Name: Un test pour ligne latérale de régénération à lâge adulte de poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-08T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Découvrez un test quantitatif de régénération de la ligne latérale chez le poisson zèbre adulte utilisant le traitement à la gentamicine et la microscopie confocale. Cette méthode permet d'analyser la régénération des neuromastes et des cellules ciliées.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Toutes les procédures sont effectuées suivant les directives décrites dans les «Principes de protection des animaux de laboratoire» (National Institutes of Health publication no. 85-23, révisée 1985) et le protocole de l&#39;animal Comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux Université Rosalind Franklin approuvé 08-19. 1. Gentamicine-induction de cheveux nécrose des cellules <ol><li> Préparer le sulfate de gentamicine dans du sérum physiologique à une concentration finale de 0,004% (4,32 mM). </li><li> Placer le poisson adulte (D. rerio, 4-6 mois) dans un récipient contenant le 0,004% (4,32 mM) de solution de gentamicine. Tout récipient peut être utilisé, mais nous utilisons un conteneur de poissons à partir d&#39;un système aquatique Pharmacal qui est 7 de large, 6 en haut, et 7 dans longtemps. Placer le récipient avec des poissons dans un incubateur réglé à 28 ° C pendant 24 heures. Régler le volume total de fluide dans le réservoir à un niveau suffisant pour maintenir le poisson dans un état viable pour la période de 24 heures. Remarque: L&#39;aération du fluide gentamicine n&#39;est pas necessaire si suffisamment de volume est utilisée pour le nombre de poissons à traiter. </li></ol> 2. Coloration vitale des cellules ciliées <ol><li> Préparer une concentration de 0,08% (dans une solution saline normale) du colorant vital fluorescent [4-4-diethylaminostyryl)-N-méthylpyridinium (485 nm excitation λ et 603 nm émission λ dans le methanol) à partir d&#39;une solution de travail de réserve de 15 mg / ml dans de l&#39;éthanol. </li><li> Pour déterminer si le traitement a été efficace gentamicine un sous-ensemble de contrôle et de la gentamicine poissons traités sont colorées immédiatement en plaçant le poisson dans le puits d&#39;une plaque de culture 6 puits contenant le colorant vital. Utilisez un nombre suffisant de poissons (et des plaques de culture comme l&#39;exige la signification statistique à atteindre. Basé sur la vitesse de l&#39;examinateur de comptage neuromastes, placer le poisson dans les plaques de manière échelonnée dans le temps afin que les poissons ne sont pas tachés de plus de 75 min comme décrit dans l&#39;étape 2.3. </li><li> Placez les plaques de l&#39;étape 2.2 dans un tiroir de banc par le microscope à fluorescence àêtre utilisé pour l&#39;examen de neuromastes colorées. Éteignez les lumières de la pièce pour éviter l&#39;extinction du colorant vital au cours de la période de coloration 1 h à température ambiante. </li><li> Préparer la fois colorant wash-out et des réservoirs d&#39;eau anesthésiques. Eau de wash-out colorant est de l&#39;eau de poisson normale et de l&#39;eau anesthésie, ajouter suffisamment de 2-phénoxyéthanol sorte qu&#39;une dilution de 1:1000 dans l&#39;eau du poisson normale est atteint. </li><li> Placer le poisson dans l&#39;eau en excès de poisson normale pour rincer l&#39;excès de colorant vital et passez à l&#39;étape 3.1 pour l&#39;observation de colorant teinté poissons vital. </li><li> Pour la régénération de la neuromastes, transférer les poissons de la gentamicine traités qui ont été lavés à l&#39;eau du poisson normale dans un incubateur pour entre 8-16 heures à 28 ° C. </li><li> À divers moments entre 8-16 heures, les poissons sont retirées de l&#39;incubateur, lavées et colorées comme indiqué dans les étapes 2.1 à 2.4. Passez à l&#39;étape 3.1 pour l&#39;observation de colorant teinté poissons vital. </li></ol> 3. Anesthésier le poisson et comptage fluorescent de Neuromastes <ol><li&gt; Blot chaque poisson sur une serviette en papier pour enlever l&#39;excès de liquide, puis placez-le sur un morceau de papier humide de filtre qui est centrée sur le couvercle d&#39;une boîte de Petri en plastique. </li><li> Placer le couvercle sur la scène d&#39;un microscope stéréo fluorescent pour obtenir une image numérique des colorants neuromastes colorées vitaux des points du corps milieu. </li><li> Utilisez un appareil photo numérique placé sur le microscope stéréo fluorescent fixé un grossissement de 2X pour capturer des images pour l&#39;analyse quantitative ultérieure. Remarque: Le réglage de grossissement du microscope stéréo peut dépendre de la marque de microscope utilisé, mais le réglage doit permettre l&#39;affichage et le comptage des neuromastes individuels facile dans le milieu des points du corps. </li><li> Déterminer la quantité de régénération en comptant le nombre de neuromastes visibles dans les quatre points désignés sur le côté inférieur le plus ventrale du poisson juste en amont de la nageoire pectorale droite (voir la figure 1). Pour l&#39;analyse statistique en utilisant un test approprié tel que ANOVA or T-test de Student. Les expériences doivent utiliser un minimum de 5 poissons par point de temps et toutes les expériences doivent être répétées au moins 3x. </li><li> Sur la base de la courbe de temps neuromastes de régénération (voir la figure 3), compter neuromastes entre 8-16 heures après la gentamicine wash-out pour être dans la phase linéaire de la courbe de régénération. Remarque: L&#39;utilisation de la phase de temps linéaire permet une analyse quantitative adéquate entre les groupes témoins et expérimentaux. </li></ol> 4. Comptage fluorescent de cellules ciliées individuelle pour l&#39;obtention d&#39;une résolution plus élevée de l&#39;analyse quantitative si l&#39;analyse neuromastes n&#39;est pas statistiquement significative <ol><li> Si l&#39;analyse quantitative au niveau de neuromastes n&#39;est pas significative, une analyse au niveau de la cellule individuelle de cheveux peut également être utilisée pour obtenir un plus haut degré de résolution. Sélectionnez poisson à un particulier le point de temps après la gentamicine de wash-out (point de temps sur la base des études de neuromasts antérieures), colorant vital stain le poisson tel que décrit dans le protocole 2, puis euthanasier les poissons en utilisant le 2-phénoxyéthanol à une dilution 1:500 1-5 min. </li><li> Dans une lumière tamisée pour éviter l&#39;extinction, faire quatre incisions ainsi qu&#39;un carré préparation de lambeau de peau est faite comme suit. Faire une incision le long des côtes supérieures du poisson jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit aligné avec les nageoires anales, puis faire une incision dans le ventre, et enfin, faire deux incisions verticales de chaque côté de ces incisions de sorte que le volet carré de la peau est créé. Note: Cette préparation de la peau intégrera les points du corps milieu utilisés dans les expériences de neuromasts. </li><li> Placer l&#39;échantillon de peau sur une lame de verre, puis placez une circulaire lamelle de verre sur le spécimen excisé de la peau pour aider à l&#39;ancre et aplatir le tissu pour l&#39;imagerie numérique ultérieure. </li><li> En utilisant les échantillons de peau provenant de l&#39;étape 4.3, d&#39;obtenir des images numériques de cellules ciliées dans chaque neuromastes des points milieu du corps. Prenez des photos à un grossissement d&#39;au moins 60X et puis de compter le CE de cheveuxlls dans neuromastes individuels pour l&#39;analyse quantitative comparative de la commande et les groupes expérimentaux (voir figure 4). </li></ol>

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Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche de la Fondation de la famille Iacocca, de la subvention DK092721 des National Institutes of Health (à R.V.I.) et des fonds de démarrage de l’Université Rosalind Franklin. Aucun conflit d’intérêts potentiel pertinent pour cet article n’a été signalé. G.C.P., S.M.M. et N.D. ont recherché des données. M.P.S. Jr. et RI ont supervisé le projet, contribué à la discussion des données et supervisé la rédaction et l’édition du manuscrit.

Basé sur le vaste corpus de littérature qui a été mis en place pour l&#39;analyse de la ligne latérale (LL) de la régénération chez le poisson zèbre embryonnaire et larvaire 8,24,25, le but de notre étude était de développer un dosage quantitatif pour la régénération de la ligne latérale chez le poisson zèbre qui pourrait être appliquée à des modèles de maladies qui sont les mieux étudiés dans les poissons adultes. Nous avons constaté que certains points critiques sont importantes lors de l&#39;application de...

Le système (LL) de la ligne latérale est un organe mécanosensorielle trouvé dans les deux poissons et les amphibiens qui est responsable de l&#39;audition, l&#39;équilibre, rhéotactisme et les comportements de médiation telles que la scolarisation et l&#39;évitement des prédateurs 1-5. Elle est composée de grappes de cellules ciliées entourées par des cellules de soutien, qui sont tous deux positionnés dans des structures appelées neuromastes 6. Ces neuromastes sont généralement organisés en lignes verticales (appelé points) le long de l&#39;axe longitudinal du corps et de la queue avec quelques points horizontaux observés dans la tête du poisson. Chez l&#39;adulte, neuromastes sont beaucoup plus nombreux dans les points par rapport à l&#39;embryon ou larves de poissons 6. Études biomédicales chez le poisson zèbre ont porté sur l&#39;effet du traitement antibiotique, traumatisme induit par le bruit, une infection chronique, etc. sur les cellules ciliées 7,8 pour tenter de mieux comprendre leurs effets sur les humains. Contrairement à la plupart des vertébrés, teleosts, tels que le poisson zèbre (Danio rerio), ont la capacité de régénérer les cellules de cheveux perdus. Poisson zèbre sont particulièrement utiles en raison de leur temps de développement rapide et de haute capacité de régénération. A ce jour, toutefois, études de poisson zèbre sur le développement et / ou la régénération de la ligne latérale ont principalement utilisé le poisson embryonnaire et larvaire stade en raison de la réduction du nombre de neuromastes de la ligne latérale qui permet de faciliter le comptage et l&#39;analyse 6,9,10. Cependant, comme de nombreux modèles de poisson zèbre de maladies neurologiques et non neurologiques 11-16 sont étudiés dans les poissons adultes et non les larves, nous nous sommes concentrés sur le développement d&#39;un test de régénération de la ligne latérale chez le poisson zèbre adulte en utilisant la gentamicine (un aminoglycoside déjà utilisé dans les larves de poisson zèbre et plus récemment utilisé avec les poissons adultes 17) de sorte qu&#39;une analyse était disponible qui pourraient être appliquées à des modèles de maladies adultes actuels de poisson zèbre. Bien que les procédures précédemment publié par Van Trump et al. 17 fixe les conditions pour l&#39;ablation des cellules ciliées dans les poissons adultes, ils n&#39;ont pas établi une courbe standard pour la régénération neuromastes qui est nécessaire pour la comparaison quantitative entre les groupes témoins et expérimentaux tels que l&#39;utilisation de lignes de poisson zèbre transgénique ou états pathologiques pharmacologiquement induits chez le poisson zèbre 18. Nous avons donc suivi les procédures de Van Trump et al. 17 pour l&#39;ablation des cellules ciliées, mais construit sur ​​leur travail pour établir une courbe standard de régénération neuromastes pour permettre aux enquêteurs d&#39;utiliser nos données lorsque l&#39;on compare les groupes témoins et expérimentaux tels que des modèles de la maladie de poisson zèbre adulte . L&#39;essai a également été conçu pour permettre l&#39;extension de l&#39;analyse à la cellule individuelle lorsque les cheveux un plus haut niveau de résolution est requise.

<table><tbody><tr><td>Solution de sulfate de gentamicine (50 mg/ml)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>2 Phénoxyéthanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1126</td><td></td></tr><tr><td>4-4-Diethylaminostryryl-N-méthylpyridinium iodure (4-Di-2-Asp) dans le méthanol</td><td>Aldrich</td><td>D-3418</td><td>485 nm excitation &lambda ; et 603 nm émission &lambda ;</td></tr><tr><td>Plaques à 6 puits</td><td>Mid Sci</td><td>TP92006</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>Plats à micropuits à fond de verre</td><td>Matek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Dissectionnement&nbsp ; Microscope</td><td>Nikon</td><td>TMZ-1500</td><td>N’importe quel microscope de dissection est parfait.</td></tr><tr><td>Appareil photo pour l’imagerie Nikon</td><td></td> Q <td>imaging N’importe quel appareil photo convient.</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>NIH Image</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td>Tout logiciel d’imagerie convient.</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Olympus</td><td>FV10i</td><td>Tout microscope fluorescent haute résolution convient</td></tr><tr><td>Système aquatique</td><td>KG Aquatics ZFS Rack System</td><td></td><td>Tout système aquatique peut être utilisé</td></tr></tbody></table>

un test pour ligne latérale de régénération à l&#39;âge adulte de poisson zèbre

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

En raison de l&#39;importance clinique de l&#39;ouïe et troubles de l&#39;équilibre chez l&#39;homme, des organismes modèles tels que le poisson zèbre ont été utilisés pour étudier le développement de la ligne latérale et la régénération. Le poisson zèbre est particulièrement intéressante pour ces études en raison de son temps de développement rapide et sa grande capacité de régénération. À ce jour, les études de poisson zèbre de latéral régénération de ligne ont principalement utilisé des poissons des stades embryonnaires et larvaires en raison de la diminution du nombre de neuromastes à ces stades. Cela a fait de l&#39;analyse quantitative de la ligne de régénération / et ou le développement plus facile dans les premiers stades de développement latéral. Parce que de nombreux modèles de poisson zèbre de maladies neurologiques et non neurologiques sont étudiés dans les poissons adultes et non dans l&#39;embryon / larves, nous nous sommes concentrés sur le développement d&#39;un test latéral quantitative ligne de régénération chez le poisson zèbre adulte ainsi qu&#39;une analyse était disponible qui pourrait être appliquée à courant modèles de la maladie de poisson zèbre adulte. S&#39;appuyant sur des études précédentes par Van Trump et al 17. qui décrit les procédures d&#39;ablation de cellules ciliées de poissons adultes mexicain aveugle de la grotte et le poisson zèbre (Danio rerio), notre test a été conçu pour permettre une comparaison quantitative entre les groupes témoins et expérimentaux. Cela a été réalisé en mettant au point une courbe étalon de neuromastes régénérative sur la base de la réapparition de neuromastes pour cent pendant une période de temps de 24 heures suivant la nécrose induite par la gentamicine, de cellules ciliées dans une région définie de la ligne latérale. L&#39;essai a également été conçu pour permettre l&#39;extension de l&#39;analyse au niveau des cellules ciliées individu quand un niveau supérieur de résolution est requise.

Optimisation des procédures pour quantifier neuromastes régénération de la ligne latérale chez le poisson zèbre adulte. Les neuromastes de poisson zèbre larves sont facilement quantifiables; Cependant, la ligne latérale de poisson zèbre adulte a un plus grand nombre de neuromastes par point faisant des analyses quantitatives plus difficile 6,17,19,20. Comme on le voit sur ​​la figure 1A, la tête a un nombre significativement plus élevé de neuromas...

Parce que de nombreux modèles de poisson zèbre de maladies neurologiques et non neurologiques sont étudiés dans les poissons adultes plutôt que l&#39;embryon / larve, nous avons développé un dosage latéral de régénération de ligne quantitative qui peut être appliquée à des modèles de maladies de poisson zèbre adulte. Le dosage impliqué résolution au neuromastes 1) et 2) les niveaux cellulaires de cheveu.

Un test pour ligne latérale de régénération à l&#39;âge adulte de poisson zèbre

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

L'objectif général de cette procédure est de développer un dosage quantitatif de la régénération de la ligne latérale pouvant être appliqué à un modèle de maladie chez le poisson zèbre adulte. Cela est réalisé en ablatant d'abord la ligne latérale des poissons zèbres adultes en les traitant pendant 24 heures avec de la gentamicine. Ensuite, la gentamicine est éliminée par lavage et les poissons sont laissés à régénérer leurs neuromastes pendant différentes durées dans de l'eau fraîche.Les poissons sont ensuite colorés avec un colorant vital afin de visualiser la récupération de la ligne latérale à des points temporels désignés. Pour confirmer que le médicament a été efficace dans l'ablation des neuromastes, certains poissons doivent être colorés immédiatement après le lavage de la gentamicine. Ensuite, les neuromastes des lignes latérales sur les poissons ou les préparations de peau sont comptés à l’aide d’images obtenues avec un microscope fluorescent ou confocal.Enfin, les groupes expérimentaux sont comparés quantitativement au groupe témoin à l'aide d'une courbe standard de neuromaste régénératif. En définitive, la microscopie fluorescente et confocale est utilisée pour surveill

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Après sectionnement de la moelle, le poisson zèbre adulte a la récupération fonctionnelle de six semaines après la lésion. Pour profiter de la transparence des larves et une récupération plus rapide, nous présentons une méthode pour sectionnant la moelle épinière larvaire. Après résection, nous observons la récupération sensorielle à partir de 2 jours après la lésion, et le mouvement C-coude de 3 jours après la lésion.

Spinal Cord Transection dans le poisson zèbre larvaire

Pour faire la lumière sur les mécanismes cellulaires et moléculaires de la neurogenèse et de la régénération du poisson zèbre adulte, nous avons développé un protocole de chirurgie invasive provoquant des lésions mécaniques chez le télencéphale adulte du poisson zèbre et le suivi ultérieur des changements dans l’hémisphère poignardé par immunohistochimie ou hybridation in situ.

Stab blessures plaies du poisson zèbre adulte Télencéphale: Une méthode pour étudier le cerveau des vertébrés neurogenèse et régénération

Nous présentons un protocole pour capturer la dynamique de la régénération de la nageoire caudale des larves de poisson-zèbre à l’échelle de l’ensemble du tissu à l’aide de la stéréomicroscopie basée sur le fond clair. Cette technique permet de capturer la dynamique de régénération avec une résolution de cellule unique. Cette méthodologie peut être adaptée à tout stéréomicroscope équipé d’une caméra CCD et d’un logiciel de time-lapse.

Capture réparation des tissus chez le poisson zèbre larves avec Time-lapse Brightfield stéréomicroscopie

Nous décrivons ici le flux de travail pour l’utilisation du système TetON afin d’obtenir une expression génique spécifique au tissu dans la nageoire caudale du poisson-zèbre adulte en régénération.

Utilisation du système de Teton pour étudier les mécanismes moléculaires de la régénération du poisson zèbre

L’ablation au laser est une technologie largement applicable pour étudier la régénération dans les systèmes biologiques. Le protocole présenté décrit l’utilisation d’un microscope confocal standard de laser-balayage pour l’ablation de laser et la formation image time-lapse suivante des cellules interuromast régénérantes dans la ligne latérale de zebrafish.

Essai confocal d’ablation et de régénération au microscope dans les cellules interuromast de Zebrafish

La régénération des muscles squelettiques est entraînée par les cellules souches musculaires résidentes des tissus, qui sont altérées dans de nombreuses maladies musculaires telles que la dystrophie musculaire, ce qui entraîne l’incapacité du muscle à se régénérer. Ici, nous décrivons un protocole qui permet l’examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson zèbre de la maladie musculaire.

Examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson-zèbre de maladie musculaire

Capable de récupération fonctionnelle après une lésion de la moelle épinière, le poisson-zèbre adulte est un système modèle de premier plan pour élucider les mécanismes innés de la régénération neuronale. Ici, nous décrivons les tests d’endurance et de comportement de natation comme des lectures fonctionnelles de la régénération de la moelle épinière.

Évaluation de l’endurance à la nage et du comportement de nage chez le poisson-zèbre adulte

Le présent protocole décrit une méthode pour induire des lésions tissulaires spécifiques et hautement reproductibles chez les larves de poisson zèbre à l’aide d’un système de lésion laser combiné à une plate-forme microfluidique automatisée pour la manipulation des larves.

Lésions semi-automatisées contrôlées induites par laser pour étudier la régénération de la moelle épinière chez les larves de poisson zèbre

Ce protocole décrit la récolte et la visualisation d’écailles d’élasmoïdes de poisson-zèbre au cours de la régénération in vivo . De plus, la culture ex vivo de ces cochenilles jusqu’à 7 jours après la récolte est présentée.

Régénération d’écailles de poisson-zèbre Culture d’écailles in toto et ex vivo

Ici, nous montrons comment faire rétro-orbitaires d'injection chez le poisson zèbre adulte.

Rétro-orbitaire d&#39;injection chez le poisson zèbre pour adultes

Découvrez un test quantitatif de régénération de la ligne latérale chez le poisson zèbre adulte utilisant le traitement à la gentamicine et la microscopie confocale. Cette méthode permet d'analyser la régénération des neuromastes et des cellules ciliées.

Un test pour ligne latérale de régénération à l'âge adulte de poisson zèbre

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