Name: Préparation d’échantillons pour la microscopie à force atomique à virion unique et l’imagerie par fluorescence à super-résolution (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-02T21:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Apprenez une méthode de préparation d'échantillons pour la microscopie à force atomique et la fluorescence à super-résolution. Cette technique assure l'adhésion contrôlée des virions de virus stomatite vésiculaire pour une imagerie de haute qualité.

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Nous remercions le Dr Till Böcking pour le protocole original de préparation d’une molécule unique. 
Ce travail a été soutenu par la subvention NSF 1121972 (SS).

<ol><li>Pang, H. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virion+stiffness+regulates+immature+HIV-1+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Virion stiffness regulates immature HIV-1 entry.</a> Retrovirology. 10, 4(2013).</li>
<li>Kol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Stiffness+Switch+in+Human+Immunodeficiency+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A Stiffness Switch in Human Immunodeficiency Virus.</a> Biophys. J. 92, 1777-1783 (2007).</li>
<li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+tip%E2%80%93sample+forces+in+jumping+mode+atomic+force+microscopy+in+liquid%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Minimizing tip–sample forces in jumping mode atomic force microscopy in liquid.</a> Ultramicroscopy. 114, 56-61 (2012).</li>
<li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dynamics+of+human+adenovirus+disassembly+induced+by+mechanical+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Monitoring dynamics of human adenovirus disassembly induced by mechanical fatigue.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li>
<li>Hernando-Pérez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+Virology%3A+Direct+Measurement+of+Phage%5BTitle%5D)+AND+%22phi29+Stiffness+Provides+Evidence+of+Internal+Pressure+%28Small+15%2F2012%29.+Small%22%5BJournal%5D)">Physical Virology: Direct Measurement of Phage.</a> phi29 Stiffness Provides Evidence of Internal Pressure (Small 15/2012). Small. 8, 2365-2365 (2012).</li>
<li>Carrasco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-mediated+anisotropic+mechanical+reinforcement+of+a+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">DNA-mediated anisotropic mechanical reinforcement of a virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13706-13711 (2006).</li>
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<li>Elenko, M. P., Szostak, J. W., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+binding+experiments+on+long+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Single-molecule binding experiments on long time scales.</a> Rev. Sci. Instrum. 81, (2010).</li>
<li>van Oijen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Kinetics+of+%CE%BB+Exonuclease+Reveal+Base+Dependence+and+Dynamic+Disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Kinetics of λ Exonuclease Reveal Base Dependence and Dynamic Disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li>
<li>Böcking, T., Aguet, F., Harrison, S. C., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+a+molecular+disassemblase+reveals+the+mechanism+of+Hsc70-driven+clathrin+uncoating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 295-301 (2011).</li>
<li>Cocucci, E., Aguet, F., Boulant, S., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+First+Five+Seconds+in+the+Life+of+a+Clathrin-Coated+Pit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit.</a> Cell. 150, 495-507 (2012).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat. Methods. 5, 527-529 (2008).</li>
<li>Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin%2C+Spectrin%2C+and+Associated+Proteins+Form+a+Periodic+Cytoskeletal+Structure+in+Axons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons.</a> Science. 339, 452-456 (2013).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Hodges, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+packaging+of+polymerases+within+vesicular+stomatitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Asymmetric packaging of polymerases within vesicular stomatitis virus.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 440, 271-276 (2013).</li>
<li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents dans le présent document.

L’imagerie à virion unique avec AFM et imagerie par fluorescence à haute résolution peut être utilisée comme méthodologie alternative à la tomographie CryoEM. Chacune de ces méthodologies a ses points forts spécifiques. Par exemple, l’AFM peut être effectuée sur des virions WT sans aucune exigence sur le marquage de l’échantillon ou des protéines virales internes. L’emplacement des structures virales est déconvolvé de leurs contributions aux propriétés élastiques du virion.
L’imagerie à super-résolution à virion unique en combinaison avec les approches génétiques inverses virales nouvellement développées devient une technique puissante pour localiser les protéines virales à faible nombre de copies20. Les virus recombinants avec le remplacement de leurs protéines par des protéines fusionnées à des protéines fluorescentes peuvent être fabriqués et purifiés en utilisant ces approches génétiques inverses. Bien que l’imagerie à super-résolution ait une spécificité en partie due au marquage génétique, elle nécessite l’utilisation des virus mutants.
L’AFM et l’imagerie à super-résolution sont des méthodes complémentaires qui utilisent des préparations d’échantillons très similaires. Les méthodes décrites dans cet article, qui sont adoptées sous forme de tests d’imagerie à molécule unique antérieurs, permettent l’ancrage de virions uniques avec peu d’effets sur la topologie des virions.

Les interactions non spécifiques basées sur la charge sont couramment utilisées pour l’adhésion des virions en microscopie à force atomique1,2. Ces techniques fonctionnent particulièrement bien lorsqu’elles sont utilisées sur des virions non enveloppés avec des capsides très raides3-6. Bien que ces techniques soient très efficaces pour immobiliser l’échantillon, elles n’empêchent pas la liaison non spécifique des protéines à la surface. La liaison non spécifique peut créer un problème lors de la tentative d’image des virions avec des techniques de fluorescence AFM et super-résolution qui nécessitent des incubations de l’échantillon avec divers anticorps. Nous décrivons ici une méthode de préparation d’échantillons pour l’immobilisation spécifique des virions.
Le poly(éthylène glycol) (PEG) greffé à la poly(L-lysine) (PLL) et adsorbé sur une surface vitrée fournit un bloc important pour les interactions électrostatiques des protéines avec le verre7. Les dosages à molécule unique qui nécessitent l’immobilisation de molécules uniques sur des surfaces vitrées ont tiré parti de cette propriété et l’ont utilisée pour créer une technique d’immobilisation de molécule unique spécifique à base de PEG8-10. Cette préparation a également été utilisée pour immobiliser des cages de clathrine sur la surface vitrée11 ainsi que pour créer un revêtement homogène de fibronectine pour contrôler l’adhérence cellulaire 12.
Nous avons adopté la méthode de préparation des échantillons basée sur l’adsorption PLL-g-PEG sur les surfaces vitrées à partir de méthodologies d’imagerie à molécule unique et l’avons appliquée à l’imagerie des virions uniques du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV). Ces virions simples ont été microscopés utilisant la microscopie de force atomique (AFM). Des expériences similaires ont également été réalisées sur des billes fonctionnalisées comme témoin. Les virions ont également été microscopiés par fluorescence à super-résolution où un anticorps VSV-G marqué avec Alexa 647 a été utilisé pour créer une image de l’enveloppe de virions simples. L’imagerie fluorescente haute résolution utilise la localisation de molécules uniques pour créer une image13-15. L’imagerie bi-plane fPALM permet la localisation de molécules uniques avec une résolution de 20 nm dans le plan et de 50 nm le long de l’axe optique15,16. Cette technique bi-plane a été utilisée pour imager des images fluorescentes à super-résolution présentes dans cette étude. Une technique alternative qui a des résultats similaires est STORM13,17,18.
L’AFM et les images fluorescentes à super-résolution de VSV ancrées au verre par les procédures décrites dans ce document, ont montré une liaison spécifique des virions au verre avec un minimum d’interactions non spécifiques19. Nous présentons ici les protocoles de préparation des échantillons pour l’AFM et les expériences d’imagerie fluorescente à super-résolution. En bref: Les lamphes de verre propres sont fonctionnalisées en adsorbant un mélange de PLL-g-PEG et de PLL-g-PEG-biotine. Il est typique que ce film mince soit conçu pour fournir entre 15 et 25% de biotine fonctionnalisée sur une surface enduite. Les lamelle sont en outre incubées avec de l’avidine tétramérique. Un anticorps viral biotinylé est ensuite utilisé pour créer un site de liaison unique pour les virions. La liaison de l’anticorps peut se faire de deux manières.
La première méthode est optimisée pour l’AFM, mais elle reste adaptée à l’imagerie par fluorescence à super-résolution. Dans cette méthode, la surface enduite d’avidine est traitée avec de l’anticorps biotinylé avant l’adhésion virale. Les virions immobilisés sont traités avec un anticorps marqué Alexa 647 pour couvrir l’enveloppe et permettre l’imagerie par fluorescence super-résolution des virions.
La deuxième méthode consiste à attaquer le virus en solution avec l’anticorps biotinylé et l’anticorps marqué Alexa 647 avant d’adhérer les virus à la surface traitée à l’avidine; cette méthode est optimisée pour les expériences d’imagerie par fluorescence à super-résolution dans lesquelles la récupération de l’enveloppe virale est importante. Cette méthode a l’avantage de permettre un revêtement d’anticorps uniforme sur la surface virale. L’anticorps biotinylé peut être mélangé avec des anticorps viraux marqués par Alexa 647 dans des rapports qui permettent une adsorption suffisante du virus sur la surface traitée à l’avidine tout en maintenant une concentration élevée d’étiquette fluorescente à l’extérieur de l’enveloppe virale. Ces anticorps viraux marqués alexa 647 ne sont pas biotinylés et leur excès peut être rincé afin de réduire le bruit de fond.

<table><tbody><tr><td>Lamelles en verre (fPALM)</td><td>Services de microscopie électronique</td><td>72225-01</td><td>Lamles de recouvrement de 25 mm</td></tr><tr><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotine (20 %)&nbsp ;</td><td>SuSoS-Stock</td><td></td> <td>: 0,5 mg/ml dans la protéine de</td></tr> liaison à la <tr><td>biotine PBS NeutrAvidin</td><td>Invitrogen</td><td>A2666</td><td>Stock : 0,25 mg/ml dans PBS</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 chèvre anti-lapin IgG (H+L)&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>1:200 en 0,2 M KPO4, 0,15 M NaCl, 10 % Glycol, pH 7,2 tampon</td></tr><tr><td>&alpha ;-VSV-G&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>ab34774</td><td>1:200 en 0,2 M KPO4, 0,15 M NaCl, 10 % Glycol, pH 7,2</td></tr><tr><td>tampon Gluox</td><td>Sigma</td><td>G2133-250KU</td><td>Glucose oxydase type sept de Aspergillius&nbsp ;</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C40-100mg</td><td>Catalase de foie bovin</td></tr><tr><td>MEA</td><td>Sigma</td><td>30070-10G</td><td>Cysteamine (MEA</td></tr><tr><td>Stock Buffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 10 mM NaCl + 10 % de glucose</td></tr><tr><td>NTE</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl, 66 mM</td></tr><tr><td>EDTA Slide-A-Lyzer, mini unité de dialyse</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>10 000 MW</td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass : 35 CIRCLE #1</td><td>Fisherbrand</td><td>35 CIRCLE #1</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation d’échantillons pour la microscopie à force atomique à virion unique et l’imagerie par fluorescence à super-résolution

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

L’immobilisation des virions sur les surfaces vitrées est une étape critique dans l’imagerie à virion unique. Nous présentons ici une technique adoptée à partir d’essais d’imagerie à molécule unique qui permet l’adhésion de virions simples à des surfaces vitrées avec spécificité. Cette préparation est basée sur la greffe de la surface du verre avec un mélange de PLL-g-PEG et PLL-g-PEG-Biotine, l’ajout d’une couche d’avidine, et enfin la création d’ancres de virion par fixation d’anticorps spécifiques du virus biotinylé. Nous avons appliqué cette technique à travers une gamme d’expériences, y compris la microscopie à force atomique (AFM) et l’imagerie par fluorescence à super-résolution. Cette méthode de préparation de l’échantillon se traduit par une adhérence de contrôle des virions à la surface.

Imagerie à virion unique à l’aide de l’AFM :
Le protocole de préparation des échantillons décrit ci-dessus a été utilisé pour ancrer des virions de type sauvage à la surface du verre. Les virions VSV sont en forme de balle de 180 nm de longueur et de 80 nm de diamètre. Comme il existe une variété de virions pour lesquels cette technique peut être appliquée, le concept est également démontré ici sur des perles biotinylées de 36 nm. Les expériences AFM qui en résultent sont illustrées à la figure 1. Il est important de noter que les virions vsv ont un module de Young inférieur (100 MPa) comparé aux virus non enveloppés (GPa). Les images particulières de VSV à virion unique ont été obtenues en mode tapotement dans des conditions ambiantes avec un porte-à-faux rigide. L’objectif a été de déformer le virus au point que la densité protéique supplémentaire dans le virus devienne visible sous forme de bosse dans l’image AFM. Cette méthode est utilisée pour détecter la densité protéique supplémentaire dans la cavité virale19.
Imagerie à super résolution virion unique :
Les anticorps VSV-G marqués Alexa 647 ont été utilisés pour recouvrir l’enveloppe de virions VSV individuels pour des expériences de super-résolution utilisant la méthode 5A. Pour démontrer la densité d’attache et la faible liaison non spécifique, un grand balayage de l’échantillon est représenté à la figure 2A. La récupération de l’enveloppe virale sur un virion représentatif est représentée à la figure 2B (isosurface bleue).
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14.399999618530273px; line-height: 28px;">
Figure 1. Imagerie AFM des billes et du VSV sur la surface pegg fonctionnalisée. AFM scan de billes biotinylées de 36 nm(A, B)et d’un virion VSV(C)ancré à la surface avec un anticorps VSVG biotinylé. L’AFM a été effectué en mode de balayage de la topographie de l’air c.a. Le rayon de pointe est de <25 nm et les mesures ont été effectuées sous modulation de force et taraudage de la lumière. La pointe avait une constante de force de 3 N/m et une fréquence de résonance de 75 kHz avec une incertitude de 15 kHz. Alors que les perles ont conservé leur hauteur pendant le balayage de l’AFM, le virion VSV a un module de young significativement plus petit et est significativement déformé en hauteur. Dans cette image, le virion a été spécifiquement cérumisé avec un porte-à-faux rigide en mode tapotement qui a produit une petite convolution xy (utilisée pour déterminer la pointe vs l’extrémité émoussée du virus) et la différence de hauteur entre la pointe et l’extrémité émoussée du virus est utilisée pour détecter la densité protéique supplémentaire à l’extrémité émoussée du virus19.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2.jpg"> Figure 2. Imagerie basée sur la fluorescence des virions VSV sur la surface fonctionnalisée PEGG. A)virions VSV recombinants immobilisés sur la surface PEGG à l’aide d’un anticorps anti VSVG biotinylé ionisé en fluorescence à champ large. B)Reconstruction par fluorescence haute résolution de l’enveloppe de VSV fixée à la surface pegg par un anticorps anti-VSVG biotinylé et décoré d’anticorps anti-VSVG marqués Alexa 647 (la méthode 5A a été utilisée pour créer ces images). La surface bleue est une projection isosurface 2D. À gauche montre un modèle du virus en forme de balle. 
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="212"><colgroup>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="27">
<td height="27" style="height:27px;width:119px;">Taille de la lamelle de couverture</td>
			<td style="width:93px;">fluide</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">40 mm</td>
			<td>65 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">35 mm</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">30 mm</td>
			<td>36 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">25 mm</td>
			<td>25 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">20 mm</td>
			<td>16 μl</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1. Aliquotes fluides selon la taille de la lamelle de couverture.

La fixation de virions à une surface est une exigence pour l’imagerie à virion unique par imagerie par fluorescence à super-résolution ou microscopie à force atomique (AFM). Nous démontrons ici une méthode de préparation d’échantillons pour une adhérence contrôlée des virions aux surfaces vitrées adaptées à une utilisation dans l’AFM et l’imagerie par fluorescence à super-résolution.

Préparation d’échantillons pour la microscopie à force atomique à virion unique et l’imagerie par fluorescence à super-résolution

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Cette procédure prépare des lamelles de verre recouvertes de virus destinées à être utilisées en microscopie à force atomique et en microscopie de super-résolution, comme la microscopie fluorescente activée par photo et basée sur la localisation. Tout d'abord, nettoyez le substrat en verre et recouvrez-le d'un film mince de polyéthylène glycol partiellement biotinylé greffé sur du poly-L-lysine. Ensuite, traitez la surface avec de l'avidine afin d'augmenter l'affinité de liaison du film biotinylé.Traitez maintenant la surface avec des anticorps biotinylés spécifiques au virus d'intérêt. Ensuite, traitez la surface préparée avec l'anticorps par le virus d'intérêt. Contrairement au dépôt par centrifugation, cette technique présente l'avantage de répartir uniformément les variants à la surface.Afin d'optimiser la microscopie, placez verticalement les lamelles dans un porte-lamelle en téflon de taille appropriée et immergez-les dans un bécher rempli d'alcool éthylique filtré soumis à une sonication pendant 30 minutes. Rincez ensuite abondamment les lamelles avec de l'eau ultra-pure. Placez ensuite les lamelles dans un autre porte-lamelle en téflon propre et dans un bécher rempli d'une solution de soude à un molaire soumise à une sonication pendant 30 minutes, puis rincez abondamment avec de l'eau ultra-pure.À présent, séchez les lamelles rincées sous un flux d'azote et transférez-les dans un porte-lamelles en téflon propre et sec. Vérifiez que chaque lamelle est exempte de tout film ou particule visible. Immédiatement après le séchage sous flux d'azote en position horizontale, placez une lamelle dans une boîte de Pétri stérile et, au centre de la lamelle, déposez à l’aide d’une pipette la quantité appropriée de polylysine biotinylée greffée au polyéthylène glycol dans du PBS.Placer une autre lame à couvrir propre par-dessus le liquide selon la méthode en sandwich. Veiller à ce que le volume entre les faces actives des deux lames à couvrir soit entièrement rempli de liquide. Couvrir la boîte de Pétri et incuber à température ambiante pendant 45 à 60 minutes.Ensuite, prenez le sandwich à l'aide d'une paire de pinces sans écraser le liquide excédentaire. À l'aide du pouce et de l'index, pincez délicatement et horizontalement le sandwich. Faites glisser les lamelles dans des directions opposées et séparez-les sans toucher les faces actives.Rincez les deux faces actives avec 25 millilitres d'eau ultra-pure. Séchez maintenant les lamelles à l'aide d'un courant d'azote et notez quelles faces des lamelles sont actives dans une boîte de Pétri stérile. Placez une lamelle traitée avec la face active vers le haut, puis ajoutez à l’aide d’une pipette une quantité appropriée de solution d’échantillon décongelée au milieu de la face active.Placer une autre lame couvre-objet avec la face active vers le bas afin de comprimer le liquide, puis incuber à température ambiante pendant 25 à 30 minutes. Ensuite, séparer les deux lames couvre-objets comme indiqué précédemment, en veillant à ne pas toucher les faces actives.Procédez maintenant au rinçage des deux faces actives avec 25 millilitres d'eau ultra-pure, puis séchez les lamelles à l'aide d'un flux d'azote. Il est important de se souvenir quelles faces des lamelles sont actives. À titre de référence ultérieure, placez immédiatement une lamelle traitée et active, face active vers le haut, dans une boîte de Pétri stérile, et déposez au moyen d'une pipette une quantité appropriée d'anticorps biotinylé décongelé au centre de la face active.Placez une autre lame couvre-objet avec la face active vers le bas sur le liquide selon la méthode du sandwich. Incubez ensuite à température ambiante pendant 45 à 60 minutes. Après séparation des deux lames couvre-objets, rincez les deux faces actives avec 25 millilitres de PBS. Placez ensuite une lame couvre-objet traitée par anticorps, avec la face active vers le haut, dans une boîte de Pétri stérile et déposez au moyen d'une pipette une quantité appropriée de virus au centre de la face active.Placer maintenant un deuxième couvre-objet actif, glisser, couvrir et incuber. Séparer ensuite les deux lamelles. Rincer les deux faces actives avec 25 millilitres de PBS et les transférer dans un support en téflon et un bécher remplis de PBS.Utilisez immédiatement les échantillons préparés ou conservez-les à quatre degrés Celsius pendant un maximum de trois jours. Ici, des variants de type sauvage du virus de la stomatite vésiculaire ont été ancrés à la surface du verre et analysés par microscopie à force atomique. La largeur et la longueur du virion sont respectivement de 80 nanomètres par 180 nanomètres, montrant des distorsions minimales par rapport à la taille originale du virion.Dans cette expérience, le virion unique a été imagé par microscopie de localisation par activation photo-fluorescente. En utilisant des anticorps VSVG marqués Alexis 647. La surface isométrique bleue illustre la surface du virion reconstruite à l’aide de la microscopie FOM.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation de lamelles en verre recouvertes de virus destinées à être utilisées en microscopie à force atomique ou en microscopie à super-résolution. Il est important de toujours garder à l’esprit quelle face de la lamelle présente la chimie active.

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La génomique des virus simples (SVG) est une méthode pour isoler et d'amplifier le génome de virions isolés. Suspensions virales d'un assemblage mixte sont triées par cytométrie de flux sur une lame de microscope, avec des puits discrètes contenant l'agarose, capturant ainsi le virion, et la réduction de cisaillement du génome au cours du traitement en aval. Amplification du génome entier est obtenue en utilisant une amplification par déplacement multiple (MDA) résultant en matériel génomique...

L&#39;isolement et l&#39;analyse du génome des virions unique en utilisant la génomique du virus unique »

Source : Zeigler Allen, L., et al. Isolement et analyse génomique de virions uniques à l'aide de la « génomique de virus unique ». J. Vis. Exp. (2013).Ce vidéo montre comment la cytométrie en flux permet l'isolement de virus individuels contenant un génome à partir de populations mixtes, grâce à une détection basée sur la fluorescence et un tri précis des particules, suivi d'un encapsulage dans l'agarose en vue d'une caractérisation génomique ultérieure.

Tri basé sur la fluorescence de particules virales individuelles pour l'analyse génomique

Ce manuscrit utilise le logiciel open-source basée à Fidji VirusMapper d'appliquer une analyse unique particule aux images de microscopie de super-résolution afin de générer des modèles précis de la structure à l'échelle nanométrique.

Open Source Analyse unique pour particules super-résolution Microscopie avec VirusMapper

Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour obtenir des résultats localisation subcellulaire de protéine sur la rétine de poisson-zèbre en corrélant la microscopie photonique Super-résolution et images de microscopie électronique à balayage.

Super-résolution corrélative et microscopie électronique pour résoudre la localisation des protéines dans la rétine de poisson-zèbre

Nous présentons ici un protocole permettant de combiner deux techniques traitement échantillon haute pression gel et traitement des échantillons assistée par micro-ondes, suivie de minime résine enrobage d’acquisition de données avec un microscope électronique à balayage faisceau ionique focalisé (FIB-SEM). Cela est démontré à l’aide d’un échantillon de nerf tibial de souris et le Caenorhabditis elegans.

Préparation de l’échantillon biologique par congélation à haute pression, amélioration du contraste assistée par micro-ondes et minime résine enrobage pour l’imagerie de Volume

Ici, nous décrivons une méthode de micro-aspiration de cellules simples pour la séparation des amibes infectées. Afin de séparer les sous-populations virales de Vermamoeba vermiformis infectés par des Faustovirus et des virus géants inconnus, nous avons développé le protocole détaillé ci-dessous et démontré sa capacité à séparer deux nouveaux virus géants à faible abondance.

Micro-aspiration à cellule unique comme stratégie alternative au tri cellulaire activé par fluorescence pour la séparation du mélange de virus géants

Nous présentons ici un pipeline pour le fraisage par faisceau d’ions focalisés corrélatifs 3D sur le guidage de la préparation d’échantillons cellulaires pour la cryo-tomographie électronique. La position 3D des protéines d’intérêt marquées par fluorescence est d’abord déterminée par cryo-microscopie à fluorescence, puis ciblée pour le broyage. Le protocole convient aux cellules de mammifères, de levures et de bactéries.

Préparation d’échantillons par fraisage par faisceau d’ions focalisé corrélatif 3D pour la cryotomographie électronique haute résolution

Ici, des protocoles sont décrits pour préparer des assemblages de virus adaptés à l’analyse liquide-EM et cryo-EM à l’échelle nanométrique en utilisant la microscopie électronique à transmission.

Faire progresser l’imagerie haute résolution des assemblages de virus dans le liquide et la glace

Ce protocole vidéo illustre comment effectuer une tomographie par microscopie électronique à transmission à balayage d’échantillons virologiques. Pour des résultats optimaux, les échantillons sont préparés par congélation à haute pression et substitution ultérieure de la congélation.

Tomographie par microscopie électronique à transmission à balayage en virologie : imagerie 3D d’échantillons congelés à haute pression et substitués par congélation

Ce protocole détaille les applications avancées d’imagerie et la gestion des ressources partagées d’un système de microscope confocal à balayage laser intégré à un détecteur à réseau multiplexé pour l’imagerie cellulaire et subcellulaire à haute résolution. Ce flux de travail permet l’imagerie multimodale de la confocale à la super-résolution (~120 nm) sur une seule plateforme, rendant la visualisation à l’échelle nanométrique plus accessible.

Imagerie à super-résolution et gestion partagée : un protocole pour la microscopie confocale avec détection multiplex

Apprenez une méthode de préparation d'échantillons pour la microscopie à force atomique et la fluorescence à super-résolution. Cette technique assure l'adhésion contrôlée des virions de virus stomatite vésiculaire pour une imagerie de haute qualité.

Préparation d’échantillons pour la microscopie à force atomique à virion unique et l’imagerie par fluorescence à super-résolution (Vidéo) | JoVE Journal

Préparation d’échantillons pour la microscopie à force atomique à virion unique et l’imagerie par fluorescence à super-résolution

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