Glycopeptides Capture pour protéomique de surface cellulaire

L’objectif global de cette procédure est d’enrichir les protéines membranaires de surface cellulaire de faible abondance. Ceci est accompli en dénaturant et en digérant d’abord les protéines membranaires. La deuxième étape consiste à oxyder les glycanes et à capturer les peptides glycosylés sur une surface de résine.

Les non-glycopeptides sont ensuite lavés de la résine. La dernière étape consiste à libérer les glycopeptides liés à l’azote de la résine pour l’analyse lc MS. En fin de compte, la séquence peptidique identifiée peut être cartographiée jusqu’aux protéines à des fins d’identification et de quantification.

Aujourd’hui, je vais vous montrer comment fonctionne la capture du peptide Geico. Le principal avantage de cette technique de surdosage, par exemple ceux existants, tels que la capture de glycoprotéines, est que la protéine membranaire sera d’abord digérée et que la capture du glycopeptide peut être effectuée dans un seul vaisseau. L’application de cette technique peut s’étendre à la découverte du biomarqueur de la maladie.

Étant donné que la protéine d’alligator peut être excrétée dans le sang et d’autres fluides corporels, la glycoprotéine circulante dans le sang, qui est spécifique au processus pathologique, peut être utilisée comme biomarqueurs de pronostic et de diagnostic. Tout d’abord, préparez quatre millilitres de tampon hypotonique avec un à 100 cocktails d’inhibiteurs de protéase. Ajoutez un millilitre de tampon hypotonique sur une pastille cellulaire contenant environ 10 à huit cellules, et incubez le mélange pendant 15 à 30 minutes Sur de la glace, transférez les cellules dans un flacon de deux millilitres et éjectez les cellules en passant l’échantillon cinq à 10 fois à travers l’aiguille d’une seringue.

Utilisez ensuite un hémocytomètre et une coloration au bleu trian. Pour vérifier l’efficacité de la lyse, combinez le lysat d’un millilitre avec trois millilitres de tampon hypotonique restant. Faites tourner le tube à 3000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.

Transférez le super surnageant dans un tube d’ultracentrifugation et conservez la pastille dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Faites tourner le tube de l’ultracentrifugeuse à 100 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, dissolvez la fraction microsomale dans 200 microlitres de tampon de dénaturation, puis faites bouillir la solution à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Après avoir refroidi la solution chauffée à température ambiante, ajoutez de la poudre d’urée de très haute pureté pour obtenir une concentration finale de huit molaires et incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, ajoutez 500 millimolaires. Une solution mère d’acétamide dans l’échantillon doit donner une concentration finale de 15 millimolaires.

Ensuite, incubez la solution dans l’obscurité pendant 30 minutes à température ambiante pour alkyler les thiols libres dans l’échantillon. Ensuite, ajoutez une solution mère molaire de DTT à l’échantillon pour obtenir une concentration finale de 10 millimolaires et incubez la solution pendant 10 minutes supplémentaires à température ambiante. Pour éteindre l’excès d’acétamide, diluez 10 fois la solution obtenue avec un tampon tris de 40 millimolaires à pH huit, puis ajoutez de la trypsine à l’échantillon dans un rapport de un à 20 entre la trypsine et la quantité totale de protéines.

Obtenez la quantité totale de protéines à l’aide du test de Bradford. Maintenez la réaction de digestion dans un four à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour vous assurer que la réaction est terminée. Une fois terminé, terminez la digestion en acidifiant la solution de l’échantillon à pH un avec de l’acide chlorhydrique millimolaire, une condition qui dégrade également le plus rapide.

Le détergent se dégrade ensuite le plus rapidement à 37 degrés Celsius pendant une heure dans un incubateur. Après l’incubation, éliminer les précipitations développées par centrifugation après centrifugation. Nettoyez le SUP natin qui contient les peptides de l’échantillon à l’aide d’une cartouche d’extraction en phase solide C 18 et séchez l’échantillon obtenu à l’aide d’un aspirateur rapide.

Effectuez une analyse de la page FDS des échantillons avant et après les voyages et la digestion pour confirmer l’efficacité de la digestion. À ce stade, dissolvez les peptides nettoyés dans 200 microlitres de tampon de couplage. Après avoir ajouté du puriate de sodium à la solution peptidique pour donner une concentration finale de 10 millimolaires.

Incuber l’échantillon pendant 30 minutes dans l’obscurité à température ambiante Lorsque l’incubation est terminée, tremper l’excès de prate avec du sulfite de sodium pour donner une concentration finale de 20 millimolaires et un pH de cinq après l’incubation pendant 10 minutes à température ambiante, introduire 200 microlitres de solution de résine dérivée d’hydrocyte, pré-équilibrée et tampon de couplage dans la solution peptidique. Incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant un à deux jours avec rotation de bout en bout pour un couplage complet. Une fois terminé, retirez les peptides non liés en lavant la résine deux fois avec un millilitre d’eau déminéralisée, un millilitre de chlorure de sodium à 1,5 molaire, un millilitre de méthanol et un millilitre de nitrile à 80 %.

Ensuite, prélevez le surnageant et les lavages pour l’analyse des peptides non liés. Conservez les échantillons dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’analyse. Ensuite, lavez la résine trois fois avec un millilitre de bicarbonate d’ammonium de 100 millimolaires à pH huit.

Enfin, ajoutez 300 microlitres de bicarbonate d’ammonium dans le flacon d’échantillon. Pour libérer les glycopeptides N de la résine. Ajoutez PNG ACE F et incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius avec une rotation de bout en bout.

Ensuite, récupérez les peptides libérés par centrifugation, puis lavez la résine avec un millilitre d’acétyl nitrile à 80 %. Combinez le lavage avec celui précédemment collecté. Enfin, séchez la solution obtenue dans la vitesse VAC pour l’analyse lc MS.

Le spectre des glycopeptides atypiques pris après la méthode d’enrichissement est montré ici dans le glycopeptide obtenu. Le n glycane a été éliminé et le dénigrement attaché au glycane a été converti en acide spartique par P-N-G-A-F. Par conséquent, le spectre peut être facilement recherché par n’importe quel moteur de recherche protéomique dans les bases de données de séquences protéiques courantes.

Atypique lc MS. Le résultat des n glycopeptides capturés est montré ici, dans lequel plus de 100 glycoprotéines peuvent être identifiées à partir d’un seul passage de MS lc d’une fraction microsomale cellulaire. La sélectivité d’enrichissement pour les glycoprotéines et les glycopeptides est généralement supérieure à 90 %Une analyse réussie peut avoir une sélectivité d’enrichissement de 95 % en utilisant une colonne SCX et un gradient d’échelon pour fractionner davantage. Les échantillons prélevés avant l’analyse LCMS doublent généralement le nombre d’identifications de glycoprotéines.

Parfois, lorsque la quantité de glycopeptides obtenus est faible, l’impureté accumulée dans les flacons peut être observée dans l’échantillon final. Ces contaminants peuvent être éliminés par une colonne MCX. Donc, après avoir regardé cette vidéo, j’espère que vous avez une bonne compréhension de la façon d’utiliser nos méthodes de capture de glycopeptides pour étudier les protéines membranaires en libre-service.

Pendant que vous essayez ce protocole, il est également important de réserver des échantillons pour chaque étape pour le dépannage. Le volume du réactif peut également être optimisé pour votre étude spécifique.