétrode. <ol><li> Pliez une petite boîte rectangulaire de papier slightly plus grande que l&#39;adaptateur de prise de courant. </li><li> Transférer l&#39;adaptateur dans la boîte avec le côté mâle au fond. Pénétrer dans la boîte de telle sorte que toutes les broches du côté masculin sont en dehors de la boîte tandis que le reste de la carte est dans la boîte. </li><li> Collez les coins de la boîte à l&#39;extérieur. Utilisez de petits morceaux de ruban adhésif double face à l&#39;intérieur de la boîte à stabiliser les brins individuels de fil. Le fil doit être fusionné à sa sortie de la boîte. </li><li> Mélanger prise rapide 2 partie époxy et verser dans la boîte pour fixer l&#39;adaptateur et tous les fils. </li><li> Fixer l&#39;extrémité proche du tube de guidage d&#39;un côté de la boîte avec de la cire dentaire, tout en laissant le tube ouvert de telle sorte que la tétrode peut être tiré à travers librement aux deux extrémités. </li></ol></li><li> Aiguiser la tétrode. <ol><li> Avant chaque expérience, couper la pointe de la tétrode avec une lame de scalpel, pas de ciseaux. Ceci permet d&#39;éviter l&#39;écrasement et évasement des extrémités du fil, tout en offrant un bord plat propre pour l&#39;étape suivante. <ol&gt; <li> Utilisez un petit outil rotatif monté verticalement avec un grain moyen et fin disques de ponçage (ceux-ci peuvent être combinés sur une plate-forme) pour polir la tétrode et enlever une certaine isolation de pointe. Tenez le paquet près de son extrémité avec une pince. Inclinez le fil mis fin à un angle de 45 ° par rapport au disque de ponçage et doucement toucher à modéré disque rotatif de vitesse pendant environ 1 ou 2 secondes à chaque sur le support et les beaux grains. Répétez cette trois fois de plus, la rotation axiale du faisceau de 90 ° à chaque fois. Il est essentiel que la direction de rotation des disques de ponçage est une distance à partir de l&#39;angle peu profond des extrémités des fils, autrement séparation des fils peut se produire. </li><li> Le résultat désiré transforme l&#39;extrémité du faisceau à partir d&#39;un bord droit pour une extrémité pointue avec de petites quantités d&#39;isolation retirée de l&#39;extrémité de chaque fil. Vérifier le point à l&#39;aide d&#39;un microscope de dissection avant l&#39;étalement de la tétrode. Si un effilochage se produit à la pointe, recouper et repolir. </li><li> Si le test de l&#39;impédance au cours de la subsequent étape de placage montre extrêmement faibles valeurs inter-fils (moins de 4 MQ), cela indique trop de matière enlevée au cours de l&#39;étape de polissage. Recouper et repolir la tétrode. </li></ol></li><li> Plaque la tétrode. Mettre l&#39;extrémité de la tétrode dans une solution saturée de sulfate de cuivre (85 ml d&#39;eau, 5 ml d&#39;acide sulfurique, 50 g de sulfate de cuivre). Plate chaque fil avec un courant de 2,5 pA avec un isolateur de stimulus. Injecter le courant pendant 1 seconde, une pause de 1 sec et répéter ce processus 4x. </li><li> Vérifier l&#39;impédance de chaque fil et la interimpedance de chaque paire de fils. L&#39;impédance de chaque fil doit être comprise entre 0,5-1 MQ et l&#39;impédance entre doit être supérieure à 4 MQ. </li><li> Monter l&#39;adaptateur sur le headstage d&#39;un système d&#39;enregistrement multivoie. </li><li> Attacher une épingle d&#39;insectes plié à un micromanipulateur. Attachez l&#39;extrémité de la tétrode à la broche insecte avec de la cire dentaire </li></ol></li></ol> 2. Préparation des animaux <ol><li> Anesthésier lablattes avec de la glace. </li><li> Après le cafard cesse de bouger, retenir le cafard verticalement sur une surface de liège plat avec de grandes épingles de selle qui chevauchent l&#39;insecte mais ne pénètrent pas dans n&#39;importe quelle partie de son corps. </li><li> Transférer la préparation dans un récipient en plastique et placer de la glace autour de l&#39;animal afin de minimiser la circulation sanguine et des mouvements du corps. </li><li> Placez un collier en plastique au niveau du col pour soutenir la tête et placer la cire dentaire autour de la tête pour le stabiliser. </li><li> Couper une petite fenêtre entre les ocelles avec une lame de rasoir et enlever la cuticule de la tête. </li><li> Retirer les tissus conjonctifs et de graisse avec une pince pour exposer le cerveau. </li><li> Mettre un peu de solution saline de cafard dans la capsule de la tête pour couvrir le tissu cérébral. </li><li> Pour desheath le cerveau, utiliser une pince fine pour saisir délicatement la gaine sur le dessus du cerveau et utiliser un autre pince fine à déchirer la gaine en dehors de la zone implantée de fil. </li><li> Ouvrez un petit trou dans la tête capsule antérieure à l&#39;esprit du cerveauh une broche insecte. Insérez une tresse de trois grands diamètres (56 um) isolées des fils de cuivre dans le trou pour servir une électrode de référence / sol. </li><li> Abaissez la pointe de la tétrode à la surface du cerveau avec le micromanipulateur et le positionner à proximité de la région du cerveau d&#39;intérêt. </li><li> Placez délicatement deux petits morceaux de feuille d&#39;acétate mince (2 mm x 1 mm), légèrement plus grand que le trou dans la capsule de la tête, antérieure et postérieure à la tétrode. </li><li> Mettre en marche le système d&#39;enregistrement. </li><li> Abaisser lentement la tétrode 150-250 um en dessous de la surface du cerveau en fonction de la qualité de l&#39;enregistrement. </li><li> Éteignez le système d&#39;enregistrement. </li><li> Déplacez les deux morceaux de feuille d&#39;acétate comme proches de la tétrode possible sans le toucher (figure 1A). </li><li> Chauffer une petite spatule ou d&#39;une aiguille hypodermique aplatie et la mettre en cire dentaire telle qu&#39;il y ait de la cire liquide à l&#39;extrémité de la spatule. Toucher délicatement le bout de chaque morceau de feuille d&#39;acétate de latétrode avec la spatule afin que la cire liquide peut s&#39;écouler sur chaque morceau et sceller l&#39;écart entre elle et la cuticule de la tête. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.16. Déposez une petite quantité de cire liquide sur la feuille d&#39;acétate à chaque fois. Lancer le processus loin de la tétrode et évoluer progressivement vers elle. Finalement, la tétrode sera ancré par de la cire dentaire. Évitez tout contact avec la cire chaude dans la cavité et sur le cerveau. </li><li> Utilisez la même méthode que les étapes 2.16 et 2.17 pour ancrer l&#39;électrode de référence / sol avec de la cire. </li><li> Chauffez la cire qui attache la tétrode à la micromanipulateur pour libérer la tétrode de lui. </li><li> Boucle la tétrode dans la cire dentaire sur la tête pour fournir une décharge de traction (figure 1B). </li><li> Couvrir la boucle de décharge de traction avec de la cire dentaire (figure 1C). </li><li> Retirez délicatement les contraintes et transférer la préparation sur une boîte de Pétri. Retenir le côté préparation dorsale avec de grandes épingles de selle. </li><li> Joindreune tige à l&#39;pronotum utilisant un pistolet à colle. Il s&#39;agit d&#39;un bâtonnet de bois qui s&#39;étend depuis le pronotum sur l&#39;abdomen. </li><li> Fixer l&#39;extrémité du tube tétrode à l&#39;extrémité postérieure de la tige avec de la cire dentaire. </li><li> Ancrer la tétrode et l&#39;électrode de référence / sol à l&#39;extrémité antérieure de la tige avec de la cire dentaire. </li><li> Tirer la tétrode de l&#39;extrémité femelle du tuyau, autant que possible, mais ne pas tirer sur elle, afin d&#39;éliminer la possibilité que l&#39;animal risque d&#39;endommager la partie de la tétrode à l&#39;extérieur du tube (Figure 1D). </li><li> Retirez toutes les contraintes. Fixez l&#39;électrode de référence / sol au tube tétrode avec de la cire dentaire. </li><li> Attendez au moins 60 minutes pour l&#39;animal de récupérer de l&#39;anesthésie de la glace avant toute expérience. </li></ol> 3. Procédures expérimentales <ol><li> Connecter un PC à la fois le système d&#39;enregistrement et une lumière LED à l&#39;aide d&#39;un câble USB vers port série. </li><li> Lancer enregistrements de neurones. </li><li>Lancer des enregistrements vidéo à 20 images par seconde pour des expériences marche en utilisant le paquet d&#39;acquisition d&#39;image de Motmot 16 ou 120 images par seconde pour monter des expériences à l&#39;aide d&#39;une caméra à haute vitesse. </li><li> Placez le cafard dans un 40 cm x 40 cm plexiglas arène pour des expériences de marche ou un 58 cm de long, 5 cm de large et 5 cm de haut arène pour grimper expériences. L&#39;arène de marche a une barrière transparente s&#39;étendant à partir du milieu du mur de droite du centre de l&#39;arène, au-dessus duquel la headstage se trouve. La barrière est utilisé pour empêcher les animaux de se promener dans les zones où la vue de la caméra est bloqué par le headstage. L&#39;arène d&#39;escalade a un bloc acrylique (soit 1,2 cm ou 1,8 cm de haut et 5 cm de large) ou sur une étagère située à une hauteur comparable dans le centre. </li><li> Générer une impulsion TTL de l&#39;ordinateur à l&#39;aide d&#39;une commande de MATLAB personnalisée. (S = série (&quot;COM4&quot;); fopen (s); s.RequestToSend = &#39;off&#39; / s.RequestToSend = &#39;on&#39; /; fclose (s); supprimer (s) ;). L&#39;impulsion TTL génère une foistasser pour le système d&#39;enregistrement et soit active ou désactive la lumière LED. </li><li> Autoriser le cafard pour explorer la scène jusqu&#39;à ce qu&#39;il arrête de bouger pendant plus de 30 secondes pour les expériences à pied. Laisser le cafard soit montée sur le bloc / tablette ou un tunnel à travers la plate-forme pour l&#39;escalade expériences. </li><li> Arrêtez enregistrements vidéo. </li><li> Arrêtez enregistrements de neurones. </li><li> Notez l&#39;horodatage généré par l&#39;impulsion TTL. </li><li> Retirez le cafard de l&#39;arène et attendre au moins 3 minutes. </li><li> Répétez les étapes 03.02 à 03.10 pour le prochain procès. </li><li> Une fois tous les enregistrements ont été réalisés, passer 5 sec de courant 5 uA DC par l&#39;un des conseils de fil (anode) et l&#39;électrode de référence (cathode) pour déposer du cuivre dans le cerveau à la pointe du fil. </li></ol> 4. Analyse déconnecté <ol><li> Synchroniser des données vidéo et de neurones en reliant l&#39;image où l&#39;éclairage à LED est allumé et l&#39;estampille temporelle enregistrée par le système d&#39;enregistrement àce moment-là. </li><li> Marquer fil pointe endroits. Utiliser des procédures d&#39;intensification Timms à précipiter et observer le cuivre dans 12 sections um série 17. Dépôts importants doivent être visibles dans 3-8 sections adjacentes (environ 18-48% de la longueur de l&#39;avion ventrale dorsale de la région nous enregistrer à partir de) (figure 2). </li><li> Corrélation des impulsions électriques spécifiques à l&#39;activité de neurones individuels. Suivez pic procédures de tri énoncées en détail ailleurs 10,14,18. Utilisez le programme KlustaKwik (version 1.5, l&#39;auteur K. Harris, de l&#39;Université Rutgers) pour générer initiale, le regroupement automatisé. Les importer dans le programme MClust (version 3.5, les auteurs AD rougeâtre et al., Université du Minnesota) pour plus de raffinement et d&#39;analyse (Figure 3). </li><li> Suivre les mouvements de la blatte. Pour les expériences de marche, extraire la position du (visuel) centre de masse et l&#39;orientation du corps dans chaque image de la vid de la blatteenregistrements eo utilisant le Caltech multiple Fly Tracker (version 0.1.5.6; http://ctrax.sourceforge.net/) et la boîte à outils FixErrors associé pour MATLAB 19. Pour l&#39;escalade expériences, extraire la position du bloc et la tête et pronotum du cafard dans chaque image de la vidéo à l&#39;aide du progiciel d&#39;analyse de mouvement. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêt.

Alors que les études électrophysiologiques antérieures sur la CC ou d&#39;autres régions du cerveau de l&#39;insecte nous ont fourni un aperçu de la commande centrale du comportement, la plupart d&#39;entre eux ont été réalisées soit dans des préparations sobres 9,11 ou les captifs 10,14. En conséquence, l&#39;animal de l&#39;expérience sensorielle et l&#39;état physiologique pourrait être très différents de ceux dans un cadre naturel. En outre, les tâches comportementales que l&#39;animal peut eff...

Cet article décrit un système efficace d&#39;enregistrement des neurones dans le complexe central (CC) du cafard, discoidalis Blaberus, comme l&#39;insecte se promène dans une arène et traite avec des objets qui la font tourner, tunnel sous, ou grimper sur des obstacles. Les fils peuvent également être connectés à un stimulateur pour évoquer l&#39;activité dans le neuropile environnant avec des changements comportementaux qui en découlent. Au cours de la dernière décennie une attention considérable a été réalisé sur les rôles joués par les différentes régions du cerveau à contrôler le comportement des insectes. Une grande partie de ce foyer a été dirigé vers les neuropils cérébrales médianes qui sont collectivement appelés le complexe central (CC). Des progrès ont été réalisés à la suite de grandes variétés de techniques de ciblage des questions sur le rôle du CC dans le comportement. Ces techniques vont de manipulations neurogénétiques, principalement chez la drosophile, couplés avec behavianalyse orale 1-3, à des techniques électrophysiologiques qui surveillent l&#39;activité neuronale dans le CC et tentative de relier cette activité à des paramètres pertinents comportemental. Les techniques électrophysiologiques comprennent l&#39;enregistrement intracellulaire des neurones individuels identifiés 4-9 et enregistrement extracellulaire, souvent avec des sondes multi-canaux 10,11. Ces deux techniques sont complémentaires. Enregistrement intracellulaire avec des électrodes pointus ou patch cellule entière fournit des données très détaillées sur les neurones identifiés, mais se limite à une ou deux cellules à la fois, nécessite un mouvement limité ou non, et peut être maintenue pour des périodes de temps relativement courtes. Enregistrements extracellulaires peuvent être facilement mis en place, ne nécessite pas de retenue, et peuvent être maintenus pendant des heures. Avec tétrodes multicanaux et la coupe de la grappe, assez grandes populations de neurones peuvent être analysés simultanément 9,12. Alors que CPAE de cellules entièresh a été utilisé avec succès chez les insectes captifs 13, nous pensons qu&#39;il ya aussi un besoin de techniques qui nous permettent d&#39;enregistrer l&#39;activité neuronale dans le cerveau pendant de longues périodes de temps en se comporter librement insectes car ils traitent des obstacles au déplacement vers l&#39;avant. La nécessité de constater que les insectes se déplace et rebondit nous a poussé vers des méthodes d&#39;enregistrement extracellulaires. Nous avons eu un bon enregistrement de succès dans les préparations sobres avec des sondes disponibles dans le commerce 16 canaux de silicium 11, mais la petite taille, même de grandes cafards signifie que les sondes doivent être montées hors du corps. Cela, couplé avec la délicatesse des dents de la sonde, les rendait inapproprié pour une préparation de marche libre. Dans deux précédents projets, nous avons utilisé des faisceaux de fils fins formant une tétrode à accomplir propriétés d&#39;enregistrement similaires, mais dans un arrangement plus robuste. Ces faisceaux de tétrode nous a permis d&#39;enregistrer de cafards captifs uneD portent l&#39;activité de l&#39;unité de CC aux changements de vitesse 14 à pied et en tournant le comportement résultant d&#39;un contact antennaire avec une tige 10. Aussi utile que ces préparations captifs ont été et continueront d&#39;être, ils ne présentent certaines limitations. Tout d&#39;abord, les comportements que l&#39;insecte peut effectuer sont limitées à un seul plan. Autrement dit, nous pourrions facilement évoquer les changements de vitesse de marche ou tournant, mais l&#39;escalade et de tunneling actions n&#39;était pas possible, au moins avec l&#39;agencement d&#39;attache typique. Deuxièmement, nos préparations sont captifs &quot;boucle ouverte&quot;. Autrement dit, ils ne permettent pas de mouvements liés à la normale à la rétroaction du système. Ainsi, comme le cafard activée notre attache, son monde visuel n&#39;a pas été modifiée en conséquence. Il est possible de construire des systèmes de boucle d&#39;attache fermés à introduire ce genre de commentaires. Cependant, elles sont limitées par la complexité de la programmation et du matériel de l&#39;environnement visuel simulé. Nevertheless, nous avons pensé que nous pourrions améliorer nos méthodes d&#39;enregistrement captifs existants par l&#39;enregistrement de l&#39;animal car il marchait librement dans une arène ou la piste et objets rencontrés comme il le ferait dans son milieu naturel. Bien que les systèmes sans fil pour l&#39;enregistrement de l&#39;activité cérébrale de 15 serait idéal, les systèmes actuels ont des limites dans le nombre de canaux d&#39;enregistrement, le temps d&#39;acquisition des données, la vie et le poids batterie. Par conséquent, nous avons opté pour essayer d&#39;adapter notre système d&#39;enregistrement captif pour une utilisation dans les préparations se déplacer librement. Comme de meilleurs systèmes sans fil sont disponibles, cette technique peut être aisément adapté à de tels dispositifs. Le système qui est décrit dans cet article est léger, fonctionne très bien et semble avoir peu d&#39;effet néfaste sur le comportement du cafard. Avec une caméra à grande vitesse et peu coûteux logiciel de coupe de la grappe, l&#39;activité dans les neurones du cerveau individuels peut être liée au mouvement. Nous décrivons ici la prépaation des fils tétrode et leur implantation dans le cerveau de l&#39;insecte, ainsi que les techniques d&#39;enregistrement de l&#39;activité électrique et le mouvement et la façon dont ces données peuvent être réunis pour une analyse ultérieure.

<table><tbody><tr><td>Fil nichrome&nbsp ;</td><td>Sandvik Heating Technology</td><td>Kanthal RO-800</td><td>Utilisation pour</td></tr><tr><td>les tubes en polyéthylène biomédicaux</td><td>A-M Systems</td><td>800700</td><td>Utilisation pour les tubes tétrodes</td></tr><tr><td>Lynx-8</td><td>Neuralynx</td><td></td><td>Utilisation pour l’enregistrement multi-unités</td></tr><tr><td>Cheetah 32</td><td>Neuralynx</td><td></td><td>Utilisation pour l’enregistrement multi-unités</td></tr><tr><td>Caméra haute vitesse</td><td>Basler</td><td>A602f</td><td>Utilisation pour l’enregistrement vidéo pour expériences de marche</td></tr><tr><td>Caméra haute vitesse</td><td>Casio</td><td>EX-FC150</td><td>Utilisation pour l’enregistrement vidéo pour les expériences d’escalade</td></tr><tr><td>WINanalyze</td><td></td><td>Winanalyze version 1.4 3D</td><td>Utilisation pour le suivi vidéo&nbsp ;</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>MATLAB R2012b</td><td>Utilisation pour la génération d’impulsions TTL et l’analyse de données hors ligne</td></tr></tbody></table>

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Extracellular Wire Tetrode Recording in Brain of Freely Walking Insects

L&#39;intérêt croissant pour le rôle de l&#39;activité du cerveau dans le contrôle moteur insectes exige que nous soyons en mesure de suivre l&#39;activité neuronale et les insectes effectuent comportement naturel. Nous avons déjà développé une technique d&#39;implantation fils tétrode dans le complexe central de cerveau de cafards qui nous ont permis d&#39;enregistrer l&#39;activité de plusieurs neurones simultanément tout un cafard attaché tourné ou la vitesse de marche altérée. Même si un grand pas en avant, préparations captifs permettent d&#39;accéder à des comportements limités et manquent souvent de processus de rétroaction qui se produisent chez les animaux se déplaçant librement. Nous présentons maintenant une version modifiée de cette technique qui nous permet d&#39;enregistrer à partir du complexe central de se déplacer librement cafards comme ils marchent dans une arène et faire face à des obstacles en tournant, de l&#39;escalade ou de tunnels. Couplé avec la vidéo haute vitesse et la coupe de la grappe, nous pouvons maintenant porter l&#39;activité cérébrale à différents paramètres du mouvement des insectes se comporter librement.

Nous avons enregistré l&#39;activité neuronale de 50 unités de la CC dans 27 préparations pour les expériences de marche. Pour 15 de ces préparations (23 unités), les expériences d&#39;escalade ont également été réalisées. Les unités individuelles sont nommés selon les chiffres de préparation et d&#39;unité (par exemple, l&#39;unité 1-2 indique la préparation 1, unité 2). Instantanés de la vidéo d&#39;un essai d&#39;escalade sont présentés dans la figure 4. L&#39;in...

Nous avons déjà développé une technique d&#39;implantation fils tétrode dans le complexe central de cerveau de cafards qui nous permet de surveiller l&#39;activité en unités individuelles de cafards captifs. Nous présentons ici une version modifiée de cette technique qui nous permet d&#39;enregistrer également l&#39;activité du cerveau en se déplaçant librement insectes.

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Increasing interest in the role of brain activity in insect motor control requires that we be able to monitor neural activity while insects perform ...

L'objectif général de cette procédure est d'enregistrer l'activité neuronale complexe dans le cerveau et de la corréler aux comportements filmés en vidéo d'insectes en déplacement libre. Cette étape est réalisée en premier lieu par la fabrication d'un tétraélectrode flexible à partir d'un fil très fin, en aiguisant, testant et recouvrant l'extrémité du fil ainsi que le matériau servant à marquer sa position et à stabiliser le fil dans un tube en polyéthylène. La deuxième étape consiste à insérer le tétraélectrode dans le cerveau, à le stabiliser à l'aide d'acétate et de cire, puis à fixer une boucle de relaxation de contrainte sur la tête. L'activité neuronale est ensuite enregistrée simultanément à l'enregistrement vidéo du comportement locomoteur. Synchronisez la vidéo avec l'enregistrement à l'aide d'un signal de synchronisation envoyé à une DEL et à l'amplificateur. La dernière étape consiste à déposer du cuivre à l'aide d'un courant électrique continu et à intensifier la coloration selon la méthode de Tims afin de visualiser le site d'enregistrement.En fin de compte, les techniques de tri extracellulaire multi-unités à haute densité permettent d'identifier des unités neuronales, tandis que l'analyse de vidéos enregistrées simultanément des comportements autorise une corrélation fine entre l'activité neuronale et le comportement. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité d'utiliser des procédures existantes pour enregistrer une activité neuronale extracellulaire à haute densité dans le cerveau d'un insecte pendant qu'il effectue un comportement complexe. Elle permet ensuite de déterminer les emplacements cérébraux où se trouvaient les voies Tet, et l'ensemble peut être réalisé à un coût relativement modique.Cette technique peut aider à répondre à des questions clés en neuropathologie en corrélant le moment et l'intensité de l'activité neuronale dans des régions cérébrales spécifiques au comportement d'un animal en déplacement libre. Cette méthode peut fournir des informations sur le contrôle sensorimoteur, mais elle peut également être appliquée à tout comportement nécessitant un insecte en déplacement libre, comme l'orientation ou la navigation. En général, les personnes novices dans ce domaine éprouvent des difficultés, car les électrodes d'enregistrement sont difficiles à préparer, et leur placement et leur stabilisation pour l'enregistrement exigent des techniques microchirurgicales très précises.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. Les procédures de fabrication et d'implantation des Tero sont difficiles à apprendre, car elles sont réalisées avec des matériaux très petits et fragiles, et il faut faire grande attention à ne pas endommager le tissu cérébral. Pour préparer les fils Tet Road, insérez deux fils rom effilés dans un dispositif motorisé de bobinage rotatif.Enroulez le tero dans un sens pendant deux minutes à 60 tours par minute, puis déroulez-le dans le sens opposé pendant 30 secondes. Ensuite, utilisez un pistolet thermique pour souder les fils ensemble, en prenant soin de ne pas toucher les fils avec le pistolet. Effectuez trois passages ascendants et descendants en alternant les directions, chaque passage durant environ 10 secondes.Ensuite, ajoutez un tube de soutien fabriqué à partir d'un morceau de 30 centimètres de longueur de tube en polyéthylène. Faites passer lentement le tétra dans le tube de soutien afin qu'il ne se plie pas. Une fois que l'extrémité soudée apparaît à l'autre bout du tube, tirez-la à travers de sorte qu'il y ait une longueur de fil égale aux deux extrémités du tube guide.Maintenant, saisissez avec la pince l'extrémité libre de chaque fil en utilisant la base de la flamme d'un bec Bunsen. Brûlez soigneusement l'isolation des deux ou trois derniers millimètres de chaque fil. Chauffez le fil jusqu'à ce qu'il rougisse, sans qu'il ne s'enroule.Ensuite, utilisez une pince pour relier le tero à un adaptateur femelle mâle IC qui convient au dispositif d'enregistrement. Insérez l'extrémité dénudée de chaque fil dans une douille différente de l'adaptateur. Ajoutez une broche en laiton pour aider à maintenir les fils en place.Ensuite, utilisez un fer à souder fin pour remplir le support avec le métal d'apport fondu. Vérifiez ensuite les connexions électriques à l’aide d’un impédancemètre, comme décrit dans le protocole accompagnant le texte. À l’aide d’un adaptateur inutilisé séparé, formez un moule en papier avec des trous à la base.Pour les broches mâles, transférez l'adaptateur de travail dans la boîte avec le côté mâle vers le bas et les broches dépassant de la boîte. Après avoir scotché la boîte comme décrit dans le protocole écrit, mélangez rapidement. Préparez la résine époxy bi-composant et versez-la dans la boîte.Pour fixer l'adaptateur et tous les fils, attachez l'extrémité proche du tube guide à un côté de la boîte à l'aide de cire dentaire, tout en laissant le tube ouvert afin que l'extrémité du fil puisse être tirée librement aux deux extrémités. Une fois que l'époxyde est durci et que l'ensemble de l'attache est sec, la prochaine étape consiste à aiguiser l'extrémité du fil. Commencez par couper la pointe de l'extrémité du fil avec une lame de scalpel bien aiguisée.Ensuite, polissez le tero à l’aide d’un petit outil rotatif monté verticalement, équipé de disques abrasifs à grain moyen puis fin. Réglez l’outil rotatif sur une vitesse modérée et tenez le faisceau près de son extrémité. À l’aide de pinces, inclinez l’extrémité du jeu de fils à un angle de 45 degrés par rapport au disque abrasif.Il est essentiel que le sens de rotation des disques de ponçage s'éloigne de l'angle faible des extrémités des fils. Sinon, une séparation des fils peut survenir. Effleurer doucement le faisceau avec le disque de ponçage à grain moyen pendant une à deux secondes, puis toucher le disque de ponçage à grain fin pendant une à deux secondes supplémentaires.Répétez cette opération trois fois supplémentaires, en effectuant une rotation axiale du faisceau de 90 degrés à chaque fois. Une fois terminé, utilisez un microscope stéréoscopique pour vérifier que l'extrémité du faisceau présente une pointe effilée avec de petites quantités d'isolation retirées de l'extrémité de chaque fil, et qu'il n'y a pas d'effilochage, après avoir revérifié les impédances, tant entre les fils individuels qu'entre chaque fil et la plaque de masse.Le tero en plongeant sa pointe dans une solution saturée de sulfate de cuivre. Plaquez le premier fil avec un courant de 2,5 microampères. À l’aide d’un isolateur de stimulus, injectez le courant pendant une seconde. Faites une pause d’une seconde et répétez ce processus trois fois.Ensuite, placer les trois fils restants de la même manière. Vérifier à nouveau l'impédance. Monter l'adaptateur sur l'étage de tête d'un système d'enregistrement multicanal.Fixer une épingle à insecte courbée à un micromanipulateur et attacher l'extrémité du fil tero à l'épingle à insecte avec de la cire dentaire après avoir anesthésié et immobilisé un blattes comme décrit dans le protocole du texte. Utiliser une lame de rasoir pour découper une petite fenêtre entre l'œil de la cellule O après avoir enlevé la cuticule. Utiliser une pince pour retirer les tissus conjonctifs et la graisse afin d'exposer le cerveau. Ensuite, placer du liquide physiologique pour blattes dans la capsule céphalique pour recouvrir le tissu cérébral et dégainer le cerveau.Utilisez une pince fine pour saisir délicatement la gaine située au-dessus du cerveau et une autre pince fine pour déchirer la gaine dans la zone où le fil est implanté. Ensuite, utilisez une épingle à insecte pour ouvrir un petit trou dans la capsule céphalique, en avant du cerveau. Insérez une tresse composée de 3 fils de cuivre isolés de 56 microns de diamètre dans l'orifice.Pour servir d'électrode de référence, abaissez la pointe du tétraélectrode à la surface du cerveau à l'aide du micromanipulateur et positionnez-la près du cerveau. Région d'intérêt. Placez soigneusement deux petits morceaux de feuille d'acétate fine de deux sur un millimètre, légèrement plus grands que le trou dans la capsule crânienne, à l'avant et à l'arrière du tétraélectrode.Abaissez lentement le tétraélectrode de 150 à 250 microns sous la surface du cerveau tout en surveillant la qualité de l'enregistrement. Recherchez des pics extracellulaires spontanés de taille modérée à grande, signes d'une zone d'intérêt et de la viabilité générale du tissu nerveux. Une fois la position du tétraélectrode jugée satisfaisante, rapprochez les deux morceaux de feuille d'acétate aussi près que possible du tétraélectrode sans le toucher.Il est très important de faire preuve d'une extrême prudence pendant la dissection et l'implantation afin de ne pas endommager les fils. À l'aide d'une petite spatule fabriquée en aplatissant l'extrémité d'une aiguille hypodermique, chauffez la spatule avec un bec à alcool. Plongez ensuite la spatule dans de la cire dentaire de manière à obtenir de la cire liquide à son extrémité.Toucher délicatement la cire liquide à une extrémité de la feuille d'acétate située le plus éloignée du tarse, permettant à la cire liquide de sceller l'espace entre la feuille d'acétate et la cuticule de la tête. Continuer à réchauffer le spatule et à déposer une petite quantité de cire liquide sur la feuille d'acétate. Progresser graduellement vers le tarse et finalement fixer celui-ci avec une petite quantité de cire dentaire.Évitez de faire pénétrer de la cire chaude dans la cavité et sur le cerveau. Ensuite, fixez l'électrode de référence avec de la cire de la même manière. Chauffez maintenant la cire qui fixe le tero au manipulateur micrométrique pour détacher le tero de celui-ci.Ensuite, faire une boucle avec le tero dans la cire au niveau de la tête pour assurer une protection contre les contraintes mécaniques, puis recouvrir la boucle de protection avec de la cire. À ce stade, retirer soigneusement les contraintes et transférer la préparation dans une boîte de Pétri posée sur de la glace. Immobiliser la préparation avec le côté dorsal vers le haut à l’aide d’épingles en forme de selle de grande taille. À l’aide d’un pistolet à colle, fixer un bâtonnet en bois de manière qu’il s’étende du pro noûm au-dessus de l’abdomen.Ensuite, fixez l'extrémité du tube tero à l'extrémité postérieure de la tige à l'aide de cire dentaire. Fixez ensuite le tero et l'électrode de référence à l'extrémité antérieure de la tige avec de la cire dentaire. Tirez ensuite le tero depuis l'extrémité du logement du tube aussi fort que possible, mais sans tirer brusquement dessus.Fixez-le à l'adaptateur avec de la cire afin d'éliminer tout risque que l'animal endommage la partie exposée du tero. Après avoir retiré toutes les contraintes, fixez l'électrode de référence au tube du tero à l'aide de cire dentaire. Établissez de bons enregistrements neuronaux et vidéo, comme indiqué dans le protocole écrit, avant de commencer les expériences comportementales ; pour les expériences de marche, laissez le cafard explorer une arène en plexiglas ; pour les expériences d'escalade.Utilisez une arène longue et étroite avec soit une tablette comme obstacle que l'animal doit escalader ou franchir par-dessous, soit un bloc en plexiglas que l'animal doit grimper. Lors de l'enregistrement, générez une impulsion TTL à partir de l'ordinateur à l'aide d'une commande MATLAB personnalisée. L'impulsion TTL crée un horodatage pour le système d'enregistrement et allume ou éteint la lumière LED pour les essais de stimulation.Des trains d'impulsions de courant entre les fils d'enregistrement peuvent être utilisés pour provoquer un comportement une fois que l'expérience a été menée pendant plus de cinq secondes avec un courant continu de cinq microampères, passant par l'une des pointes de fil et l'électrode de référence afin de déposer du cuivre dans le cerveau. Pour marquer l'emplacement de la pointe du fil, des tracés bruts de tension provenant de microélectrodes individuelles au sein d'un même faisceau de fils sont présentés ici. Remarquez les différences entre les tracés de tension obtenus avec différentes électrodes.Trois unités ont été triées à l'aide des MLU. Une vue tridimensionnelle de l'énergie du signal tel qu'enregistré sur trois des quatre électrodes est représentée ici. Chaque événement seuil est codé par une couleur correspondant au groupe auquel il a finalement été attribué.Cette image est extraite d'une vidéo d'un essai de grimpe ; au-dessus de chaque image, on observe la vitesse normalisée, la hauteur du cafard et la fréquence de décharge instantanée de deux unités triées, depuis la première image jusqu'à l'image courante. Le temps zéro indique le début de la phase de grimpe. La fréquence de décharge a été normalisée de zéro à un, tandis que la vitesse et la hauteur ont été normalisées de zéro à 0,5 à des fins de visualisation. Les marques situées sous chaque image indiquent les pics électriques des deux unités triées sur une durée d'une seconde centrée sur l'image courante. La ligne orange indique la période couverte par chaque image, et le rectangle bleu indique deux fois la largeur du noyau utilisé pour calculer la fréquence de décharge instantanée de l'image courante.Cet enregistrement a été réalisé dans le corps en éventail droit. La fréquence de décharge de l'unité un un a augmenté pendant l'ascension, et l'augmentation de la fréquence de décharge a précédé l'augmentation de la vitesse. L'unité un deux était silencieuse avant l'ascension, mais a commencé à se déclencher après le début de l'ascension.Dans cet instantané provenant de l'essai d'exploration de l'arène, la ligne ovale rouge indique la forme du cafard sur cette image, et la ligne rouge en pointillés indique la position du centre de masse du cafard lors des 10 images précédentes. Les vitesses de virage et de marche vers l'avant, ainsi que la fréquence de décharge instantanée de l'unité deux un, sont affichées ici. Les pics de l'unité deux un, enregistrés au cours des quatre secondes précédant l'image actuelle, sont représentés sous l'image.Comme précédemment, la ligne orange indique la durée couverte par chaque image, et le rectangle bleu indique deux fois la largeur du noyau utilisé pour calculer la fréquence de décharge instantanée de l'image courante. Cet enregistrement a été réalisé au milieu du lobe du corps. La position du cafard et l'orientation de son corps dans chaque image ont été extraites à l'aide d'un logiciel de suivi, comme décrit dans le protocole textuel, et utilisées pour calculer la vitesse d'avancement et la vitesse de direction, ainsi que la fréquence de décharge instantanée.La fréquence de décharge de l'unité deux un a augmenté lorsque la blatte a commencé à marcher et était corrélée à la vitesse de marche. Pour de nombreuses unités du complexe central, l'augmentation de la fréquence de décharge était limitée à des états spécifiques de locomotion. Par exemple, l'unité deux, un était ajustée à la marche en avant, indépendamment de la vitesse de virage.La trajectoire du cafard extraite de la vidéo est affichée ici. Le gros point noir indique le point de départ du cafard, et chaque petit point noir indique la position du cafard dans chaque image. La trajectoire a été codée en couleurs pour montrer la fréquence de décharge instantanée de l'unité deux, allant du bleu pour indiquer une faible fréquence de décharge au rouge pour indiquer une forte fréquence de décharge.Dans cette carte de fréquence de décharge de l'unité deux un, l'axe des X représente la vitesse de rotation, et l'axe des Y représente la vitesse de marche vers l'avant. Une vitesse de rotation positive indique un virage à droite, tandis qu'une vitesse de rotation négative indique un virage à gauche. La position de l'électrode est déterminée par les dépôts de cuivre visibles après la procédure histologique, comme décrit dans le texte.Alternativement, l'électrode peut être recouverte d'un colorant fluorescent et localisée par microscopie confocale. Cet ensemble de techniques complexe nécessite, même lorsqu'il est maîtrisé, un temps total de plusieurs heures ; il est préférable de diviser les étapes en sous-ensembles, de fabriquer et de tester plusieurs teros, avant de commencer une expérience d'implantation.Il est important de se souvenir de prétester un TERO afin de vérifier l'impédance correcte entre fils et individuelle, et de faire preuve d'une extrême prudence lors de l'implantation et de la fixation des seuils dans le cerveau. Des méthodes telles que le suivi automatisé en temps réel peuvent être intégrées afin de simplifier la procédure d'analyse. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de fabriquer et d'implanter des TERO afin de coordonner l'activité physiologique avec les comportements complexes d'un insecte en mouvement libre.

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