Name: Enregistrement électrophysiologique De Drosophila Labellar Goût Sensilles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Apprenez l'enregistrement électrophysiologique des sensilles gustatives labellaires chez Drosophila. Cette méthode permet de mesurer les réponses neuronales aux composés gustatifs et facilite l'étude du traitement sensoriel chez les insectes.

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Ce travail a été soutenu par une subvention de 1F31DC012985 prédoctorale NRSA (à RD) et par des subventions du NIH à JC Nous tenons à remercier le Dr Weiss Linnea des commentaires utiles sur le manuscrit, le Dr Ryan Joseph pour aider les compiler les chiffres, et le Dr Frédéric Marion-Poll pour des conseils techniques utiles. Nous tenons également à remercier les précieux commentaires de quatre auteurs.

Le protocole suivant est conforme à toutes les directives de protection des animaux de l&#39;Université de Yale. Une. Réactifs et Préparation du matériel <ol><li> Installation de matériel d&#39;enregistrement (figure 1A). <ol><li fo:keep-together.within-page="always"> Choisissez une chambre pour la configuration de plate-forme qui est exempte de grosses variations de température ou d&#39;humidité et aussi isolé des sources de bruit électrique et mécanique, tels que les réfrigérateurs et les centrifugeuses. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51355/51355fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51355/51355fig1.jpg" /> Figure 1. (A) Vue d&#39;ensemble de la configuration d&#39;enregistrement de forage. Stéréomicroscope (a) est monté sur la plate-forme anti-vibration (b). Electrode de référence titulaire (c) est monté sur la plate-forme en face de la headstage (d), par l&#39;intermédiaire de micromanipulateurs. Un tube en matière plastique de sortie (e) délivrer des trains d&#39;air humidifié dirigé vers la préparation de la mouche est également monté sur til plateforme. Le headstage est connecté à l&#39;amplificateur (f), qui est relié au système d&#39;acquisition numérique (DAS) (g), qui est relié à un ordinateur (h). (B) Configuration d&#39;électrodes et le tube de sortie:. Électrode de référence sur la gauche, l&#39;électrode d&#39;enregistrement sur ​​la droite, et le tube de sortie de flux d&#39;air dirigé à la préparation à la mouche <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> </li><li> Mont stéréomicroscope au centre de la table anti-vibration ou plate-forme. </li><li> Fixez micromanipulateurs pour la préparation électrode de référence / contre les insectes et headstage / électrode d&#39;enregistrement à gauche et à droite du microscope, respectivement, en utilisant des stands magnétiques. </li><li> Mont tube en matière plastique de sortie dans une troisième micromanipulateur à l&#39;arrière du microscope, orienté de telle sorte que l&#39;ouverture du tube est dirigé vers l&#39;emplacement de préparation mouche (voir figure 1B). </li><li> Utilisant un tube en plastique souple, àTube en matière plastique de sortie du tachymètre à une fiole à vide partiellement remplie d&#39;eau. Raccorder une petite pompe à air pour aquarium à bulles à travers l&#39;eau dans le ballon, en engendrant un courant d&#39;air humidifié à travers le tube en matière plastique de sortie vers la volée. </li><li> Mont fibre optique source de lumière sur la table de vibration, orientant les sorties pour éclairer la préparation en réfléchissant la lumière par un morceau de papier blanc de carte directement en dessous de la préparation. Assurez-vous que la source de lumière ne repose pas sur la table. Remarque: l&#39;avantage de refléter la source de lumière sur un disque de papier est double: il améliore le contraste, ce qui sensilles plus facile à visualiser, et il empêche le chauffage de la préparation qui résulterait de la lumière directe. </li><li> Branchez amplificateur tastePROBE dans le système d&#39;acquisition numérique (DAS), et le DAS dans un ordinateur personnel, conformément au manuel de fournisseur. Branchez la pédale de déclenchement à organiser et sous l&#39;espace de travail. Remarque: les prises murales électriques isolés pour l&#39;amplificateur et DAS sont hautement souhaitablemesure. </li><li> Électriquement terre microscope, micro-manipulateurs, et source de lumière par la connexion des composants métalliques de table à l&#39;aide des pinces crocodiles et des longueurs de fil électrique isolé et ruban électrique. Électriquement terre plate-forme de métal en se connectant à la construction de sol ou DAS, qui est relié à la terre par prise d&#39;alimentation. </li><li> Installez le logiciel d&#39;acquisition approprié pour la DAS de choix sur l&#39;ordinateur personnel. Remarque: Assurez-vous que les pilotes d&#39;acquisition numériques sont compatibles avec le système d&#39;exploitation sur le PC. </li><li> Configuration d&#39;amplification de logiciel (10-100X), le filtrage du signal (typiquement un filtre de Bessel passe-bande réglable de 100 Hz à 3 000 Hz) et la fréquence d&#39;échantillonnage (d&#39;au moins 10 KHz). Remarque: les amplitudes de signaux de neurones gustatifs sont typiquement dans la gamme mV 0,5-2, si l&#39;échelle d&#39;affichage est réglé pour faciliter leur visualisation. Remarque: Le filtre de 100 Hz permet d&#39;exclure le bruit électrique parasite, mais il modifie la forme de pointes et peut faire de pointe pic tri more contester. En variante, un filtre de 1 Hz peut être utilisé. </li><li> Eventuellement, une cage de Faraday peut être mis en place tout autour de la table de vibration. Cependant, de petites feuilles de papier d&#39;aluminium sont généralement suffisantes pour réduire le bruit généré par le milieu extérieur ou de l&#39;investigateur. </li></ol></li><li fo:keep-together.within-page="always"> Préparation de l&#39;électrode de verre <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51355/51355fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51355/51355fig2.jpg" /> Figure 2. Référence et d&#39;enregistrement des électrodes. Photographie sous un grossissement de capillaires en verre tiré dans l&#39;électrode de référence, avec (A) et sans (B) pointe cassé, et des électrodes d&#39;enregistrement (C). Barre blanche représente 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <ol><li> Tirez la référencel&#39;électrode à partir d&#39;un capillaire en verre à l&#39;aide d&#39;un instrument de traction pipette. Remarque: Les paramètres exacts du programme pipette de traction varient d&#39;un instrument à l&#39;. Essayez d&#39;atteindre un très long cône progressif. La taille des pores à la pointe n&#39;est pas cruciale, car la pointe sera brisé avant la préparation de la mouche (Figures 2A et 2B), mais assurez-vous que le diamètre de la longueur conique de l&#39;électrode n&#39;est ni trop mince, ce qui ne permettra pas suffisante immobilisation de la labellum, ni trop grand, ce qui pourrait endommager les neurones gustatifs ou une rupture des glandes salivaires. </li><li> Tirer électrode d&#39;enregistrement à partir d&#39;un capillaire en verre de borosilicate avec filament en utilisant une pipette instrument de traction. Essayer d&#39;atteindre une conicité qui est moins profonde que celle de l&#39;électrode de référence, et un diamètre de pores d&#39;environ 10 à 15 um (figure 2C) 28. </li></ol></li><li> Solutions exhausteur de goût préparation <ol><li> Utilisez solution Ringer Beadle-Ephrussition (B &amp; E) comme électrolyte de l&#39;électrode de référence. Pour faire un litre de B &amp; E, dissoudre 7,5 g de NaCl, 0,35 g de KCl, et 0,279 g de CaCl2 ∙ 2H 2 O dans un litre d&#39;eau ultra-pure. Rangez les petites aliquotes à -20 ° C. </li><li> Utiliser 30 mM de citrate de tricholine solution (TCC) comme électrolyte de l&#39;électrode d&#39;enregistrement et d&#39;un solvant pour les solutions 25 exhausteur de goût, si les réponses amères ou sucre GRN doivent être mesurés. En variante, mM de solution de chlorure de potassium de 1 à 3 peut être utilisé si les réponses de la cellule de l&#39;eau sont à mesurer. </li><li> Pour rendre les solutions exhausteur de goût, peser quantité appropriée d&#39;exhausteur de goût sous forme de poudre et ajouter à la CCI de faire une concentration de stock initial. Utilisez cette fonction pour faire des dilutions en série de ce stock initial pour obtenir la concentration souhaitée pour le test. Remarque: Si tastants ne se dissolvent pas facilement dans l&#39;eau, un autre solvant tel que l&#39;éthanol, peut être utilisé pour faire de concentration stock initial. Une solution de contrôle approprié de la CCT et de solvant sans exhausteur de goûtdoit être utilisé dans ce cas. </li><li> aliquotes de magasins à long terme à -20 ° C. Stocker une partie aliquote d&#39;une solution de travail d&#39;exhausteur de goût à 4 ° C pour une utilisation pour l&#39;enregistrement de plus d&#39;une semaine, en fonction de propriétés chimiques du exhausteur de goût. </li></ol></li></ol> 2. Préparation Drosophila <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51355/51355fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51355/51355fig3.jpg" /> Figure 3. Préparation de la mouche pour l&#39;enregistrement. (A) la position d&#39;insertion de l&#39;électrode de référence dans thorax dorsal de la mouche. La flèche blanche indique l&#39;électrode de référence. (B) La position intermédiaire de l&#39;électrode de référence: avancé à travers le cou et la tête, trompe pas encore sortis. (C, D) Volez avec électrode de référence en position finale avec la pointe d&#39;électrode à l&#39;intérieur labelle, et trompeentièrement déployée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <ol><li> Recueillir les mouches nouvellement éclos pour l&#39;enregistrement à partir de cultures de mouche bien entretenues, cultivées sous-et des conditions de température à humidité contrôlée, et les vieillir 5-10 jours dans des flacons de culture frais avant l&#39;enregistrement. </li><li> Réfrigérer plaque de microscope sur la glace pendant 15-30 min avant de préparer mouche. </li><li> Remblai électrode de référence en verre avec B &amp; E solution à l&#39;aide d&#39;une aiguille longue et fine en plastique de 0,5 mm de diamètre, comme une aiguille spinale et seringue de 1 ml et tapotez doucement les bulles. Cassez petite quantité de pointe hors aide d&#39;une pince et d&#39;utiliser l&#39;action capillaire à tirer toutes les bulles restantes avec un tissu, en observant sous un microscope à dissection. </li><li> Glisser B &amp; E-rempli électrode de référence sur le fil de support d&#39;électrode de référence, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d&#39;air. </li><li> Aspirer voler dans une pointe de pipette P200, en utilisant la mouche aspirateur intégréà partir de tubes, maille, et la pointe de la pipette, 29 place dans un seau à glace et réfrigérer pendant 30-60 sec. </li><li> Retirer la plaque de microscope de la glace, essuyez l&#39;humidité, et la position sous microscope. Tapoter doucement décoller de pointe de la pipette sur la plaque de microscope. Remarque: la mouche doit être immobilisé suffisamment pour manipuler facilement. </li><li> À faible grossissement, retirez délicatement les pattes de devant avec une paire de pinces, tout en maintenant la stabilité du thorax avec l&#39;autre paire de pinces. Placez la mouche sur sa face ventrale, la face dorsale vers le haut. Remarque: Toujours faire attention à ne pas toucher le labelle avec la pince à tout moment pendant le processus de préparation afin de minimiser les dommages mécaniques. </li><li> Tout en maintenant la volée en place avec une paire de pinces, insérer l&#39;électrode de référence sur la ligne médiane de la partie postérieure dorsale du thorax. Un angle suggéré d&#39;entrée est d&#39;environ quarante cinq degrés, dans la direction de la tête (figure 3A). </li><li> Fixez le electrod de référenceporte-e avec la pâte à modeler de telle sorte que la mouche est visible sous le microscope à fort grossissement. Manoeuvrer et de l&#39;angle de l&#39;électrode de verre à travers le col et la tête, en faisant coulisser la volée vers le porte-électrode de référence au moyen de deux paires de pinces. Remarque: Travaillez rapidement mais en douceur, il est plus facile de réaliser cette étape alors que la mouche est toujours immobilisé contre le froid (figure 3B). </li><li> Étendre délicatement la trompe avec une paire de pinces, tout en faisant glisser la volée plus bas de l&#39;électrode de référence de verre, jusqu&#39;à ce que la pointe de l&#39;électrode est à l&#39;intérieur du labelle et la trompe est entièrement déployée (figures 3C et 3D). Note: Prenez soin de ne pas percer une partie du tissu trompe ou distendre le bord du labelle avec l&#39;électrode de référence, car cela pourrait endommager la volée et / ou un goût neurones et affecter la qualité d&#39;enregistrement. </li></ol> 3. Enregistrement à partir Labellar Sensilles <p class="jove_content" fo:keep-together.within page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51355/51355fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51355/51355fig4.jpg" /> Figure 4. Enregistrement à partir volée. (A) labelle de préparation à la mouche sur la gauche avec l&#39;électrode d&#39;enregistrement aligné pour le contact sur ​​la droite, à fort grossissement. (B) électrode d&#39;enregistrement et sensille unique sur labelle en contact, à fort grossissement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <ol><li> Toujours à la terre en touchant une surface métallique de la table anti-vibration ou plate-forme avant de toucher l&#39;équipement pendant le processus d&#39;enregistrement! Remarque: Il est extrêmement important de ne pas livrer une charge statique à l&#39;headstage car cela peut endommager les circuits. </li><li> Sécurisé électrode de référence détenteur de micromanipulateur monté sur la table de l&#39;air de recording plate-forme. Position un lobe de labelle dans le champ de vision du microscope, à fort grossissement (typiquement au moins 140X), et en ligne avec le courant d&#39;air humidifié. </li><li> Mettez flux d&#39;air humidifié, ordinateur, DAS, et l&#39;amplificateur. Logiciel d&#39;acquisition ouvert. </li><li> Rincer et remplir le verre électrode d&#39;enregistrement avec exhausteur de goût désiré. <ol><li> Rincer verre électrode d&#39;enregistrement avec de l&#39;eau ultrapure à l&#39;aide d&#39;une seringue et un tube en plastique 28 pour tirer de petites quantités d&#39;eau à travers le tube au moins dix fois. </li><li> Rincer électrode d&#39;enregistrement avec exhausteur de goût, au moins cinq fois. Remplir l&#39;électrode d&#39;enregistrement d&#39;environ un tiers à la moitié pleine avec exhausteur de goût et retirer du tube. S&#39;il ya des bulles d&#39;air, appuyez sur pour libérer ou simplement remplir l&#39;électrode. </li><li> Faites glisser électrode sur fil d&#39;argent de la headstage rapidement et en douceur afin de ne pas introduire de bulles d&#39;air. </li></ol></li><li> Stimuler unique sensille avec électrode d&#39;enregistrement exhausteur de goût remplie. <ol><li> Utilisez le micromanipulateur pour amener l&#39;électrode d&#39;enregistrement aligné avec sensille d&#39;intérêt. </li><li> Appuyer sur une pédale pour déclencher le mode de l&#39;amplificateur d&#39;acquisition. </li><li> Avancer l&#39;électrode d&#39;enregistrement avec le bouton de réglage fin de micromanipulateur soigneusement jusqu&#39;à ce qu&#39;il entre en contact avec la pointe de sensille et l&#39;enregistrement commence. </li><li> Retirer l&#39;électrode après 1-2 sec. </li><li> Répétez l&#39;étape 3.5 avec d&#39;autres sensilles, si désiré. Remarque: Attendez au moins 1 minute entre les présentations à la même sensille. Si l&#39;enregistrement avec un exhausteur de goût unique pendant une période de temps prolongée, la solution d&#39;exhausteur de goût peut sécher la solution et à la pointe peut devenir plus concentré. Cela peut être résolu en mettant en contact en douceur de la pointe de l&#39;électrode de verre avec du papier lisse pour éliminer une petite quantité de liquide par capillarité. </li></ol></li><li> Pour enregistrer les réponses à un autre exhausteur de goût, rincer et l&#39;électrode d&#39;enregistrement de la charge avec une nouvelle exhausteur de goût et répétez l&#39;étape 3.4. Remarque: Bien rincer l&#39;électrode entre tastants est absolutely cruciale pour éviter la contamination croisée. </li><li> Enregistrer les fichiers de données périodiquement des informations d&#39;identification, telles que la date, le génotype, et sapides. Remarque: Il est important de garder une trace écrite de l&#39;exhausteur de goût et de l&#39;identité de chaque sensille présentation pendant la session d&#39;enregistrement pour l&#39;analyse des données. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Sensilla Labellar varient dans la facilité d&#39;enregistrement en raison de différences de morphologie et de l&#39;organisation anatomique. Parfois, un sensille ne répond pas à toutes les substances sapides, même celui qui est connu pour déclencher une réponse positive. La fréquence à laquelle cela se produit varie en fonction du type sensille. L sensilles sont les plus constamment réceptifs et sont relativement faciles d&#39;accès en raison de leur longueur. En général, S sensilles sont toujours sensibles, mais leur c...

Le sens du goût permet un insecte de détecter une vaste gamme de produits chimiques solubles et joue un rôle important dans l&#39;acceptation d&#39;une substance nutritive, ou le rejet d&#39;un être nocif ou toxique. Le goût est aussi pensé pour jouer un rôle dans le choix du conjoint, grâce à la détection des phéromones 1-5. Ces fonctions importantes et diversifiées ont rendu le système de goût insecte une cible irrésistible de l&#39;enquête sur la façon dont les systèmes sensoriels traduisent les signaux environnementaux en sorties comportementales pertinentes. L&#39;unité principale du système de goût de Drosophila melanogaster est le poil de goût, ou sensille. Molécules entrent dans le sensille via un pore à son extrémité 2,6. Sensilles se trouvent sur ​​le labelle, les jambes, le bord de l&#39;aile, et le pharynx 6. Sur le labelle, le nombre et l&#39;emplacement des sensilles est stéréotypés. Il existe trois classes morphologiques de sensilles fonction de la longueur: long (L), intermédiaire (I), et court (S<html> ) Sensilles 7,8. Chaque sensille contient soit deux (de type I) ou quatre (L-et S-type) neurones récepteurs gustatifs (GRNS 9). Différents GRNS répondre aux différentes catégories de stimuli du goût: amer, le sucre, le sel et l&#39;osmolarité 7,10 et expriment différents sous-ensembles de récepteurs gustatifs 8,11-13. Seulement I et de type S sensilles contiennent GRNS amères sensible 8,10. Le projet GRNS au ganglion subesophageal (SOG) et leur activation par des molécules de goût est relayé vers le système nerveux central supérieur pour le décodage, ce qui entraîne une réponse comportementale 6. Le nombre relativement faible de neurones et la susceptibilité à l&#39;analyse moléculaire et comportementale rendre le système de goût Drosophila un excellent modèle pour l&#39;étude des systèmes gustatives en général. La relative facilité avec laquelle le système peut être manipulé par une mutation génétique ou le système d&#39;expression GAL4 UAS est aussi un outil précieux 14,15. ontenu &quot;&gt; Parce que ces sensilla dépassent de la surface de la labellum, ils sont d&#39;excellentes cibles pour l&#39;électrophysiologie. L&#39;allumage des GRNS peut être contrôlée en utilisant l&#39;enregistrement extracellulaire. Historiquement, le procédé d&#39;enregistrement de paroi latérale, qui utilise une électrode de verre inséré dans le sensille pour enregistrer l&#39;activité neuronale, 26 a été la méthode d&#39;enregistrement d&#39;extrémité, qui mesure la réponse des neurones avec une électrode utilisée. Cependant, cette méthode est techniquement difficile à réaliser, et il est difficile d&#39;enregistrer pendant longtemps à partir de chaque préparation. que délivre simultanément un exhausteur de goût, devenu depuis la méthode de choix 9,16. Il a été utilisé pour étudier le système de goût de Drosophila melanogaster 8,10,17,18 ainsi que d&#39;un certain nombre d&#39;autres espèces d&#39;insectes 19-23. Elle a été grandement facilité par le développement de l&#39;amplificateur tastePROBE, qui a surmonté l&#39;un des principaux inconvénients de la méthode d&#39;enregistrement de pointe en compensantla grande différence de potentiel entre l&#39;électrode de référence et la sensille d&#39;insecte, ce qui permet les potentiels d&#39;action de GRN à être enregistrées sans amplification excessive ou de filtrage 24. Un autre développement important a été l&#39;utilisation de tricholine citrate comme électrolyte enregistrement 25. STC supprime les réponses du GRN de l&#39;osmolarité sensible et ne stimule pas la GRN sensible au sel, faire les réponses générées par tastants amères et le sucre beaucoup plus facile à analyser 25. Nous décrivons ici l&#39;enregistrement de la drosophile labellar sensilles de pointe est actuellement effectué dans le laboratoire Carlson. Ce protocole explique comment établir une plate-forme appropriée de l&#39;électrophysiologie, la façon de préparer la volée, et la façon d&#39;effectuer des enregistrements de goût. Nous présentons également des données représentatives obtenues par l&#39;enregistrement de sous-ensembles de la drosophile sensilles, ainsi que certains problèmes courants et les solutions possibles qui peuvent survenir lors de l&#39;utilisation de cettetechnique.

<table><tbody><tr><td>Microscope stéréo zoom</td><td>Olympus</td><td>SZX12 DFPLFL1.6x PF oculaires : WHN10x-H/22</td><td>capable d’un grossissement de ~150X avec longue distance de travail support de table</td></tr> Table <tr><td>antivibratoire</td><td>Kinetic Systems</td><td>BenchMate2210</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateurs</td><td>Narishige</td><td>NMN-21</td><td></td></tr><tr><td>Supports magnétiques</td><td>ENCO</td><td>Modèle #625-0930</td><td></td></tr><tr><td>Référence Porte-électrode</td><td>Harvard Appareil</td><td>ESP/W-F10N</td><td>Peut être monté sur une pipette sérologique de 5 ml pour une portée étendue</td></tr><tr><td>Silver Wire</td><td>World Precision Instruments</td><td>AGW1510</td><td>0,3-0,5 mm de diamètre</td></tr><tr>Support <td></td><td></td><td>d’autoclave</td><td>générique</td></tr><tr><td>Sortie Tube</td><td></td><td></td> en plastique <td>générique, 1 cm</td></tr><tr><td>de diamètre Tube en plastique flexible</td><td>Nalgene</td><td>8000-0060</td><td>VI grade 1/4 de diamètre intérieur&nbsp ;</td></tr><tr>Fiole <td></td><td></td><td>conique de 500 ml</td><td>générique, avec bras latéral</td></tr><tr><td>Pompe d’aquarium</td><td>Jardins aquatiques</td><td>Pompe à air 2000</td><td></td></tr><tr><td>Source de lumière à fibre optique</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>Fiber-Lite 2100</td><td></td></tr><tr><td>Carte blanche/Papier</td><td>Whatman</td><td>1001-110</td><td></td></tr><tr><td>Système d’acquisition numérique</td><td>Syntech</td><td>IDAC-4</td><td>Alternative : National Instruments NI-6251 &nbsp ;</td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Syntech</td><td>DTP-1</td><td>Tasteprobe</td></tr><tr><td>Tasteprobe Amplificateur</td><td>Syntech</td><td>DTP-1</td><td>Tasteprobe</td></tr><tr><td>Alligator Clips</td><td>Grainger</td><td>1XWN7</td><td>N’importe quelle marque est fine</td></tr><tr><td>Isolé Fil</td><td></td><td></td> électrique <td>Or générique</td></tr><tr><td>Broches de connecteur</td><td>World Precision Instruments</td><td>5482</td><td></td></tr><tr><td>Ordinateur personnel</td><td>Dell</td><td>Vostro</td><td>Vérifiez la compatibilité avec le système d’acquisition numérique et les logiciels</td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition</td><td>Syntech</td><td>Autospike</td><td>Autospike fonctionne avec IDAC-4 ; vous pouvez également utiliser LabView avec</td>la</tr><tr><td>feuille d’aluminium NI-6251 et/ou la cage de</td><td></td><td></td> Faraday <td>Blindage contre le bruit électromagnétique</td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de pipette</td><td>Instrument Sutter Company</td><td>Modèle P-87 Pluming/Brown Micropipette Puller</td><td></td></tr><tr><td>Beadle and Ephrussi Ringer Solution</td><td></td><td></td><td>Voir la recette dans la section protocole</td></tr><tr><td>Citrate de tricholine, 65 %&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>T0252-100G</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Olympus</td><td>VMZ 1x-4x</td><td>Capable d’un grossissement de 10-40X</td></tr><tr><td>Seau</td><td></td><td></td> à glace <td>Générique</td></tr><tr><td>p200 Pointes</td><td></td><td></td> de pipette <td>Aiguille spinale générique</td></tr><tr><td></td><td>Terumo</td><td>SN*2590</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Seringue</td><td>Beckton-Dickenson</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>Mouche Aspirateur</td><td></td><td></td><td>Assemblé à partir de pointes de pipette P1000, d’un tube en plastique flexible et d’un treillis</td></tr><tr>Pâte <td></td><td></td><td>à modeler</td><td>Pince générique</td></tr><tr><td></td><td>Outils de science fine Par Dumont</td><td>11252-00</td><td>#5SF (pointes super-fines)</td></tr><tr><td>Seringue de 10 ml</td><td>Beckton-Dickinson</td><td>301029</td><td></td></tr><tr><td>Tube en plastique</td><td>Tygon</td><td>R-3603</td><td></td></tr></tbody></table>

enregistrement électrophysiologique de<em&gt; drosophila</em&gt; labellar goût sensilles

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

La réponse du périphérique goût des insectes peut être puissamment étudié avec des techniques électrophysiologiques. La méthode décrite ici permet au chercheur de mesurer les réponses gustatives directe et quantitative, reflétant l&#39;entrée sensorielle que le système nerveux des insectes reçoit de stimuli du goût de son environnement. Ce protocole décrit les principales étapes de l&#39;exécution de cette technique. Les étapes essentielles de l&#39;assemblage d&#39;un appareil de l&#39;électrophysiologie, tels que la sélection de l&#39;équipement nécessaire et un environnement approprié pour l&#39;enregistrement, sont délimitées. Nous décrivons également comment se préparer à l&#39;enregistrement en faisant électrodes de référence et d&#39;enregistrement appropriés et des solutions exhausteur de goût. Nous décrivons en détail la méthode utilisée pour la préparation de l&#39;insecte par insertion d&#39;une électrode de référence de verre dans la volée pour immobiliser la trompe. On montre les traces des impulsions électriques alimentées par les neurones gustatifs en réponse à un sucre et d&#39;un composé amer. Aspects du protocole sont techniquement difficile et nous incluons une description détaillée de certaines difficultés techniques communes que l&#39;on peut rencontrer, comme l&#39;absence de signal ou de bruit excessif dans le système, et les solutions possibles. La technique a ses limites, comme l&#39;impossibilité de livrer stimuli temporellement complexes, observer fond de tir juste avant stimulus livraison, ou utiliser des composés de goût insolubles dans l&#39;eau facilement. Malgré ces limites, cette technique (y compris les variations mineures mentionnées dans le protocole) est une procédure standard largement accepté pour l&#39;enregistrement des réponses neuronales Drosophila goûter composés.

La figure 5A montre la réponse d&#39;un L sensille à un sucre, le saccharose. Le même sensille ne répond pas à un composé amer, la berbérine. Figure 5B montre que l&#39;sensille de type I, qui contient un neurone sensible amer, affiche de plus grands pics d&#39;amplitude en réponse à la berbérine, et de plus petites pointes d&#39;amplitude en réponse au saccharose. L sensilles afficher une réponse de fond minimale pour le contrôle solvant, TCC, alors que je sensilles afficher pratiqueme...

Ce protocole décrit l&#39;enregistrement extracellulaire des réponses potentielles d&#39;action tirés par les neurones gustatifs labellar chez la drosophile.

Enregistrement électrophysiologique De<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Goût Sensilles

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer les réponses des sensilles gustatives individuelles sur le labium de drosophile. Cela est réalisé en premier lieu en construisant un dispositif d'électrophysiologie et en configurant tout l'équipement nécessaire. La deuxième étape consiste à préparer la mouche en vue de l'enregistrement.Ensuite, un lum individuel est stimulé avec un composé gustatif tandis que la réponse neuronale est enregistrée simultanément. Enfin, l'enregistrement électrophysiologique par électrode de pointe réalisé sur des silla individuelles marquées permet de montrer les réponses des illa gustatives à différents composés gustatifs. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de préparation de la drosophile peuvent être techniquement délicates et difficiles à apprendre.Dans cette procédure, collectez les mouches ELO nouvellement écloses à partir de cultures bien entretenues. Ensuite, faites-les vieillir de cinq à dix jours dans des flacons de culture frais avant l'enregistrement. Avant la préparation de la mouche, refroidissez la plaque du microscope sur de la glace pendant 15 à 30 minutes. Ensuite, remplissez la pipette arrière de l'électrode de référence en verre avec la solution B et e.Tapez doucement pour faire sortir les bulles éventuelles sous le microscope stéréo. Utilisez la pince pour casser une petite section à l'extrémité. Utilisez ensuite l'action capillaire pour extraire avec le tissu toute bulle restante.Ensuite, faites glisser l'électrode de référence remplie de B et de E sur le fil du support d'électrode, et pour éviter d'introduire des bulles d'air par la suite, aspirez une drosophile dans une pointe de pipette P 200. Placez-la dans un seau à glace et refroidissez pendant 30 secondes à une minute. Ensuite, retirez la plaque du microscope de la glace et positionnez-la sous le microscope après avoir essuyé l'humidité.Tapotez doucement la mouche hors de l'embout de pipette sur la lame du microscope sous faible grossissement. Retirez les quatre pattes à l'aide d'une paire de forceps tout en maintenant la mouche stable avec l'autre paire de forceps. Placez la mouche sur son côté ventral, le côté dorsal orienté vers le haut.Veillez toujours à éviter de toucher l'étiquette beum avec la pince pendant le processus de préparation afin de minimiser les dommages mécaniques. Tout en maintenant la drosophile en place à l’aide d’une paire de pinces, insérez l’électrode de référence au niveau de la ligne médiane du thorax dorsal postérieur, à environ 45 degrés par rapport à la direction de la tête. Fixez ensuite le support de l’électrode de référence à l’aide d’argile modelable de manière à ce que la drosophile reste visible sous le microscope à fort grossissement. Positionnez et orientez l’électrode en verre au niveau de son col et de sa tête, puis faites glisser la drosophile vers le support de l’électrode de référence à l’aide de deux paires de pinces.Maintenant, étendez délicatement le proboscis avec une paire de forceps et faites glisser la drosophile plus bas le long de l'électrode de référence en verre jusqu'à ce que l'extrémité de l'électrode pénètre dans le labellum et que le proboscis soit complètement étendu. À cette étape, fixez le support de l'électrode de référence au micromanipulateur monté sur la table anti-vibrations. Placez un lobe du labellum dans le champ de vision du microscope en forte augmentation et alignez-le avec le flux d'air humidifié.Ensuite, allumez le système d'acquisition numérique ou DAS (Humidified Airstream Computer Digital Acquisition System) et l'amplificateur. Puis, à l’aide d’une seringue et d’un tube en plastique, aspirez une petite quantité d’eau ultrapure à travers le tube au moins dix fois. Pour rincer l’électrode de enregistrement en verre, rincez ensuite l’électrode d’enregistrement avec du TAST au moins cinq fois.Ensuite, remplissez l'électrode d'enregistrement environ au tiers ou à la moitié avec le goût et retirez-la du tube. S'il y a des bulles d'air, tapez doucement pour les éliminer ou remplissez simplement à nouveau l'électrode. Faites maintenant glisser rapidement et sans à-coups l'électrode sur le fil d'argent de l'étage de tête.Afin d'éviter d'introduire des bulles d'air susceptibles de stimuler le sens unique, utilisez d'abord le micromanipulateur pour aligner l'électrode d'enregistrement avec le sens d'intérêt. Ensuite, appuyez sur la pédale pour activer le mode d'acquisition de l'amplificateur. Puis, faites avancer prudemment à l'aide du bouton de commande fine du micromanipulateur l'électrode d'enregistrement remplie vers le sens jusqu'au contact avec l'extrémité du sens, et commencez l'enregistrement.Retirez l'électrode après une à deux secondes. Répétez la procédure avec d'autres illa et attendez au moins une minute entre chaque présentation au même lum. Si l'enregistrement se fait avec un goût unique et pendant une période prolongée, le goût et la solution peuvent s'assécher, et la solution dans l'embout peut devenir plus concentrée.On peut remédier à cela en touchant délicatement l'extrémité de l'électrode en verre avec du papier lisse afin de retirer une petite quantité de liquide par action capillaire, puis enregistrer les réponses à un autre goût, rincer et charger l'électrode d'enregistrement avec un nouveau goût, et répéter la procédure. Enregistrez régulièrement les fichiers de données avec des informations d'identification telles que la date, le génotype et le goût. Cette figure montre la réponse d'un centum à un goût sucré du saccharose.Le même centum ne répond pas au composé amer berbérine, et cette figure montre qu'un sens de type oculaire, qui contient un neurone sensible à l'amertume, présente des pics d'amplitude plus élevée en réponse à la berbérine et des pics d'amplitude plus faible en réponse au saccharose. Illustrés ici, des résultats électrophysiologiques suboptimaux représentatifs. Ce tracé représente une absence complète de signal.Ceci est le bruit de 50 ou 60 hertz provenant de sources électriques externes, et ceci est le bruit stochastique. Ce tracé indique que le neurone sensoriel Meno se déchargeait seul, tandis que le neurone récepteur gustatif amer et le neurone sensoriel Meno étaient tous deux actifs. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'enregistrer les réponses neuronales des Oph Atory Silla sur le labum.

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