Lignine régulation à la baisse de Zea mays Via dsRNAi et Klason lignine analyse

L’objectif global de cette procédure est de réguler à la baisse la teneur en lignine dans le labyrinthe via l’ARNi afin de faciliter la production de biomasse digestible pour la production de bioéthanol et de mesurer la teneur en lignine à l’aide du protocole de mesure de la lignine de Clayson. Ceci est accompli en construisant d’abord le labyrinthe CCR un plasmide ARNi pour réguler à la baisse le gène lié à la biosynthèse de la lignine syn oil COA réductase. Ensuite, deux embryons de maïs sont transformés avec la construction ZM CCR un ARNi en utilisant un bombardement de particules et des lignées transgéniques homozygotes sont générées.

Ensuite, les changements phénotypiques sont observés au moyen d’un test histologique et d’une microscopie électronique à balayage effectuée sur la première, la deuxième et la troisième génération du labyrinthe transgénique. Enfin, la lignine insoluble dans l’acide ou clason des lignes du labyrinthe transgénique est mesurée et comparée à la teneur en lignine dans les plantes non transgéniques du labyrinthe. En fin de compte, des résultats sont obtenus qui montrent une réduction de 10 % de la lignine dans les plantes du labyrinthe transgénique CCR par rapport aux plantes de type sauvage en utilisant le bombardement de particules et comme déterminé par la mesure de la lignine de Clayson. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car certaines des étapes sont difficiles à apprendre et ces étapes difficiles à apprendre comprennent la préparation du maïs Embry, Cali sous condition stérile revêtement de réservoirs sur particule avec ADN plasmidique et bombardement de particules du Cali, Dr.Hossein Aladin, et Dr.Gli Brew Han et premier cycle.

Donald ferait la démonstration de cette recherche en montrant les procédures à travers le bombardement de particules. Les implications de la technique de mesure de la lignine clayson pour la production de bioéthanol sont qu’elle fournit non seulement des informations sur les quantités de lignine clayson dans différents matériaux de lignano cellose, mais donne également un aperçu de la résistance de la biomasse de lano cellose aux enzymes de cellulite pendant le prétraitement. Pour préparer les particules de tungstène, commencez par placer 60 milligrammes de billes de tungstène dans un tube de 1,5 millilitre.

Lavez-les en ajoutant un millilitre d’éthanol à 70 % et en faisant un vortex pendant deux minutes. Ensuite, incubez à 23 degrés Celsius pendant 10 minutes et centrifugez à 18 894 fois G pendant deux minutes avant de jeter le surnageant. Utilisez un millilitre d’éthanol à 100 % pour laver les perles trois fois.

Ajoutez ensuite un millilitre de glycérol stérile à 50 % pour porter la concentration de microparticules à 60 milligrammes par millilitre. Pour préparer l’ADN au bombardement, placez 50 microlitres de billes de tungstène dans du glycérol dans un tube de 1,5 millilitre et ajoutez le vortex suivant entre chaque édition. Un microgramme d’ADN plasmidique IV 1.1 ZM CCR un ARNi, préparé selon le protocole de texte.

50 microlitres de chlorure de calcium de 2,5 molaires et 20 microlitres de spermatozoïdes de 0,1 molaire. Après un dernier vortex, centrifugez le mélange à 18 894 fois G pendant 30 secondes. Ensuite, versez le surnageant et utilisez 140 microlitres d’éthanol à 70 % pour laver les granulés deux fois après avoir jeté le lavage final, ajoutez 48 microlitres d’éthanol à 100 % aux billes et utilisez-les immédiatement ou stockez-les sur de la glace jusqu’à quatre heures avant le bombardement, au moins quatre heures avant le bombardement.

Placez un labyrinthe génique de deux embryons de trois à cinq centimètres de haut au milieu d’une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant du milieu N six OSM. Préparez le dispositif d’administration de particules d’hélium PSD 1000 selon les instructions du fabricant et utilisez de l’éthanol à 70 % pour stériliser la paroi de la chambre. Ensuite, chargez un disque de rupture stérile de 650 PSI dans le capuchon de retenue stérile.

Ensuite, étalez cinq à six microlitres de la solution d’ADN M 10 sur la surface d’un macro-support et séchez brièvement. Avant de charger le macro-porteur et l’écran d’arrêt dans l’ensemble de lancement du micro-porteur, placez l’ensemble de lancement du micro-porteur et les calli labyrinthe dans la chambre à une distance sélectionnée de l’écran d’arrêt et fermez la porte. Accélérez dans un vide de 27 PSI contre l’écran en treillis métallique.

Appuyez sur le bouton de tir jusqu’à ce que le disque de rupture éclate et que la pression d’hélium tombe à zéro sur le manomètre. Relâchez ensuite le bouton de tir. Transférez les calli bombardés dans une boîte de Pétri contenant N six OSM et incubez pendant 16 heures dans l’obscurité à 27 degrés Celsius.

Ensuite, cassez les Calli en environ 10 morceaux et transférez-les dans du N six E ou un milieu d’induction calleux dans des boîtes de Pétri et incubez pendant cinq jours dans l’obscurité à 27 degrés Celsius. Après environ huit à dix semaines, les secteurs blancs à croissance rapide se développeront à partir de la non-prolifération et de la nécrose partielle. L’œil de la mère C excise les tissus blancs à croissance rapide et les transfère dans un milieu de sélection frais, en continuant à les incuber, transfère le Cali embryonnaire blanc et à croissance rapide sur un milieu de régénération et incube dans l’obscurité à 27 degrés Celsius pendant une semaine avant de passer à une période de 16 heures de lumière du jour et huit heures d’obscurité à 25 à 27 degrés Celsius.

Après trois à quatre semaines, transférez les pousses régénérantes sur le milieu d’enracinement dans un tube de tente en verre et continuez à incuber dans un cycle d’obscurité légère Après l’apparition d’un développement racinaire important, utilisez de l’eau du robinet pour laver soigneusement les racines. Transplantez ensuite les plantules dans des pots de quatre pouces avec de la terre. Couvrez les pots avec des sacs en plastique pour garder les plantes humides.

Après deux jours, faites de petits trous dans les sacs en plastique. Ensuite, après cinq à six jours, retirez les sacs en plastique. Continuez à incuber pendant encore cinq à six jours.

Transférez les plants dans des pots de 18 pouces avec de la terre et maintenez-les en plein soleil d’été ou à la lumière de la serre. Les premières plantes régénérées sont appelées T zéro tandis que les premières graines appartiennent à la génération T un. Pour prendre des mesures de lignine d’argile, broyez les échantillons à travers un tamis de deux millimètres.

Ensuite, à l’aide d’un dessiccateur, déterminez la teneur en humidité de chaque échantillon et enregistrez la valeur. Pesez environ 1,5 gramme de chaque échantillon et enregistrez le poids à l’aide d’un extracteur de solvant automatisé. Utilisez de l’eau pour extraire les échantillons.

Utilisez ensuite de l’éthanol pour les extraire une seconde fois. Séchez les échantillons extraits à 45 degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, laissez-les refroidir dans la dessiccation avant de les peser à nouveau.

Ensuite, mesurez 0,3 gramme de chaque échantillon extrait à sec dans trois tubes haute pression à vis et enregistrez les poids au 10e de milligramme près. Ajoutez ensuite trois millilitres d’acide sulfurique à 72 % dans chaque tube de force. Utilisez des tiges d’agitation en verre ou en téflon pour mélanger les échantillons et laissez les tiges d’agitation dans les tubes.

Incuber les flacons à 30 degrés Celsius pendant 60 minutes à 150 tr/min. Ajoutez ensuite 84 millilitres d’eau déminéralisée pour diluer la concentration d’acide à 4 % en mélangeant avec le bâtonnet. Veillez à ne pas laisser de grandes quantités d’échantillon sur les côtés du flacon au-dessus de la ligne de flottaison.

Après avoir bien fermé les bouchons de tous les flacons, placez-les dans une grille métallique ou de grands béchers et autoclavez-les à 121 degrés Celsius. À l’aide d’un cycle de stérilisation liquide pendant une heure, laissez-les refroidir à température ambiante avant de les ouvrir. Pré-cendrez les creusets filtrants dans un four à 575 degrés Celsius pendant au moins quatre heures.

Laissez ensuite les creusets refroidir dans un creuset pendant au moins une heure à l’aide d’un adaptateur en caoutchouc pour fixer chaque vide de creuset, filtrez la solution de chaque tube à travers un creuset séparé. Utilisez de l’eau déminéralisée pour rincer les particules de chaque tube. Faites sécher le résidu de lignine à 105 degrés Celsius pendant au moins quatre heures avant d’enregistrer le poids du creuset sec et du résidu.

À l’aide d’un four à 575 degrés Celsius. Pré-cuire les échantillons sur un bec Bunsen jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de fumée ou de cendres visibles avant de les placer dans le four pendant 24 heures. Retirez les creusets du four et laissez-les refroidir dans le dessiccateur.

Enfin, calculez le résidu insoluble dans l’acide à l’aide de l’équation suivante où M pre est égal à la masse de la biomasse extraite avant ex. M flacon est égal à la masse de la biomasse extraite ajoutée au flacon M résidu est égal à la masse du creuset et du résidu de lignine. M cendres est égal à la masse du creuset et cendres et mc sont égaux à la teneur en humidité de la biomasse pré-ex-ex.

La réduction de la teneur en lignine dans le labyrinthe via la transformation par bombardement de particules d’ARNi DS a donné un silençage génique d’environ 30 % de zm CCR un a été observé de manière cohérente dans T zéro à T deux générations par rapport aux plantes témoins. Les transgéniques ont poussé de la même manière, à l’exception d’une coloration brune dans la feuille, l’enveloppe de la côte médiane et la tige, comme indiqué ici. L’analyse histologique a révélé que les lignes mutantes présentent une réduction significative de l’épaisseur de la paroi cellulaire des fibres de la scléle enma.

Cependant, le flux vasculaire du xylème et les cellules de la gaine semblaient similaires à ceux des plantes de type sauvage, ce qui suggère qu’il n’y a pas d’effets néfastes sur le transport de l’eau, le transfert de nutriments ou la force mécanique des tiges dans les lignées mutantes. Cette figure montre la quantité de lignine clason insoluble dans l’acide dans le labyrinthe de type sauvage et les lignées transgéniques zm CCR one RNAi. Trois lignées transgéniques ont montré une réduction statistiquement significative de la lignine par rapport aux plantes de type sauvage pour déterminer si le flux de carbone a été déplacé de la voie de biosynthèse de la lignine vers les voies de biosynthèse des glucides de la paroi cellulaire.

La cellulose a été analysée par la méthode des graphes, comme le montre ce graphique. Deux lignées mutantes zm CCR one RNAi contenaient des niveaux significativement accrus de cellulose cristalline. L’analyse de la teneur en hémicellulose n’a cependant révélé aucun changement dans les lignées mutantes après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la visualisation visuelle transgénique des plantes. Cette technique fournira des orientations aux chercheurs qui doivent introduire un gène d’intérêt à des fréquences de transformation élevées. De plus, la technologie de bombardement de particules que nous utilisons pourrait également être appliquée au transfert de gènes vers d’autres monocotylédones telles que le blé, le riz, le sorgho et d’autres plantes même dichots.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer la lignine d’argile à partir de biomatériaux li, sans cellulose. Il est important de mentionner que travailler avec de l’acide sulfurique à 72 % peut être extrêmement dangereux, de sorte que tout le personnel manipulant le produit chimique doit être très prudent et conserver les produits chimiques et les enceintes de sécurité et travailler avec eux uniquement sous une hotte.