Un test pour ligne latérale de régénération à l'âge adulte de poisson zèbre

L’objectif global de cette procédure est de développer un test quantitatif de régénération de la ligne latérale qui peut être appliqué à un modèle de maladie du poisson-zèbre adulte. Ceci est accompli en ablant d’abord la ligne latérale des poissons zèbres adultes en les traitant pendant 24 heures avec de la gentamycine. Ensuite, la gentamycine est lavée et les poissons sont autorisés à régénérer leurs mâts neuronaux pendant diverses périodes dans l’eau douce.

Les poissons sont ensuite colorés avec un colorant vital pour visualiser la récupération de la ligne latérale à des points temporels désignés. Pour confirmer que le médicament était efficace pour ablater les mâts neuronaux, certains poissons doivent être colorés immédiatement après le lavage de la gentamycine. Ensuite, les mâts neurologiques des lignes latérales sur les poissons ou les préparations cutanées sont comptés à l’aide d’images obtenues au microscope fluorescent ou confocal.

Enfin, les groupes expérimentaux sont comparés quantitativement au groupe témoin à l’aide d’une courbe standard de neuromaste régénératif. En fin de compte, la microscopie fluorescente et confocale est utilisée pour surveiller la régénération de la ligne latérale dans les modèles de maladie du poisson-zèbre adulte. Nous avons développé cette technique pour fournir un test quantitatif pour l’examen de la régénération neuronale dans des modèles de maladie du poisson-zèbre adulte Pour induire la nécrose des cellules ciliées commencer par ajouter une solution de 50 milligrammes par millilitre de sulfate de gentamycine dans l’eau de poisson à une concentration finale de 0,004 %En utilisant un récipient suffisamment grand pour abriter des poissons zèbres âgés de quatre à six mois sans aération, remplissez-le de solution de gentamycine.

Placez les poissons à l’intérieur et incubez-les à 28 degrés Celsius pendant 24 heures. Préparez un aquarium d’eau de poisson normale pour laver la gentamycine. Après avoir lavé la gentamycine, placez le poisson dans de l’eau de poisson normale et remettez-le dans l’incubateur à 28 degrés Celsius pendant huit à 16 heures à partir d’une solution mère de travail de 15 milligrammes par millilitre du colorant vital fluorescent.

Quatre quatre dioxinostyro dathyl et iodure de méthylpéridium ou quatre colorants deux A.Préparez une concentration de 0,08 % dans l’eau de poisson Après le temps de récupération désigné du traitement à la gentamycine, placez chaque poisson dans le puits d’une plaque de culture à six puits contenant le colorant vital. Couvrez les plaques et placez-les dans un tiroir de paillasse à l’aide du microscope fluorescent pour l’examen des mâts neurologiques colorés. Éteignez les lumières pour éviter l’extinction du colorant vital et incubez-les pendant une heure à l’heure choisie, après le lavage de la gentamycine.

Anesthésiez chaque poisson en le plaçant dans de l’eau anesthésique et attendez que son mouvement de nage cesse environ une à deux minutes. Ensuite, épongez chaque poisson sur une serviette en papier et placez-les sur un morceau de papier filtre humide centré sur le couvercle d’une boîte de Pétri en plastique. Placez ensuite le couvercle sur la platine d’un stéréomicroscope fluorescent et utilisez un grossissement de deux x pour capturer des images pour une analyse quantitative Pour déterminer le degré de régénération, comptez le nombre de masques neurologiques visibles dans les quatre points de suture désignés sur la face inférieure la plus ventrale du poisson, juste à proximité de la nageoire pectorale droite.

Utilisez le test T ou l’ANOVA de l’élève pour l’analyse statistique et répétez toutes les expériences trois fois avec un minimum de cinq poissons par expérience. Si l’analyse quantitative au niveau de la mastome neurologique n’est pas significative, l’analyse au niveau de la cellule ciliée individuelle peut également être utilisée pour obtenir un degré de résolution plus élevé. Après avoir taché et lavé le poisson, utilisez une dilution de un à 500 de deux phénoxyéthanol pour les euthanasier sous une lumière tamisée.

Faites une incision sur le ventre et faites deux incisions verticales de chaque côté des deux premières incisions. Ensuite, faites un rabat de peau carré en faisant une incision le long des côtes supérieures du poisson jusqu’à ce qu’il soit aligné avec les nageoires anales. Placez l’échantillon de peau sur une lame de verre, placez des aros sur le dessus, puis placez une lamelle circulaire en verre dessus pour aider à ancrer et à aplatir le tissu.

Pour l’imagerie numérique ultérieure. Utilisez un objectif 60x pour prendre des images numériques des cellules ciliées dans chaque mât neuronal des points de suture au milieu du corps. Comptez ensuite les cellules ciliées dans les masques neurologiques individuels pour une analyse comparative et quantitative des groupes de contrôle et expérimentaux.

Comme on le voit ici, la tête du poisson zèbre a un nombre significativement plus élevé de mâts neurologiques par rapport à la section médiane ou à la queue, la région de la queue ayant le moins de masques neurologiques, comme le montre ce panneau. Parce que le motif des points de suture dans la tête est compliqué et significativement plus important dans le nombre de masques neurologiques, il ne s’est pas prêté à une région pour l’analyse quantitative. De plus, quelle que soit la concentration de gentamycine testée, l’ablation complète des masques neurologiques dans toute la tête était rarement réalisable, laissant des taches de masques neurologiques observées après le traitement à la gentamycine, comme indiqué précédemment.

En revanche, la queue a deux quelques masques neurologiques, et en tant que tel, nous avons sélectionné la région du milieu du corps pour analyser quantitativement la régénération du mastome neurologique. Chez l’adulte de cette région, nous avons identifié quatre points de suture juste en arrière de la nageoire pectorale latérale qui étaient cohérents dans le nombre de mastères neuronaux chez tous les adultes. Il est important de noter que nous avons été en mesure d’ablater de manière cohérente et complète les neuromastes de cette région par un traitement de 24 heures à 0,004 % de gentamycine, comme indiqué précédemment, ce qui a permis une détermination précise ultérieure de la régénération neuromastologique, comme le montre cette figure, la régénération a été surveillée après l’ablation de tous les masques neurologiques dans les quatre points de suture du milieu du corps après un traitement de 24 heures à la gentamycine et la régénération positive a été déterminée par l’apparition d’un minimum de trois neuromastes dans un Couture par huit heures après la gentamycine.

Environ un tiers des poissons présentaient des signes de rétablissement. Bien que, comme on le voit ici, l’intensité des névromes était faible dans les points de suture régénérants. Le nombre de mâts neuronaux et leur intensité ont continué à augmenter de manière linéaire jusqu’à ce que la régénération atteigne un plateau 16 heures après la gentamycine.

Si les résultats obtenus à partir de l’analyse des névromes ne sont pas statistiquement significatifs entre le groupe témoin et le groupe expérimental, on peut étendre ces études au niveau des cellules ciliées individuelles pour obtenir un degré de résolution plus élevé pour les comparaisons quantitatives à huit heures, 10 heures et 12 heures de temps de régénération. Nous avons constaté que les groupes témoins avaient une gamme de zéro à quatre cellules ciliées par neuromaste dans la région du milieu du corps, comme prévu pour les groupes témoins lors d’une analyse quantitative. Aucune différence statistique entre les névromes n’a été détectée en termes de cellules ciliées par maste neuronal à ces points de temps.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de toujours être conscient du temps. Ne laissez pas le poisson dans la génamicine pendant plus de 24 heures ou le colorant vital pendant plus de 75 minutes après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la médecine régénérative pour explorer la régénération de la ligne latérale dans un état pathologique par rapport à l’état normal et au modèle du poisson zèbre.