Glycopeptides Capture pour protéomique de surface cellulaire

L'objectif général de cette procédure est d'enrichir les protéines membranaires de surface cellulaires peu abondantes. Cela est réalisé en dénaturant et en digérant d'abord les protéines membranaires. La deuxième étape consiste à oxyder les glycannes et à capturer les peptides glycosylés sur une surface de résine.

Les glycopeptides non liés sont ensuite éliminés par lavage de la résine. La dernière étape consiste à libérer les glycopeptides N-liés de la résine pour une analyse par LC-MS. Enfin, la séquence peptidique identifiée peut être associée aux protéines correspondantes à des fins d'identification et de quantification.

Aujourd'hui, je vais vous montrer comment fonctionne la capture par peptide Geico ral. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la capture de glycoprotéines, est que la protéine membranaire est d'abord digérée, et la capture du glycopeptide peut être réalisée dans un seul récipient. L'application de cette technique peut s'étendre à la découverte de biomarqueurs de maladies.

Étant donné que la protéine gator peut être libérée dans le sang et d'autres fluides corporels, et que la glycoprotéine circulante dans le sang, spécifique du processus pathologique, peut être utilisée comme biomarqueur de diagnostic et de pronostic, commencez par préparer quatre millilitres de tampon hypotonique contenant un inhibiteur de protéases à une dilution de 1/100. Ajoutez un millilitre de tampon hypotonique à un culot cellulaire contenant environ 10⁸ cellules, puis incubez le mélange de 15 à 30 minutes sur de la glace. Transférez les cellules dans un flacon de deux millilitres et lysez les cellules en faisant passer l'échantillon de cinq à dix fois à travers une aiguille de seringue.

Ensuite, utilisez un cytomètre hématique et une coloration au bleu de trypan. Pour vérifier l'efficacité de la lyse, mélangez un millilitre de lyzat avec trois millilitres de tampon hypotonique restant. Faites centrifuger le tube à 3000 ×g à 4 °C pendant 15 minutes.

Transférez le surnageant surnageant à un tube d'ultracentrifugation et conservez le culot dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Faites tourner le tube d'ultracentrifugation à 100 000 ×g à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, dissolvez la fraction microsomale dans 200 microlitres de tampon de dénaturation, puis faites bouillir la solution à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Après avoir refroidi la solution chauffée à la température ambiante, ajoutez de la poudre d'urée de pureté ultra-élevée afin d'obtenir une concentration finale de huit molaire et incubez l'échantillon à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l'incubation, ajoutez une solution mère d'Iodoacétamide à 500 millimolaire à l'échantillon pour obtenir une concentration finale de 15 millimolaire.

Incuber ensuite la solution à l'obscurité pendant 30 minutes à température ambiante afin d'alkyler les thiols libres dans l'échantillon. Ajouter ensuite une solution mère de DTT à 1 molaire à l'échantillon pour obtenir une concentration finale de 10 millimolaire, puis incuber la solution pendant 10 minutes supplémentaires à température ambiante. Pour arrêter la réaction de l'iode acétamide en excès, diluer la solution obtenue 10 fois avec un tampon tris à 40 millimolaire à pH 8, puis ajouter de la trypsine à l'échantillon selon un rapport de 1 à 20 entre la trypsine et la quantité totale de protéines.

Obtenez la quantité de protéines totales à l'aide du dosage de Bradford. Maintenez la réaction de digestion toute la nuit dans un four à 37 degrés Celsius afin de garantir l'achèvement de la réaction. Une fois terminée, arrêtez la digestion en acidifiant la solution échantillon jusqu'à un pH de un avec de l'acide chlorhydrique 10 millimolaire, une condition qui dégrade également la rapidase.

Le détergent se dégrade ensuite le plus rapidement à 37 degrés Celsius pendant une heure dans une étuve. Après l'incubation, éliminer le précipité formé par centrifugation, suivie d'une nouvelle centrifugation. Purifier le surnageant contenant les peptides échantillonnés à l’aide d’une cartouche d’extraction en phase solide C18 et sécher l’échantillon obtenu au vide accéléré.

Effectuer une analyse par électrophorèse SDS-PAGE des échantillons avant et après les cycles de congélation-décongélation et la digestion afin de confirmer l'efficacité de la digestion. À ce stade, dissoudre les peptides purifiés dans 200 microlitres de tampon de couplage. Après avoir ajouté du purivate de sodium à la solution peptidique pour obtenir une concentration finale de 10 millimolaire.

Incubez l'échantillon pendant 30 minutes à l'abri de la lumière à température ambiante. Une fois l'incubation terminée, éteignez l'excès de prate à l'aide de sulfite de sodium pour obtenir une concentration finale de 20 millimolaire et un pH de cinq. Après une incubation de 10 minutes à température ambiante, ajoutez 200 microlitres de solution de résine dérivée d'hydrocyte, prééquilibrée dans le tampon de couplage, à la solution peptidique. Incubez la réaction à 37 degrés Celsius pendant un à deux jours sous agitation rotative bout-à-bout afin d'assurer un couplage complet. À la fin, éliminez les peptides non liés en lavant la résine deux fois avec un millilitre d'eau déionisée, un millilitre de chlorure de sodium 1,5 molaire, un millilitre de méthanol et un millilitre d'acétonitrile à 80 %.

Ensuite, récupérez le surnageant et les lavages pour l'analyse des peptides non liés. Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu'à l'analyse. Puis lavez la résine trois fois avec un millilitre de bicarbonate d'ammonium 100 millimolaire à pH huit.

Enfin, ajoutez 300 microlitres de bicarbonate d'ammonium dans le flacon d'échantillon. Pour libérer les N-glycopeptides de la résine, ajoutez de la PNG ACE F et incubez l'échantillon à 37 degrés Celsius avec une rotation extrémité à extrémité.

À la suite de cette étape, recueillir les peptides libérés par centrifugation, puis laver la résine avec un millilitre d'acétonitrile à 80 %. Combiner le lavage avec le fraction précédemment recueilli. Enfin, sécher la solution obtenue dans le SpeedVac en vue d'une analyse par LC-MS.

Spectre atypique de glycopeptide obtenu après la méthode d'enrichissement, présenté ici sur le glycopeptide obtenu. Le glycan n a été éliminé et le glycan attaché de manière instable a été converti en acide aspartique par la P-N-G-A-F. Ainsi, le spectre peut être facilement recherché par n'importe quel moteur de recherche protéomique dans des bases de données courantes de séquences protéiques.

LC-MS atypique. Résultat des glycopeptides N capturés montré ici, dans lequel plus de 100 glycoprotéines peuvent être identifiées à partir d'une seule analyse LC-MS d'une fraction microsomale cellulaire. La sélectivité d'enrichissement pour les glycoprotéines et les glycopeptides est généralement supérieure à 90 %. Une analyse réussie peut atteindre une sélectivité d'enrichissement de 95 % en utilisant une colonne SCX et un gradient par paliers pour fractionner davantage. Les échantillons avant l'analyse LC-MS doubleront généralement le nombre d'identifications de glycoprotéines.

Parfois, lorsque la quantité de glycopeptides obtenue est faible, les impuretés accumulées à partir des flacons peuvent être observées dans l'échantillon final. Ces contaminants peuvent être éliminés à l’aide d’une colonne MCX. Ainsi, après avoir visionné cette vidéo, j’espère que vous comprenez bien comment utiliser nos méthodes de capture de glycopeptides pour étudier les protéines membranaires auto-servicées.

Pendant que vous mettez en œuvre ce protocole, il est également important de prélever des échantillons à chaque étape afin de pouvoir diagnostiquer d'éventuels problèmes. Le volume du réactif peut également être optimisé en fonction de votre étude spécifique.