Préparation d’échantillons pour la microscopie à force atomique à virion unique et l’imagerie par fluorescence à super-résolution
January 2nd, 2014
La fixation de virions à une surface est une exigence pour l’imagerie à virion unique par imagerie par fluorescence à super-résolution ou microscopie à force atomique (AFM). Nous démontrons ici une méthode de préparation d’échantillons pour une adhérence contrôlée des virions aux surfaces vitrées adaptées à une utilisation dans l’AFM et l’imagerie par fluorescence à super-résolution.
Cette procédure prépare les lamelles de protection en verre contenant des virus pour une utilisation en microscopie à force atomique et en microscopie à super résolution, comme la microscopie de localisation photoactivée par fluorescence. Tout d’abord, nettoyez le substrat du verre, recouvrez le verre d’une fine pellicule de polyéthylène glycol partiellement biotinylé greffée à de la poly L lysine. Ensuite, traitez la surface avec de l’avadon pour augmenter l’affinité de liaison du film biotinylé.
Traitez maintenant la surface avec des anticorps biotinylés spécifiques au virus d’intérêt. Traitez ensuite la surface préparée par anticorps avec le virus d’intérêt. Contrairement au spin coating, cette technique présente l’avantage de répartir les variantes de manière homogène sur la surface.
Afin d’optimiser la microscopie, placez les lamelles verticalement dans un support en téflon de taille appropriée et immergez-les dans un bécher rempli de sonicate d’alcool éthylique filtré pendant 30 minutes. Ensuite, rincez abondamment les lamelles de couverture avec de l’eau ultra pure. Ensuite, placez les lamelles de couverture dans une grille en téflon propre et séparée et un bécher rempli d’une molaire d’hydroxyde de sodium sonicate pendant 30 minutes et rincez abondamment à l’eau ultra-pure.
Séchez maintenant les lamelles de couverture rincées sous un jet d’azote et transférez-les sur un support en téflon propre et sec. Vérifiez que chaque lamelle est exempte de tout film ou particule visible. Immédiatement après le séchage horizontal dans le flux d’azote, placez une lamelle dans une boîte de Pétri stérile au centre de la pipette avec la quantité appropriée de polyéthylène glycol greffé de polylysine biotinylé dans du PBS.
Placez une autre lamelle propre sur le liquide en sandwich. Assurez-vous que le volume entre les faces actives des deux lamelles est complètement rempli de liquide. Couvrez la boîte de Pétri et incubez à température ambiante pendant 45 à 60 minutes.
Ensuite, ramassez le sandwich à l’aide d’une pince à épiler sans pincer l’excès de liquide. Maintenant, à l’aide du pouce et de l’index, pincez légèrement et horizontalement le sandwich. Faites glisser les capots dans des directions opposées et séparez-les sans toucher les faces actives.
Rincez les deux visages actifs avec 25 millilitres d’eau ultra pure. Séchez maintenant les lamelles avec un jet d’azote et notez quelles faces sont actives dans une boîte de Pétri stérile. Placez une lamelle traitée avec la pipette active face vers le haut une quantité appropriée de solution de preuve décongelée au milieu de la face active.
Placez une autre lamelle avec la face active vers le bas pour prendre le liquide en sandwich, puis incubez à température ambiante pendant 25 à 30 minutes. Ensuite, séparez les deux lamelles comme indiqué précédemment. Assurez-vous de ne pas toucher les faces actives.
Rincez maintenant les deux faces actives avec 25 millilitres d’eau ultra pure, puis séchez les lamelles avec un jet d’azote. Il est important de se rappeler quelles faces de recouvrement sont actives. Pour référence future, placez immédiatement une lamelle active avide et traitée face vers le haut dans une boîte de Pétri stérile, pipetez une quantité appropriée d’anticorps biotinylés décongelés au milieu de la face active.
Placez une autre lamelle avec la face active vers le bas sur le liquide dans une méthode sandwich. Incuber ensuite à température ambiante pendant 45 à 60 minutes Après avoir séparé les deux lamelles, rincer les deux faces actives avec 25 millilitres de PBS. Placez ensuite une lamelle de protection traitée avec une face active vers le haut dans une boîte de Pétri stérile et pipetez une quantité appropriée de virus au milieu de la face active.
Maintenant, prenez en sandwich avec une deuxième couverture active, glissez, couvrez et incuberez. Séparez maintenant les deux caillouts. Rincez les deux faces actives avec 25 millilitres de PBS et transférez-les dans une grille en téflon et un bécher rempli de PBS.
Utilisez immédiatement les échantillons préparés ou conservez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à trois jours. Ici. Des varions de type sauvage du virus de la stomatite vésiculeuse ont été ancrées à la surface du verre et analysées par microscopie à force atomique. La largeur et la longueur du virion sont de 80 nanomètres sur 180 nanomètres, montrant des distorsions minimes par rapport à la taille originale du virion.
Dans cette expérience, le virion unique a été imagé par microscopie de localisation par photo-activation fluorescente. Utilisation d’anticorps VSVG marqués Alexis 6 47. L’isosurface bleue montre la surface récupérée du virion à l’aide de la microscopie FOM.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des lamelles en verre avec des virus pour une utilisation avec la microscopie à force atomique ou la microscopie à super résolution. Il est important de se rappeler à tout moment quel recto de la lamelle contient la chimie active.
Aperçu
Cet article présente une méthode pour préparer des lamelles de verre avec des virus à utiliser dans la microscopie à force atomique (AFM) et l'imagerie à fluorescence à super-résolution. La technique assure une adhésion contrôlée des virions, facilitant une imagerie haute résolution des structures virales.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neuroscience
- Biophysique
- Techniques de microscopie
Contexte
- L'attachement des virions est essentiel pour les techniques d'imagerie comme l'AFM et la microscopie à super-résolution.
- Une adhésion contrôlée améliore la qualité des résultats d'imagerie.
- Les méthodes précédentes peuvent ne pas fournir une distribution uniforme des virions.
- Cette étude introduit une nouvelle méthode de préparation d'échantillons.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour l'adhésion des virions aux surfaces de verre.
- Améliorer la qualité d'imagerie en AFM et en microscopie à super-résolution.
- Démontrer l'efficacité de la méthode en utilisant le virus de la stomatite vésiculaire.
Méthodes utilisées
- Nettoyage et revêtement des lamelles de verre avec du polyéthylène glycol biotinylé.
- Traitement des surfaces avec de l'avidine et des anticorps biotinylés spécifiques au virus.
- Sandwichage des lamelles pour faciliter une distribution uniforme du fluide.
- Utilisation de techniques de sonication et de rinçage pour assurer la propreté.
Résultats principaux
- Les virions ont été ancrés avec succès aux surfaces de verre pour l'imagerie.
- Des virions individuels ont été imagés avec une distorsion minimale en utilisant la microscopie à fluorescence.
- La méthode a démontré une distribution efficace des virions sur la surface.
- Les résultats ont confirmé la viabilité de la méthode de préparation pour une imagerie haute résolution.
Conclusions
- La méthode développée fournit une approche fiable pour l'adhésion des virions.
- Cette technique améliore la qualité de l'imagerie dans les applications de microscopie.
- Les études futures peuvent s'appuyer sur cette méthode pour diverses applications d'imagerie virale.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
This method enables controlled, homogeneous virion adhesion to glass surfaces, supporting high-resolution imaging for mechanistic studies of viral structure and host interactions. By ensuring reproducible sample preparation, it reduces variability in downstream biophysical assays, improving data reliability for target validation and lead optimization efforts. The technique is applicable to enveloped viruses relevant to antiviral discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of virion morphology and surface protein distribution to inform target accessibility and epitope exposure.
- Operational Value: Provides a standardized platform for comparing wild-type and mutant virions under identical imaging conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates quantitative assessment of antibody or ligand binding to immobilized virions via fluorescence readouts.
- Operational Value: Supports assay uniformity by minimizing virion clustering and orientation bias across the imaging surface.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Allows correlation of structural changes in virions with functional phenotypes such as infectivity or neutralization resistance.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of viral variants in preclinical models using consistent sample preparation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where structural and biophysical characterization informs target selection and lead compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding viral entry mechanisms and antibody-mediated neutralization through direct imaging.
- Screening: Enables reproducible preparation of virion samples for high-content imaging-based screening campaigns.
- Analytics: Generates quantitative morphometric data (e.g., virion dimensions) and fluorescence intensity measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vitro virion behavior to preclinical efficacy by preserving native structural features during imaging.
- Enterprise Reuse: Represents a adaptable surface chemistry platform applicable to multiple viral targets across discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in structural biology assays by minimizing preparation-induced artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility across laboratories and imaging modalities through standardized surface functionalization.
- Strategic Value: Reduces failed imaging runs due to poor virion adhesion, conserving instrument time and sample resources.
- Portfolio Impact: Enables faster go/no-go decisions in antiviral projects by providing early structural liability assessment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry and fluorescence microscopy techniques.
- Depends on access to AFM and super-resolution imaging infrastructure.
- Necessitates strict adherence to active face orientation during multi-step assembly.
- Adaptation to non-enveloped viruses may require modification of anchoring chemistry.
- Storage limitations (up to 3 days at 4°C) necessitate same-week experimental planning.
