Quantification du cancer du sein cellulaire envahissement aide d'un (3D) du modèle en trois dimensions

L’objectif global de la procédure suivante est d’évaluer la capacité invasive des cellules cancéreuses à l’aide d’un test d’invasion tridimensionnel. Ceci est accompli en cultivant d’abord des cellules cancéreuses dans une matrice de membrane basale. L’invasion cellulaire de la matrice est ensuite observée pendant cinq jours ou plus par microscopie optique.

Dans la dernière étape, les cellules sont marquées avec des anticorps fluorescents pour la localisation des protéines d’intérêt. En fin de compte, le taux d’invasion des cellules cancéreuses et les changements qui en résultent dans l’expression des protéines peuvent être analysés par microscopie immunofluorescente. Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques existantes telles que le test d’invasion de la chambre Transwell, est que le test d’invasion de gel majeur en 3D imite mieux l’environnement in vivo que le cancer résout en croissance.

L’implication de cette technique est vers le traitement du cancer, où de nouvelles protéines peuvent être identifiées dans l’étude, qui sont impliquées dans l’invasion du cancer et les métastases. Avant de commencer la procédure de culture, placez la matrice de la membrane basale à l’aide d’une pipette P 200 et les pointes de la pipette sur de la glace pendant une nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, utilisez la pointe de la pipette glacée de 200 microlitres pour étaler 50 microlitres de la matrice en spirale sur le fond d’un plat confocal à fond de verre numéro un.

Ensuite, placez la parabole dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins 30 minutes pendant que la matrice subit une solidification des yeux de trypsine, une plaque de cellules de 100 millimètres de 70 à 80 % de confluents une fois que les cellules ont commencé à se détacher. Inactivez la trypsine avec 10 millilitres de milieu, puis transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez les cellules pendant trois minutes à 100 G et quatre degrés Celsius pendant qu’elles tournent.

Aliquote 50 microlitres de matrice dans un microtube à centrifuger d’un millilitre par plat de matrice à membrane basale, et placez les tubes sur de la glace lorsque les cellules ont fini de tourner. Aspirer le surnageant sans perturber la pastille, puis réanimer. Mettez les cellules en suspension dans un millilitre de milieu et comptez-les ensuite.

Transférez 2,5 fois 10 à la quatrième cellule dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse, en complétant la suspension cellulaire avec un fluide jusqu’à un volume final de 50 microlitres. Ajoutez ensuite les 50 microlitres de matrice de membrane basale glacée dans les cellules dans un rapport de un pour un pour un volume final de 100 microlitres. Plaquez délicatement le mélange matrice-cellule sur la matrice de membrane basale solidifiée et laissez les cellules s’incruster dans la matrice dans l’incubateur de culture cellulaire.

Après 30 minutes, couvrez la matrice avec deux millilitres de milieu et remettez la parabole dans l’incubateur, en changeant le milieu tous les jours pendant la durée de l’expérience, utilisez l’objectif 10 x d’un microscope optique une fois par jour pendant la durée de l’expérience pour prendre 20 interférences différentielles. Images contrastées des colonies suspendues dans la matrice de la membrane basale. Analysez les images à l’aveugle pour déterminer la formation des étoiles de la colonie cellulaire.

Une colonie est considérée comme étoilée si une ou plusieurs projections du stéroïde de cellules sont observées. Pour examiner les caractéristiques morphogéniques des colonies 3D, retirez les cellules de l’incubateur et placez-les sur un plateau de glace. Aspirez le milieu puis lavez la colonie trois fois avec deux millilitres de PBS froid.

Après le dernier lavage, fixez les cellules dans deux millilitres de solution de 20 % d’acétone, 80 % de méthanol pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, puis ramenez la vaisselle à température ambiante. Une fois que la matrice de la membrane basale est à température ambiante, aspirez le fixateur et lavez la plaque trois fois avec du PBS comme nous venons de le démontrer. Après le lavage final, bloquez toute liaison non spécifique sur les cellules avec deux millilitres de BSA à 3 % pendant au moins 30 minutes à température ambiante.

Incuber ensuite les cellules dans les anticorps primaires d’intérêt dilués dans 3 % BSA à température ambiante. Au bout d’une heure, retirer la solution d’anticorps primaires après avoir éliminé trois fois l’anticorps primaire non lié avec du PBS, ajouter l’anticorps secondaire dissous dans 3 % de BSA à la dilution appropriée et incuber les cellules pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Après avoir éliminé l’anticorps secondaire non lié avec du PBS, colorez les noyaux des cellules dans deux millilitres de hext 3, 3, 2, 5 8 dans le PBS pendant cinq minutes dans l’obscurité.

Ensuite, lavez cinq fois le hext non lié des cellules avec du PBS. Après le cinquième lavage, ajoutez le support de montage directement sur le mélange de matrice à cellule et couvrez soigneusement le support de montage avec une lamelle de verre pour éviter toute perturbation de l’intégrité de la matrice de la membrane basale du mélange de cellules et de cellules. Faites sécher la parabole pendant une nuit à température ambiante, puis acquérez des images avec un microscope fluorescent aux longueurs d’onde laser appropriées pour les anticorps utilisés dans ces images.

MDA MB 2 3 1 cellules envahissant une matrice 3D sont illustrées. Les cellules se sont intégrées dans la matrice le premier jour et ont commencé à former des structures stellaires envahissantes le troisième jour. Au cinquième jour, une invasion complète de la matrice a pu être observée.

Le nombre de colonies étoilées formées a ensuite été compté et exprimé en pourcentage du nombre total de colonies envahissantes et non envahissantes par boîte. De plus, comme les mesures ont été effectuées quotidiennement pendant cinq jours, le taux d’invasion a également pu être évalué dans ces images immunofluorescentes. Des colonies stellaires invasives représentatives de cellules MDA MB 2 3 1 présentant une perte d’intégrité membranaire et une localisation diffuse de la protéine de la membrane basale laminine cinq sont montrées en contraste frappant avec ce qui est observé dans les cellules cancéreuses du sein MDA MB 2 31.

La laminine cinq a été localisée dans une couche de membrane basale intacte renfermant la mémoire asinine des cellules MCF 10 A non traitées non traitées. À la suite de cette procédure, une co-culture avec des cellules stromales peut être réalisée pour répondre à des questions supplémentaires telles que l’interaction entre les cellules cancéreuses et les cellules stromales dans le microenvironnement après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’oncologie pour explorer l’invasion et la migration du cancer, deux éléments nécessaires à la propagation métastatique des cellules cancéreuses.