L'utilisation d'un α-bungarotoxine Reliure Tag du site à étudier récepteur GABA A membrane localisation et le trafic

L'objectif général de cette procédure est de mesurer la localisation membranaire et l'endocytose des récepteurs GABAA dans les neurones hippocampiques. Cela est réalisé en transfectant d'abord les neurones hippocampiques avec une sous-unité du récepteur GABAA marquée, puis en laissant les neurones en culture se développer dans l'incubateur. La deuxième étape consiste à marquer les récepteurs GABAA situés à la surface cellulaire à l'aide d'une immunoglobuline alpha bungalow toin couplée à un fluorochrome Alexa die.

Ensuite, les neurones sont incubés pendant différentes durées afin de permettre l'endocytose des récepteurs marqués. La dernière étape consiste à fixer les échantillons aux moments appropriés et à réaliser une immunomarquage à l'aide d'un anticorps anti-GFP afin d'observer l'ensemble des récepteurs marqués. Enfin, une microscopie confocale est utilisée pour mettre en évidence les modifications de la localisation à la surface cellulaire et de l'endocytose des récepteurs gabaa marqués, en utilisant des approches d'imagerie fixée ou en temps réel.

Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans le domaine du trafic des récepteurs, telles que l'effet du lien du ligand sur les taux d'endocytose et d'insertion des récepteurs, et si différents ligands et modulateurs peuvent influencer le recyclage et la dégradation des récepteurs. Bien que cette méthode ait été utilisée principalement pour étudier les canaux ioniques ligandés et les récepteurs couplés aux protéines G dans le contexte du système nerveux, elle peut également être appliquée à l'étude de la localisation dynamique et du trafic d'autres protéines membranaires dans des cultures cellulaires et des cellules primaires issues de tissus variés. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés pour deux raisons.

Premièrement, créer des constructions fonctionnelles ; deuxièmement, acquérir la pratique et l'expérience nécessaires pour traiter simultanément plusieurs points temporels. Pour commencer, préparez quatre à cinq lamelles rondes en verre revêtues de poly-L-lysine dans chaque boîte de culture tissulaire de 3,5 centimètres, comme décrit dans le protocole écrit. Ensuite, transfectez des neurones fraîchement dissociés le jour de la culture avec un à quatre microgrammes d'ADN de construction préparé en version maxi par plaque.

Les neurones transfectés sur les lamelles recouvertes de poly-lysine à une densité finale d'environ 200 000 neurones par boîte de 3,5 centimètres. Remplacer le milieu quatre à 24 heures après la préparation des cultures neuronales. Puis laisser les neurones se développer dans l'incubateur jusqu'à 14 à 17 jours in vitro ou jusqu'au stade souhaité pour réaliser le test d'endocytose.

Réglez d'abord un dispositif de chauffage et de refroidissement de banc à 16 degrés Celsius. Refroidissez les amas extracellulaires, la solution saline tamponnée ou le HBS à 16 degrés Celsius dans un bain-marie. Transférez les boîtes de neurones sur la plaque en aluminium à 16 degrés Celsius et laissez refroidir pendant cinq minutes.

Retirer le milieu et le remplacer par un millilitre de HBS à 16 degrés Celsius contenant 150 micromolaire de deux Bo Rine pendant deux minutes. Ensuite, retirer le milieu dans un contenant à déchets étiqueté et le remplacer par un millilitre de HBS à 16 degrés Celsius contenant deux bo kérine et de la toxine alpha bungalow. Incuber avec Alexa 5 9 4 à 16 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Après l'incubation, transférez le milieu dans un récipient étiqueté pour déchets et rincez les boîtes trois fois avec deux millilitres de tampon HBS à 16 degrés Celsius pour des expériences d'acquisition d'images en série destinées à l'étude de l'endocytose des récepteurs, en utilisant une boîte de culture de 3,5 centimètres à fond en verre. Placez la boîte sur une platine chauffée du microscope et commencez l'acquisition d'images à l'aide d'un microscope confocal ou turf. Préparez les lames couvre-objets fixées.

Transférez les lamelles du point zéro (T = 0) dans une boîte contenant du paraformaldéhyde 4 %, du saccharose 4 % à température ambiante, pendant 20 minutes pour les autres points temporels. Remplacez le HBS par du milieu conditionné équilibré à 37 degrés Celsius, puis remettez au thermostat pour l’endocytose à 37 degrés Celsius aux points temporels requis. Retirez les boîtes de l’incubateur et rincez rapidement deux fois avec deux millilitres de solution tampon saline au phosphate à température ambiante, ou DPBS.

Ensuite, fixer l'échantillon dans du paraformaldéhyde 4 %, du saccharose 4 % pendant 20 minutes. Après une fixation de 20 minutes, retirer le paraformaldéhyde 4 %, le saccharose 4 % dans le contenant des déchets et rincer les boîtes deux fois avec deux millilitres de DPBS à température ambiante. Puis, incuber les lamelles à température ambiante pendant 10 minutes.

Une solution de blocage pour immunofluorescence contenant 0,2 % de Triton X-100 afin de rendre les neurones perméables et permettre la coloration immunologique anti-GFP du pool de récepteurs intracellulaires et/ou l'étiquetage d'autres protéines d'intérêt. Ensuite, éliminer la solution de blocage perméabilisante et incuber les lamelles dans une solution de blocage pour immunofluorescence sans Triton X-100 pendant 20 à 30 minutes. Réaliser l'incubation avec l'anticorps primaire des lamelles en bloc pendant plusieurs heures à température ambiante ou toute une nuit à quatre degrés Celsius après l'incubation.

Lavez les lamelles en les faisant tremper dans du DPBS pendant cinq minutes, pour un total de trois lavages. Incubez ensuite les lamelles avec les anticorps secondaires dans la solution de blocage pendant une heure à température ambiante après une heure. Lavez les lamelles trois fois avec du DPBS comme précédemment.

Ensuite, montez chaque lame en éliminant l'excès de liquide à l'arrière de la lame avec un papier absorbant de laboratoire, puis en inversant la lame sur quatre microlitres de milieu de montage déposés sur une lame de verre. Effectuez l'acquisition d'images en microscopie confocale en aveugle par rapport à la condition expérimentale, en utilisant un objectif à immersion en huile de 60 x à ouverture numérique 1,49.

En utilisant les mêmes paramètres d'acquisition d'image, acquérez des images en simple section Z mettant au point le corps cellulaire neuronal et plusieurs prolongements dendritiques, puis quantifiez la toxine alpha-bungalow, le signal fluorescent Alexa et la coloration immuno de GFP le long de 20 micromètres de trois à quatre dendrites proximales par neurone, en appliquant le même seuil pour l'analyse de toutes les données d'endocytose. Analysez les données provenant de 10 à 12 neurones pour chaque point temporel. Répétez l'expérience avec plusieurs cultures neuronales indépendantes.

Les axones GABAergiques établissent des contacts inhibiteurs sur les dendrites des neurones pyramidaux. Les terminaisons pré-synaptiques inhibitrices sont identifiées par le transporteur vésiculaire d'acides aminés inhibiteurs, qui charge l'acide gamma-aminobutyrique (GABA) et la glycine dans les vésicules synaptiques. Les récepteurs GABA_A sont situés en regard étroit des sites de libération du neurotransmetteur, ancrés par l'échafaudage post-synaptique inhibiteur protéine gein. Les images présentées montrent des neurones exprimant alpha deux phg F-P-B-B-S, avec les récepteurs GABA_A à la surface marqués par la toxine bungarotoxine Alexa 594, suivie d'une immunomarquage pour la population totale de récepteurs à l'aide d'un anticorps anti-GFP en vert, et soit la protéine échafaudage post-synaptique inhibitrice gein, soit le transporteur vésiculaire d'acides aminés inhibiteurs.

Ici, l'endocytose des récepteurs GABA A contenant l'alpha deux et des neurones hippocampiques à 15 jours in vitro est montrée en présence de toxine alpha bungalow. Les mesures de fluorescence de processus dendritiques individuels, telles que présentées dans les panneaux, sont normalisées par rapport au niveau d'expression du construit à l'aide d'anticorps anti-GFP. La comparaison finale des points temporels est réalisée par normalisation par rapport à la mesure à T égale zéro.

La quantification de l'internalisation des récepteurs sur une période de 60 minutes à partir des variations du signal fluorescent au fil du temps est mieux décrite par une exponentielle simple. Une approche alternative consiste à suivre l'endocytose des récepteurs dans un seul neurone par microscopie confocale en temps réel avec acquisition séquentielle d'images. La fluorescence ponctuelle et superposée du récepteur GABA A marqué par P-H-G-F-P et des récepteurs marqués par la toxine alpha bungalow est visible au début de l'expérience ; au cours du temps, le signal des récepteurs GABA A marqués par la toxine alpha bungalow diminue à mesure que les récepteurs s'endocytosent.

Alors que le signal P-H-G-F-P reste élevé en raison de l'insertion de nouveaux récepteurs, la légère diminution du signal P-H-G-F-P est due à des changements dans la distribution des récepteurs à la surface cellulaire et au photoblanchiment suite à cette procédure. D'autres méthodes, comme les tests d'insertion de toxine bungalow, peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires, telles que les taux d'insertion des récepteurs sous différents traitements. Cette technique permet d'évaluer comment l'activité cellulaire, des domaines protéiques spécifiques, des agonistes et d'autres modulateurs peuvent modifier le renouvellement des récepteurs dans des neurones vivants, d'autres cellules et tissus.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser la toxine alpha-bungarotoxine conjuguée à des colorants Alexa en combinaison avec des techniques d'immunofluorescence classiques pour quantifier la localisation des récepteurs membranaires dans les neurones de l'hippocampe.