Name: Méthodes pour faciliter la croissance microbienne dans les flux de déchets d’une usine de pâtes et papiers et caractérisation du potentiel de biodégradation des microbes d’élevage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: Découvrez comment cultiver des microorganismes sur la liqueur noire de papeterie et caractériser leur potentiel de biodégradation par GCMS. Cette méthode permet d'évaluer la capacité métabolique des microbes pour la gestion durable des déchets industriels.

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Nous tenons à remercier Jim McMurray pour avoir fourni la liqueur noire ainsi que le Dr David Tilotta et August Meng pour leur aide avec GC-MS. Le soutien à Stephanie L. Mathews a été fourni par une bourse nationale de l’USDA (numéro d’attribution 2010-38420-20399).

1. Collecte de la liqueur noire et préparation de la liqueur noire pour les cultures en croissance
<ol>
	<li>Prélevez un échantillon de liqueur noire à partir de la vanne de sortie fixée au digesteur kraft dans une bouteille en verre stérile et laissez-le refroidir à température ambiante avant de procéder aux étapes suivantes. 
	neutralisation</li>
	<li>Ajouter 100 ml d’échantillon de liqueur noire dans un bécher de 500 ml équipé d’un agitateur.</li>
	<li>Placez le bécher sur une plaque d’agitation et réglez la vitesse à moyenne.</li>
	<li>Ajoutez lentement des gouttes d’acide phosphorique jusqu’à ce que la liqueur noire devienne visqueuse (viscosité similaire à celle du glycérol).</li>
	<li>Aliquote toute la solution de liqueur noire en versant lentement dans des tubes coniques de 50 ml et en centrifugeant à 9 300 x g pendant 30 min.</li>
	<li>Placez le surnageant dans le bécher et mesurez le pH à l’aide de rubans de test de pH. La pastille de lignine précipitée peut être jetée et traitée comme un déchet solide non dangereux.</li>
	<li>Continuez à ajouter de l’acide phosphorique et centrifugez la solution jusqu’à ce que les bandelettes de pH indiquent un pH neutre du surnageant. 
	stérilisation</li>
	<li>Passez la solution à travers un filtre de 0,22 μm pour éliminer toutes les bactéries contaminantes et placez la solution filtrée dans un récipient stérile pour le stockage. Conserver à température ambiante.</li>
</ol>
2. Extraction de lignocellulose
Séparation des glucides
<ol>
	<li>Placez 5 g de panic raide, de pin ou de bermuda (broyé à 1 mm ou en particules moins) dans un erlenmeyer de 500 ml. Ajoutez ensuite 200 ml d’eau distillée ou désionisée, 7,5 g de NaClO2, 2,5 ml d’acide acétique glacial et une barre d’agitation dans la fiole.</li>
	<li>Placez le ballon dans un bain d’huile placé sur une plaque d’agitation à 80 °C pendant 1 h. Réglez la vitesse de la plaque d’agitation sur moyenne.</li>
	<li>Ajouter 7,5 g supplémentaires de NaClO2 et 2,5 ml d’acide acétique glacial dans la fiole. Continuer à remuer à 80 °C dans le bain d’huile pendant 30 min.</li>
	<li>Répétez l’étape précédente 2 fois (Remarque : un total de 30 g de NaClO2 et 10 ml d’acide acétique glacial sont ajoutés dans le ballon contenant la biomasse lignocellulosique). Refroidissez la solution à température ambiante.</li>
	<li>Placez une feuille de papier filtre dans un entonnoir Büchner. Placez l’entonnoir sur une fiole latérale et fixez-le à un aspirateur.</li>
	<li>Versez lentement la solution dans l’entonnoir.</li>
	<li>Lavez la matière solide 3x avec 100 ml d’eau distillée ou déminéralisée. Jetez le filtrat après avoir lavé le matériau solide.</li>
	<li>Réservez 1 g de matériau solide et placez-le sur une feuille propre de papier filtre.</li>
	<li>Faites sécher cette matière solide pendant la nuit dans un four à 50 °C. Après avoir sorti l’échantillon du four, placez-le dans un flacon de stockage étiqueté « holocellulose ».</li>
	<li>Ajouter le reste de la matière solide à 250 ml de NaOH à 10 % (v/v) dans un erlenmeyer de 500 ml. Boucher la fiole à l’aide d’un bouchon.</li>
	<li>Placez la solution dans un incubateur à 70 °C pendant 1 heure en agitant à 250 tr/min.</li>
	<li>Refroidir la solution pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirez le matériau solide à l’aide de papier filtre et d’un entonnoir Büchner fixé à une fiole latérale.</li>
	<li>Transférez le matériau solide sur une feuille de papier filtre propre dans un four à 50 °C et laissez-le sécher pendant la nuit.</li>
	<li>Une fois que le résidu a séché, placez-le dans un flacon de stockage et étiquetez-le « cellulose ».</li>
	<li>Transvaser le filtrat de l’étape 2.13 dans un erlenmeyer de 500 ml et ajouter 30 ml d’acide acétique et 250 ml d’alcool isopropylique. Boucher le ballon et placer la solution sur la paillasse pendant au moins 8 heures à température ambiante.</li>
	<li>Transférez toute la solution dans des tubes coniques de 50 ml et centrifugez la solution à 9 300 x g pendant 30 min. Pipetez soigneusement la solution hors du tube conique et jetez-la.</li>
	<li>Remettre la pastille en suspension dans 30 ml d’eau distillée ou désionisée par vortex.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.17-2.18 15 fois pour bien laver la pastille.</li>
	<li>Retirez le surnageant et conservez la pastille pour la lyophilisation. Une fois lyophilisé, prélevez l’échantillon et placez-le dans un flacon étiqueté « hémicellulose ». 
	Séparation de la lignine 
	Protocole de séparation de la lignine basé sur Karaaslan et al. 12</li>
	<li>Ajouter 5 g de panic raide, de pin ou de bermuda (broyé à une granulométrie de 1 mm ou moins) à 500 ml d’une solution de NaOH 0,25 M et d’éthanol à 30 %. Placez la suspension dans un incubateur à 75 °C en l’agitant à 250 tr/min pendant 2 heures.</li>
	<li>Refroidissez la solution à température ambiante.</li>
	<li>Placez une feuille de papier filtre dans un entonnoir Büchner sur une fiole de bras latéral. Fixez-le à un aspirateur et versez lentement la solution dans l’entonnoir.</li>
	<li>Jetez le matériau solide.</li>
	<li>Ajoutez une barre d’agitation dans la fiole contenant le filtrat et placez la fiole sur une plaque d’agitation réglée à vitesse moyenne. Ajouter goutte à goutte de l’acide chlorhydrique concentré à la solution jusqu’à l’obtention d’un pH de 2,0 (environ 20 ml).</li>
	<li>Laissez la solution acidifiée reposer toute la nuit à température ambiante.</li>
	<li>Centrifuger la solution à 9 300 x g pendant 30 min dans des tubes coniques. Pipetez soigneusement la solution hors du tube conique et jetez-la.</li>
	<li>Remettre la pastille en suspension dans 30 ml d’eau distillée ou désionisée par vortex.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.27-2.28 15 fois pour bien laver le granulé.</li>
	<li>Après la centrifugation, retirez le surnageant et conservez la pastille pour la lyophilisation. Une fois lyophilisé, placez l’échantillon dans un flacon étiqueté « lignine ».</li>
</ol>
3. Préparation des cultures de croissance microbienne
Plaques de gélose
<ol>
	<li>Ajouter 0,2 % (p/v) de produits d’extraction de lignocellulose stériles dans un milieu minimal M913 gélose avant de verser les plaques.</li>
	<li>Plaques solidifiées striées avec environ 200 ul d’une culture bactérienne cultivée dans un milieu minimal M9 avec un diamètre extérieur d’environ 2,0.</li>
	<li>Incuber les plaques à 37 °C et surveiller la croissance. 
	Cultures liquides</li>
	<li>Ajouter 50 ml de milieu stérile Luria-Bertani (LB)13 ou M9 minimal13 dans une fiole stérile de 125 ml. Ajouter de la liqueur noire à 10 % (v/v) ou 0,2 % (p/v) des produits d’extraction de lignocellulose.</li>
	<li>Inoculer le milieu avec 0,1 % (v/v) d’une culture bactérienne à un diamètre extérieur d’environ 2,0.</li>
	<li>Incuber les cultures à 37 °C en secouant à 200 tr/min.</li>
	<li>Évaluer la croissance toutes les 6 heures pendant la période d’élevage en mesurant la densité optique (λ = 600 nm). Déposer une aliquote de 1 ml de la culture dans une cuvette. Déterminer la densité optique de la culture blanchie par rapport aux milieux non inoculés.</li>
	<li>Transférez les bactéries dans un flacon de sérum anaérobie à mi-log.
	<ol>
		<li>Pour préparer le flacon de sérum anaérobie : scellez le flacon de sérum avec un bouchon en caoutchouc butyle et un bouchon à sertir en aluminium dans des conditions aérobies et en autoclave. Ne modifiez pas l’espace libre à l’intérieur du flacon de sérum après la stérilisation.</li>
		<li>Transvaser à l’aide d’une seringue la totalité de la culture de 50 ml de la fiole de 125 ml dans le flacon de sérum stérile scellé.</li>
		<li>Incuber à 37 °C avec agitation à 200 tr/min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Préparation des échantillons pour la GC-MS
Préparer les échantillons selon Raj, Reddy et Chandra14. Le témoin négatif utilisé pour la comparaison consiste en un milieu minimal M9 avec 10 % de liqueur noire et est également appelé échantillon non inoculé.
<ol>
	<li>Centrifuger des cultures bactériennes non inoculées et inoculées (50 ml) à 9 300 x g pendant 30 min après 450 heures d’incubation.</li>
	<li>Transvasez 10 ml de surnageant dans un tube à essai en verre. (Remarque : le plastique est incompatible avec les produits chimiques dans les étapes suivantes.)</li>
	<li>Acidifiez le surnageant avec du HCl concentré à pH 1-2.</li>
	<li>Ajouter 3 volumes d’acétate d’éthyle (30 ml), boucher le tube et mélanger en inversant 4-6x.</li>
	<li>Placez une petite quantité de Na2SO4 anhydre (1-2 g) dans un tube à essai en verre propre.</li>
	<li>Prélever soigneusement la couche organique (en haut) de la solution d’acétate d’éthyle par pipetage à l’aide d’une pipette Pasteur en verre jetable.</li>
	<li>Placez la couche organique dans le tube à essai avec du Na2SO4 anhydre.</li>
	<li>Déshydratez la couche organique sur le Na2SO4 anhydre en tapotant doucement le tube à essai pour mélanger. Ajouter graduellement de petites quantités de Na2SO4anhydre et mélanger jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de gros grumeaux.</li>
	<li>Placez une feuille de papier filtre dans un entonnoir Büchner au-dessus d’une fiole à bras latéral fixée à un aspirateur.</li>
	<li>Versez la solution dans l’entonnoir. Jetez le matériau solide.</li>
	<li>Transférez la solution dans une fiole d’évaporation et évaporez le filtrat à l’aide d’un évaporateur rotatif.</li>
	<li>Placer 3 mg de résidus d’extraction d’acétate d’éthyle dans un flacon de chromatographie ambrée de 2 ml.</li>
	<li>Dissoudre le résidu avec l’ajout de 100 μl de 1,4-dioxane et de 10 μl de pyridine.</li>
	<li>Ajouter 50 μl de N,O-Bis(triméthylsilyl) trifluoroacétamide avec du triméthylcholorsilane 99:1 % (BSTFA). Placez ensuite dans un incubateur à 60 °C en agitant pendant 15 min.</li>
	<li>Conserver les échantillons à 4 °C jusqu’à utilisation.</li>
</ol>
5. GC-MS
Equiper le chromatographe en phase gazeuse (GC) interfacé avec un spectromètre de masse (MS) avec une colonne capillaire non polaire et de l’hélium comme gaz porteur avec un débit de 1 ml/min.
<ol>
	<li>Une fois la température de l’étuve stabilisée à 50 °C, injecter 1 μl de l’échantillon dans un rapport de 1/50.</li>
	<li>Maintenez la colonne à 50 °C pendant 5 min et augmentez à 280 °C à 5 °C/min. Maintenez la température finale de 280 °C pendant 20 min.</li>
	<li>Maintenir la ligne de transfert entre le chromatographe en phase gazeuse et le spectromètre de masse à 300 °C.</li>
	<li>Sélectionnez un délai de solvant de 15 min.</li>
	<li>Enregistrer des spectres de masse par ionisation d’électrons compris entre 10 et 500 (m/z) à une énergie d’électron de 70 eV.</li>
	<li>Dérivatiser et chromatographe standard comme ci-dessus. Identifiez les composés en comparant les temps de rétention des étalons achetés ou des données de la base de données spectrale de masse du National Institute of Standards and Technology (NIST).</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ce protocole décrit une combinaison de techniques qui vise à identifier les micro-organismes qui peuvent dégrader les déchets de mise en pâte, les sources de carbone utilisées pendant la croissance sur les déchets de mise en pâte et les produits métaboliques microbiens produits lorsqu’ils sont cultivés sur des déchets de mise en pâte. Nous avons montré le succès de ce protocole avec l’isolat environnemental microbien : un anaérobie facultatif qui peut se développer avec 10 % de liqueur noire et utiliser les composants d’...

La mise en pâte du bois est un processus chimiquement intensif qui a été optimisé au fil de nombreuses années pour créer un système avec un minimum de déchets. Cependant, certains extrants de ce processus pourraient être utilisés pour produire des produits de plus grande valeur. La liqueur noire en est un exemple. Il est généré à partir du procédé kraft, qui est la méthode de mise en pâte chimique dominante, représentant 85 % de la production mondiale de lignine1. Le procédé kraft (figure 1) utilise la température (160-200 °C), la pression (120 psig) et les produits chimiques contenus dans la liqueur blanche (hydroxyde de sodium et sulfure de sodium) pour dissoudre la lignine des fibres de bois2,3. La liqueur noire contient de la lignine, des acides organiques et des sous-produits de dégradation des polysaccharides4. Il est incinéré pour produire de la vapeur et récupérer des produits chimiques dans la chaudière de récupération qui fournit de l’énergie thermique pour les processus de fabrication du papier et de mise en pâte en aval. Le volume de liqueur noire généré par la mise en pâte peut dépasser la quantité que la chaudière de récupération peut traiter efficacement. L’élimination de la liqueur noire en tant qu’effluent affecte négativement la flore et la faune aquatiques et n’est donc pas une option. L’application d’organismes microbiens qui pourraient utiliser la liqueur noire pour la croissance serait bénéfique en termes d’augmentation de la récupération chimique et de production de produits à valeur ajoutée qui amélioreraient l’analyse globale du cycle de vie du système de mise en pâte. La conversion chimique et biologique des monomères dérivés de la lignine a permis de produire de la vanilline et de l’acide cinnamique utilisés comme édulcorants alimentaires et additifs parfumés, du phénol utilisé pour le plastique et les résines, et du cyclohexane, qui pourrait être utilisé comme carburant5.
Les travaux précédents sur la biodégradation de ces déchets de pâte se sont concentrés sur la dépolymérisation de la lignine. L’Institut international de la lignine (ILI) rapporte qu’entre 40 et 50 millions de tonnes de lignine sont produites chaque année (http://www.ili-lignin.com/aboutlignin.php). Seulement 1,5 % de cette lignine est utilisée pour les processus industriels commerciaux6. La dépolymérisation de la lignine par les enzymes laccase et peroxydase produites par les champignons de la pourriture blanche des genres Phanerochaete et Trametes a été étudiée en longueur7. Il a également été démontré que les bactéries du sol connues pour dégrader les composés aromatiques tels que Nocardia et Rhodococcus8, Pseudomonas putida mt-29 et Streptomyces viridosporus T7A10 sont capables de dégrader la lignine. La dégradation bactérienne des déchets de fabrication de pâte est prometteuse, car certaines bactéries peuvent prospérer dans les conditions salines et alcalines (pH 10-14) qui caractérisent les effluents des déchets de pâte11. Bien que la lignine soit le principal composant de la liqueur noire, les micro-organismes peuvent également dégrader les autres composants qui composent la liqueur noire. Ces techniques n’identifient pas exclusivement les micro-organismes dégradant la lignine, mais servent à identifier les micro-organismes qui peuvent être appliqués directement sur la liqueur noire des déchets de pâte au lieu de ses constituants ultérieurs.
La liqueur noire a été collectée et modifiée pour la croissance microbienne par neutralisation et stérilisation par filtre. Les exigences en matière de croissance microbienne d’un isolat microbien environnemental ont été déterminées par des expériences de croissance minimale en milieu sur des composants lignocellulosiques produits par un nouveau protocole d’extraction de lignocellulose. Les milieux de croissance ont été analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée spectrométrie de masse (GC-MS) afin de déterminer les produits métaboliques de l’isolat microbien environnemental lorsqu’il est cultivé sur de la liqueur noire comme seule source de carbone. La combinaison de ces techniques fournit un outil d’évaluation pour déterminer la capacité métabolique d’un micro-organisme lorsqu’il est cultivé sur des déchets d’usines de pâtes et papiers tels que la liqueur noire. L’utilisation de ces techniques permet également de mieux comprendre la valeur de l’application de microorganismes spécifiques aux déchets des usines de pâtes et papiers pour la production de sous-produits.

<table><tbody><tr><td>1,4-dioxane (certifié ACS)</td><td>Fisher</td><td>D111</td><td>Produit chimique inflammable et préoxydable</td></tr><tr><td>Liqueur noire</td><td>Département des biomatériaux forestiers de l’Université d’État de Caroline du Nord</td> N<td>/A</td><td>pH 12,72, 13,67 % de solides</td></tr><tr><td>Éthanol (qualité microbiologique)</td><td>Fisher</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’éthyle (qualité réactif ACS)</td><td>EMD</td><td>EX0240-9</td><td>Inflammable</td></tr><tr><td>Acide acétique glacial (Certifié ACS)</td><td>EMD</td><td>AX0073</td><td>Corrosif</td></tr><tr><td>Guaiacol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PHR1136</td><td>Nocif par ingestion, corrosif</td></tr><tr><td>Colonne capillaire HP-5</td><td>Agilent</td><td>19091J-577</td><td>60 m x 0,18 mm de diamètre intérieur, 0,18 &mu ; m épaisseur</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique (certifié ACS)</td><td>EMD</td><td>HX0603P</td><td></td></tr><tr><td>N,O-Bis(triméthylsilyl)trifluoroacétamide avec triméthylcholorsilane 99:1 % (BSTFA)</td><td>Fluka</td><td>15238</td><td>Inflammable, provoque des brûlures cutanées et des lésions oculaires avec</td></tr> contact <tr><td>Na2SO4 (grade FCC)</td><td>VWR</td><td>BDH8026</td><td></td></tr><tr><td>NaClO2 (80 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244155</td><td>Inflammable, toxique &nbsp ;</td></tr><tr><td>NaOH (certifié ACS)</td><td>EMD</td><td>1.06498.1000</td><td></td></tr><tr><td>Rubans d’essai de pH alkacide</td> corrosif <td>Fisher</td><td>A979</td><td></td></tr><tr><td>Acide phosphorique (certifié ACS)</td><td>Spectromètre de masse Fisher</td><td>A242</td><td></td></tr><tr><td>Polaris Q&nbsp ;</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyridine (99 %)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12005</td><td>Inflammable, toxique au contact de la peau</td></tr><tr><td>Ferme de recherche sur le cerisier Switchgrass Goldsboro, NC</td><td>n/a</td><td>Récolté en août 2011</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Finnigan Chromatographe en gaz de trace</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman no. 1 papier filtre</td><td>Whatman</td><td>1001-150</td><td></td></tr></tbody></table>

méthodes pour faciliter la croissance microbienne dans les flux de déchets d’une usine de pâtes et papiers et caractérisation du potentiel de biodégradation des microbes d’élevage

Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

Le procédé kraft est appliqué aux copeaux de bois pour séparer la lignine des polysaccharides dans la lignocellulose pour la pâte à papier qui produira un papier de haute qualité. La liqueur noire est un déchet de mise en pâte généré par le procédé kraft qui présente un potentiel de bioconversion en aval. Cependant, la nature récalcitrante des ressources en lignocellulose, ses dérivés chimiques qui constituent la majorité du carbone organique disponible dans la liqueur noire et son pH de base présentent des défis pour la biodégradation microbienne de ces déchets. Les méthodes de collecte et de modification de la liqueur noire pour la croissance microbienne visent à utiliser ces déchets de pâte pour convertir la lignine, les acides organiques et les sous-produits de dégradation des polysaccharides en produits chimiques précieux. Les techniques d’extraction de lignocellulose présentées fournissent une méthode reproductible pour la préparation de substrats de croissance de lignocellulose afin de comprendre les capacités métaboliques des micro-organismes cultivés. L’utilisation de la chromatographie en phase gazeuse couplée spectrométrie de masse permet d’identifier et de quantifier les produits de fermentation résultant de la croissance de micro-organismes sur les déchets de mise en pâte. Lorsqu’elles sont utilisées ensemble, ces méthodes peuvent faciliter la détermination de l’activité métabolique des microorganismes ayant le potentiel de produire des produits de fermentation qui apporteraient une plus grande valeur au système de mise en pâte et réduiraient les déchets d’effluents, augmentant ainsi les bénéfices potentiels de l’usine de papier et offrant des utilisations supplémentaires pour la liqueur noire.

La collecte et la modification du liquide noir généré lors du procédé de cuisson kraft (Figure 1) permettra d'utiliser ce déchet de cuisson afin de déterminer la capacité de biodégradation d'un isolat bactérien unique ou d'une culture mixte. Figure 2 montre la croissance aérobie mesurée par la densité optique de l'isolat environnemental microbien cultivé dans un milieu LB seul et dans un milieu LB enrichi de 10 % de liquide noir neutralisé. Ces résultats indiquent que cette bactérie se d...

Les déchets industriels peuvent être collectés et modifiés pour analyser la croissance microbienne. Les techniques d’extraction de la lignocellulose fournissent des composants permettant d’analyser la capacité spécifique de biodégradation. La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse permet d’identifier les produits de fermentation des microorganismes cultivés sur les déchets de mise en pâte. Ces méthodes déterminent la capacité métabolique des micro-organismes à dégrader les déchets de fabrication de pâte.

Méthodes pour faciliter la croissance microbienne dans les flux de déchets d’une usine de pâtes et papiers et caractérisation du potentiel de biodégradation des microbes d’élevage

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer la capacité d'un microorganisme ou d'un consortium de microorganismes à utiliser le déchet de pulpage appelé liqueur noire comme support de croissance, d'identifier les composants de la liqueur noire utilisés pour la croissance, ainsi que les produits générés par le métabolisme microbien de ce déchet de pulpage. Ceci est réalisé en collectant la liqueur noire issue du pulpage et en la préparant pour son utilisation comme composant d'un milieu de culture. Dans une deuxième étape, les composants lignocellulosiques sont extraits afin de déterminer les besoins des microorganismes en source de carbone.Les milieux suivants sont préparés, inoculés et analysés afin de détecter la croissance microbienne, dans le but de déterminer la capacité des micro-organismes à croître sur la liqueur noire et ses composants. Les résultats montrent l'utilisation de la liqueur noire comme unique source de carbone pour la croissance et la synthèse de produits métaboliques par l'isolat environnemental microbien, basée sur l'observation de sa croissance sur des boîtes de gélose contenant des milieux minimaux, ainsi que par GC-MS. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lors d'une discussion sur la possibilité que des micro-organismes puissent croître sur les déchets de pâte à papier, et que nous pourrions peut-être isoler ces micro-organismes directement à partir d'une usine de pâtes.Le principal avantage de la technique d'extraction de zignal cellulose par rapport aux méthodes existantes actuelles, comme le blanchiment à l'hydroxyde de sodium, réside dans le fait que le blanchiment au chlorure de sodium offre une pureté plus élevée et accrue. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. En effet, les étapes de préparation de l'échantillon de cellulose Theo et de GCMS sont difficiles à maîtriser, en raison du nombre d'étapes requises et de la nécessité d'une évaluation visuelle pour confirmer l'achèvement du processus.Cette méthode peut non seulement fournir des informations sur la dégradation microbienne de la liqueur noire, mais peut également être appliquée à des effluents industriels contenant des matériaux en cellulose de type Magno, tels que les résidus de culture, les résidus forestiers et les déchets solides municipaux. Pour commencer cette procédure, prélevez l'échantillon de liqueur noire au niveau du robinet de sortie relié au digesteur artisanal, placez-le dans un flacon en verre stérile et laissez-le refroidir à température ambiante avant de passer à l'étape suivante. Ajoutez ensuite 100 millilitres de l'échantillon de liqueur noire dans un bécher de 500 millilitres muni d'un barreau aimanté, puis agitez l'échantillon à vitesse moyenne.Neutralisez le liquide noir en ajoutant de l'acide phosphorique goutte à goutte jusqu'à ce qu'il devienne visqueux. Ensuite, transférez toute la solution de liquide noir dans des tubes coniques de 50 millilitres et centrifugez les échantillons à 9 300 G pendant 30 minutes. Pour séparer les glucides, placez cinq grammes de panic raide broyé en particules d'un millimètre ou moins et une barrette d'agitation dans un flacon de 500 millilitres.Ensuite, ajouter 200 millilitres d'eau distillée, 7,5 grammes de chlorite de sodium et 2,5 millilitres d'acide acétique glacial. Placer le ballon dans un bain d'huile positionné sur une plaque agitatrice à 80 degrés Celsius pendant une heure. Puis ajouter 7,5 grammes supplémentaires de chlorure de sodium et 2,5 millilitres d'acide acétique glacial dans le ballon.Poursuivre l'agitation à 80 degrés Celsius pendant 30 minutes après avoir répété l'étape précédente deux fois. Laisser refroidir la solution à température ambiante. Puis la filtrer à l'aide d'un entonnoir de Büchner sous vide afin d'isoler le matériau solide.Lavez le matériau solide trois fois avec 100 millilitres d'eau distillée. Ensuite, prélève un gramme du matériau solide et dépose-le sur une feuille propre de papier filtre. Placez le solide à 50 degrés Celsius pour le faire sécher toute la nuit.Après avoir retiré l'échantillon du fourner le lendemain, transférez-le dans un flacon de stockage étiqueté « cellule creuse ». Ajoutez le matériau solide restant dans un ballon de 500 millilitres contenant 250 millilitres d'hydroxyde de sodium à 10 %, puis bouchez le ballon avec un bouchon. Placez la solution dans une étuve à 70 degrés Celsius pendant une heure, sous agitation à 250 tr/min.À la suite de cette étape, laissez refroidir la solution à température ambiante. Après 30 minutes, isolez le matériau solide par filtration sous vide à l’aide d’un entonnoir de Büchner. Une fois que le résidu solide a été séché pendant une nuit dans une étuve à 50 degrés Celsius, placez-le dans un flacon de stockage étiqueté cellulose. Transférez le filtrat dans un ballon de 500 millilitres et ajoutez 30 millilitres d’acide acétique et 250 millilitres d’alcool isopropylique ; bouchonnez et laissez la solution obtenue sur le plan de travail pendant au moins huit heures à température ambiante.Une fois terminé, transférez toute la solution dans des tubes coniques de 50 millilitres et centrifugez l'échantillon à 9&nbsp;300&nbsp;G pendant 30 minutes. Après la centrifugation, pipetez soigneusement la solution hors des tubes coniques et jetez-la. Ensuite, lavez les culots avec 30 millilitres d'eau distillée par vortex, puis centrifugez à 9&nbsp;300&nbsp;G pendant 30 minutes.Répétez cette étape 15 fois afin de laver complètement le culot. Après la centrifugation, éliminez le surnageant pour isoler le culot en vue de la lyophilisation. Une fois l'échantillon lyophilisé, placez-le dans un flacon étiqueté hémicellulose.Pour la séparation de la lignine, ajoutez cinq grammes de panic raide broyé de un millimètre ou moins à une solution de 500 millilitres d'hydroxyde de sodium 0,25 molaire et d'éthanol à 30 %. Placez la suspension dans un incubateur à 75 degrés Celsius avec agitation à 250 tr/min pendant deux heures. Après filtration de la solution refroidie, ajoutez une barrette d'agitation au flacon et placez-le sur une plaque chauffante agitante réglée à une vitesse moyenne.Ajouter de l'acide chlorhydrique concentré goutte à goutte au filtrat jusqu'à l'obtention d'un pH de deux. Laisser la solution reposer toute la nuit à température ambiante. Une fois la solution transférée dans des tubes coniques de 50 millilitres, centrifuger les échantillons à 9 300 ×g pendant 30 minutes.Lorsque l'opération est terminée, prélevez soigneusement la solution du tube conique à l'aide d'une pipette et jetez-la. Lavez le culot avec 30 millilitres d'eau distillée en vortexant, puis centrifugez à 9 300 ×g pendant 30 minutes. Répétez cette étape 15 fois afin de laver complètement le culot.Après centrifugation, éliminer le surnageant afin d'isoler le culot pour lyophilisation. Une fois lyophilisé, placer l'échantillon dans un flacon étiqueté lignine. Ajouter 50 millilitres de milieu minimal M neuf stérile dans un flacon stérile de 125 millilitres.Ensuite, ajouter 10 % en volume de liqueur noire au milieu. Pour l'ensemencement, ajouter 0,1 % en volume d'une culture bactérienne de nuit au mélange, puis incuber les cultures à 37 degrés Celsius dans un incubateur sous agitation à 200 tr/min. Au stade de phase logarithmique moyenne, transférer les bactéries dans un flacon stérile anaérobie scellé à l’aide d’une seringue, après centrifugation des cultures bactériennes non ensemencées et ensemencées.Après 450 heures de croissance, ajouter 10 millilitres de chaque surnageant dans des tubes à essai en verre séparés. Acidifier chaque surnageant avec de l'acide chlorhydrique concentré ajouté goutte à goutte jusqu'à un pH de un à deux. Pour chaque échantillon, ajouter 30 millilitres d'acétate d'éthyle au surnageant.Après avoir bouché le tube à essai, mélanger la solution en retournant le tube quatre à six fois. Ensuite, placer un à deux grammes de sulfate de sodium anhydre dans un tube à essai en verre propre. Prélever soigneusement la couche organique supérieure à l’aide d’une pipette Pasteur en verre jetable.Placer la phase organique dans le tube à essai contenant le sulfate de sodium anhydre. Déshydrater la phase organique sur du sulfate de sodium anhydre en tapotant doucement le tube à essai pour assurer un mélange progressif. Ajouter de petites quantités de sulfate de sodium anhydre et mélanger jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de gros agrégats.À la suite, filtrer la solution à l’aide d’un entonnoir Büchner sous vide, puis transférer la solution dans un ballon d’évaporation et évaporer le filtrat à l’aide d’un évaporateur rotatif. Une fois terminé, placer trois milligrammes des résidus de l’extraction à l’acétate d’éthyle dans un flacon chromatographique ambré de deux millilitres. Dissoudre le résidu avec 100 microlitres de 1,4-dioxane et 10 microlitres de pyridine.Ensuite, ajoutez 50 microlitres d'une solution de B-S-T-F-A contenant 1 % de chlorure de triméthyle dans le flacon. Incubez la solution à 60 degrés Celsius avec agitation pendant 15 minutes. Analysez l'échantillon par GCMS.La collecte et la modification du liquide noir généré lors du procédé artisanal de fabrication de pâte permettront, entre autres, d'utiliser ce déchet de pulpage pour déterminer la capacité de biodégradation d'un isolat bactérien unique ou d'une culture mixte. On observe ici la croissance aérobie mesurée par la densité optique d'une souche environnementale cultivée dans un milieu LB et dans un milieu LB enrichi de 10 % de liquide noir neutralisé. Ces résultats indiquent que cette bactérie est capable de croître en présence de liquide noir.La croissance de l'isolat environnemental en milieu LB est plus rapide que lorsqu'il est cultivé en présence de liqueur noire, mais la densité optique commence à diminuer après 62 heures. En revanche, la croissance de l'isolat environnemental microbien en présence de liqueur noire continue d'augmenter en densité optique jusqu'après 230 heures de culture. La courbe de croissance de l'isolat environnemental microbien en présence de liqueur noire montre également une croissance biphasique, ce qui suggère que la liqueur noire contient plus d'une source de carbone pouvant être utilisée par l'isolat microbien environnemental, et qu'il existe une préférence dans l'utilisation des nutriments exprimée par la bactérie.Des expériences supplémentaires sont nécessaires pour déterminer sa capacité à utiliser la liqueur noire pour répondre à ses besoins en croissance. On peut également déterminer la croissance d'une bactérie sur une liqueur noire non neutralisée ou évaluer l'effet de concentrations accrues de liqueur noire sur la croissance. Après avoir démontré la croissance sur liqueur noire, on peut déterminer l'utilisation de sources carbonées au moyen d'expériences de croissance sur milieux minimaux.Des substrats commerciaux composant la lignocellulose peuvent être utilisés comme sources de carbone dans les milieux minimaux. Le protocole d'extraction de la LIGNOCELLULOSE présenté ici fournit un modèle permettant de déterminer les exigences nutritionnelles de la bactérie illustrée. Voici la croissance de l'isolat microbien environnemental sur un milieu M neuf, contenant de l'agar minimal supplémenté de chacun des composants de l'extraction de la lignocellulose.La présence de colonies sur les boîtes de gélose aux milieux minimaux indique la capacité de l'isolat environnemental à dégrader l'holo-cellulose, la cellulose, l'hémicellulose et la lignine. Les colonies présentes sur le milieu M neuf (M9) pourraient suggérer que l'isolat environnemental est capable de dégrader la gélose plutôt que les fractions de lignocellulose. Les courbes de croissance en milieux minimaux pour les cultures liquides peuvent également être utilisées afin de déterminer la vitesse spécifique de croissance sur chacune des fractions de la lignocellulose, évitant ainsi d'avoir à ajouter de la gélose, qui pourrait constituer une source de carbone potentielle.L'analyse par GCMS des extraits et des dérivés d'yeux, ainsi que des cultures bactériennes, révèle les produits métaboliques générés. On observe ici le spectre GCMS des dérivés TMS présents dans l'échantillon non inoculé, ainsi que le spectre des dérivés TMS produits par l'isolat microbien environnemental lorsqu'il est cultivé en conditions anaérobies dans le milieu minimal M9, complété avec 10 % de liqueur noire non neutralisée. La comparaison des deux spectres met en évidence des différences dans les composants présents dans le milieu, suggérant la formation de produits de fermentation et la dégradation de composés présents dans la liqueur noire.Un pic avec un temps de rétention de 39,34 minutes est apparu dans l'échantillon inoculé. Un pic avec un temps de rétention de 21,84 minutes a augmenté dans l'échantillon inoculé. Un pic avec un temps de rétention de 25,79 minutes a diminué dans l'échantillon inoculé.Le spectre affiché ici correspond à celui de l'étalon de guac, utilisé pour identifier le pic ayant un temps de rétention de 25,79 minutes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment déterminer si un microorganisme ou un consortium de microorganismes est capable de dégrader la liqueur noire. De plus, en suivant ce protocole, vous pouvez utiliser d'autres méthodes telles que les courbes de croissance afin de répondre à d'autres questions concernant la vitesse de croissance d'un microorganisme ou de microorganismes sur différentes concentrations de composants extraits de la liqueur noire ou de la lignine-cellulose.

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Méthodes de facilitation de la croissance microbienne dans les flux de déchets des moulins à papier et caractérisation du potentiel de biodégradation des microbes cultivés

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Méthodes pour faciliter la croissance microbienne dans les flux de déchets d’une usine de pâtes et papiers et caractérisation du potentiel de biodégradation des microbes d’élevage (Vidéo) | JoVE Journal

Méthodes pour faciliter la croissance microbienne dans les flux de déchets d’une usine de pâtes et papiers et caractérisation du potentiel de biodégradation des microbes d’élevage

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