Une stratégie pour sensibles à grande échelle quantitatives métabolomique

L’objectif global de cette procédure est d’étudier le profilage métabolique dans les cellules en culture. Ceci est accompli en extrayant d’abord les métabolites polaires des cellules. La deuxième étape consiste à reconstituer les extraits cellulaires dans de l’eau et à transférer les échantillons dans des flacons LC.

Ensuite, les échantillons sont injectés dans l’instrument lc QE MS, qui a été étalonné et les données brutes sont enregistrées dans l’ordinateur à l’étape finale. Les pics de métabolite sont extraits des données brutes à l’aide d’un logiciel commercial, et les pics inconnus sont recherchés dans une base de données de masse à haute résolution. Bien que ce maître puisse donner un aperçu des niveaux relatifs de métabolites dans le SRAS, il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que le sérum ou les tissus.

Tout d’abord, préparez 500 millilitres de phase A mobile, qui est de 20 millimolaires d’acétate d’ammonium et de 15 millimolaires d’hydroxyde d’ammonium dans 3 % d’acéto, de nitrile et d’eau. Après avoir légèrement bouché le flacon, sonicez la solution dans un bain-marie pendant 10 minutes sans chauffer. Ensuite, dissolvez cinq milligrammes d’acétate de fluor de sodium et d’acide dans cinq millilitres d’eau pour obtenir une concentration finale d’un milligramme par millilitre.

Dissoudre ensuite le diazinon dans du méthanol pour obtenir une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre. Pour préparer un millilitre de solution d’étalonnage négative de faible masse, mélangez 960 microlitres de solution d’étalonnage thermo-négatif avec 20 microlitres de solution d’acétate de fluor de sodium et d’acide homovanillique. Pour faire un millilitre de solution d’étalonnage positive de faible masse, mélangez 990 microlitres de solution d’étalonnage thermo-positif et 10 microlitres de solution de diazinon.

Après avoir effectué un étalonnage de masse standard en mode positif, ajustez la plage de balayage à 60 à 900 rapport masse/charge dans le panneau de commande de l’instrument et appliquez une dissociation induite par collision de source de 25 électronvolts. Entrez des ions d’étalonnage personnalisés, et une fois que la source d’ions est stable, démarrez l’étalonnage personnalisé dans la page de réglage. Passez la polarité en mode négatif après avoir effectué un étalonnage de masse standard en mode négatif, ajustez la plage de balayage à 60 à 900 rapport masse/charge dans le panneau de commande de l’instrument et appliquez une dissociation induite par collision de source de 35 électronvolts.

Entrez des ions d’étalonnage personnalisés, et une fois que la source d’ions est stable, démarrez l’étalonnage personnalisé. Dans la page de réglage, équipez l’instrument QE MS de la sonde d’ionisation par électro-pulvérisation chauffée ou HESI en le fixant au niveau C, puis en le connectant aux entrées d’azote gazeux, au câble du vaporisateur et aux câbles de tension. Sur la page de réglage de l’ordinateur, définissez les paramètres de réglage appropriés pour la sonde.

Réglez la température capillaire à 320 degrés Celsius et la lentille S à 55. Ensuite, dans le programme de méthode, créez une méthode d’analyse complète à l’aide des valeurs suivantes. Établissez la méthode de chromatographie en saisissant les informations de gradient linéaire.

Utilisez une colonne intermédiaire pour la séparation du composé à température ambiante. À ce stade, préparez un solvant d’extraction en mélangeant manuellement 40 millilitres de méthanol et 10 millilitres d’eau dans un 50 millilitres. Deux. Lorsqu’il s’agit d’un cancer du côlon précédemment cultivé, les cellules H CT atteignent 80 % de confluence.

Aspirez rapidement le milieu et placez la plaque à six puits sur de la glace sèche. Ajoutez ensuite immédiatement un millilitre de solvant d’extraction dans chaque puits et transférez la plaque dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Après avoir sorti la plaque du congélateur, 15 minutes plus tard, placez-la sur de la glace sèche et grattez les cellules dans le solvant.

Transférez la solution de chaque puits dans trois tubes einor de 1,7 millilitre et centrifugez les échantillons à une vitesse de 20 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Après la centrifugation, transférez le surnageant dans deux nouveaux tubes einor. Ensuite, séchez les échantillons dans un vide rapide.

Une fois les échantillons secs, conservez-les dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius. Après avoir sorti les échantillons du congélateur pour analyse, laissez-les atteindre la température de la glace. Ajoutez ensuite 20 microlitres d’eau glacée et vortex les échantillons pour dissoudre les métabolites.

Ensuite, centrifugez les échantillons à 20 000 fois G à quatre degrés Celsius. Pendant deux minutes, transférez le SUPERNAT dans des flacons lc et injectez cinq microlitres des échantillons dans l’instrument lc QES pour analyse. Une fois l’étalonnage correctement effectué sur l’instrument QE MS, équilibrez la colonne LC pendant cinq minutes avec 85 % de la phase B mobile à un débit de 0,15 millilitre par minute.

Ensuite, configurez la séquence d’échantillons dans un ordre aléatoire pour répartir les fluctuations introduites par le LCMS sur chaque échantillon et assurer une comparaison plus précise entre les différents échantillons. Après six échantillons, ajoutez un cycle de lavage, suivi d’un échantillon blanc pour évaluer le bruit de fond du système et les niveaux de transfert. Enregistrez la séquence et lancez l’exécution de la séquence.

Une fois que la colonne lc indique une pression stable proche de 400 PSI, après l’exécution des deux premiers échantillons de la séquence, vérifiez les pics de ces chromatogrammes pour détecter la présence de métabolites inconnus afin de vous assurer que la séquence d’échantillons se déroule sans problème. Une fois tous les échantillons de la séquence terminés, effectuez l’analyse des données sur un ordinateur distinct. Choisissez la méthode d’alignement des pics et d’extraction du cadre pour les petites molécules sur un logiciel disponible dans le commerce.

Chargez ensuite les données brutes lc ms et regroupez-les en fonction des types d’échantillons. Choisissez des échantillons au milieu de la séquence d’exécution comme échantillon de référence de chromatographie pour l’alignement des pics, et choisissez un groupe comme groupe de rapport ou pour le calcul de la modification complète. Téléchargez ensuite une graine de trame, y compris les métabolites connus pour l’analyse des métabolites ciblée avec les données collectées et la graine de trame correspondante.

Ensuite, choisissez le balayage spectral complet en mode positif ou négatif et enregistrez ce fichier de traitement de données dans le même dossier que les données brutes. Désactivez la fonction de recherche dans la base de données et exécutez le flux de travail. Exportez ensuite les données du processus sous forme de feuille Excel contenant la surface maximale de chaque image.

Pour une analyse non ciblée des métabolites, choisissez la méthode d’extraction des composants. Chargez l’échantillon de données brutes et trois échantillons vides pour la soustraction en arrière-plan. Après ce groupe, les données brutes et définissez les échantillons de référence comme décrit précédemment.

Définissez le seuil du composant sur 10 puissance cinquième. Utiliser une base de données de métabolome humain pour l’identification de composés inconnus. Après avoir enregistré ce fichier de traitement, désactivez la fonction de recherche dans la base de données et démarrez le flux de travail.

Une fois le traitement des données terminé, utilisez des coefficients de variation ou des filtres CV pour supprimer les composants avec un CV élevé dans des échantillons répétés et des filtres d’intensité. Pour supprimer manuellement les composants détectés au niveau du bruit, passez en revue chaque composant et choisissez ceux avec un pic bien défini ou une différence relativement importante dans différents types d’échantillons pour la recherche dans la base de données. Enfin, exportez les données avec les occurrences dans la base de données.

La précision des données métabolomiques dépend fortement de la performance de l’instrument lc QEMS pour évaluer si l’instrument fonctionne en bon état et si la méthode appliquée est appropriée. Plusieurs pics lc de métabolites connus sont extraits de la chromatographie ionique totale, comme le montre ici. Les métabolites polaires, y compris les acides aminés, la glycolyse, les intermédiaires, le TCA, les nucléotides intermédiaires, les vitamines A, TP et NADP ont une bonne rétention sur la colonne et de bonnes formes de pics dans les conditions actuelles de lc.

Pendant ce temps, un test d’erreur de masse est effectué dans les 24 heures suivant l’étalonnage de faible masse, comme illustré. Ici, l’erreur de masse est évaluée en comparant le rapport masse/charge détecté au rapport théorique masse/charge des métabolites ciblés. Ici, les métabolites ciblés ont un rapport masse/charge allant de 74 à 744.

L’axe des Y représente ici le pourcentage cumulé de métabolites dans une certaine plage d’erreur de masse. La courbe bleue montre le résultat de zéro à 12 heures, tandis que la courbe de couleur rouge montre les données collectées de 12 à 24 heures après l’étalonnage. Plus de 90 % des métabolites se situent à moins de cinq parties par million d’erreur de masse, ce qui signifie que la méthode d’étalonnage de faible plage de masse développée ici est suffisante pour maintenir une erreur de masse de cinq parties par million pour la détection de faible plage de masse.

Une autre question à résoudre est la sensibilité de l’instrument avec la méthode actuelle et la configuration de l’instrument. Une dilution en série d’échantillons en trois exemplaires à partir d’une boîte de Pétri de 10 centimètres a été effectuée cinq fois avec un facteur de dilution de six, ce qui a donné six concentrations différentes d’échantillons. Une liste ciblée est utilisée pour évaluer le nombre de métabolites détectés à différentes concentrations d’échantillon.

Les résultats présentés ici indiquent que le nombre optimal de métabolites ciblés détectés est compris entre 2,78 fois 10 puissance cinquième et 1,67 fois 10 puissance 10 unité unité six cellules, tandis qu’une fois fois 10 unité unité sept cellules donne un nombre inférieur de métabolites détectés, ce qui est dû aux effets de suppression ionique. Ce résultat indique que la quantité optimale de cellules à extraire pour cette analyse est à peu près celle d’un puits dans une plaque à six puits. Pour l’analyse non ciblée des métabolites, un seuil de CV de 20 % et une valeur d’intensité moyenne de 10 puissance septième sont utilisés pour filtrer le tableau des composants.

Les valeurs seuils CV peuvent être augmentées, tandis que les valeurs d’intensité moyennes doivent être réduites pour inclure plus de pics. Après vérification manuelle des pics, les composants avec de bonnes formes sont sélectionnés et recherchés dans la base de données du métabolome humain. Les résultats des données collectées en mode positif sont répertoriés ici, tandis que les résultats du mode négatif sont répertoriés ici. Certains des métabolites identifiés ici chevauchent les métabolites de la liste ciblée, tels que le glutathion et la proline.

D’autres métabolites absents de la liste ciblée sont également explorés, tels que le méthyl glyoxal, qui peut être dérivé de la glycolyse et d’un pto, deux glycérols ELE SN, trois phosphocholines, qui est détecté en mode positif avec un temps de rétention de 3,2 minutes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’extraire les polymétabolites du SRAS en culture, puis d’utiliser RC QES pour mesurer les niveaux métabolisés relatifs dans différents échantillons. Merci d’avoir regardé.