Méthodes pour faciliter la croissance microbienne dans les flux de déchets d’une usine de pâtes et papiers et caractérisation du potentiel de biodégradation des microbes d’élevage

L’objectif général de l’expérience suivante est de déterminer la capacité d’un micro-organisme ou d’un consortium de micro-organismes à utiliser les déchets de fabrication de la pâte à la liqueur noire pour la croissance, les composants de la liqueur noire qui sont utilisés pour la croissance et les produits produits par le métabolisme microbien de ces déchets de mise en pâte. Ceci est réalisé en collectant les déchets de pâte Black liquor et en les préparant pour être utilisés comme composant de milieu de culture. Dans un deuxième temps, des composants de lignocellulose sont extraits, qui sont utilisés pour déterminer les besoins en sources de carbone des micro-organismes.

Ensuite, les milieux sont préparés, inoculés et analysés pour la croissance microbienne afin de déterminer la capacité des micro-organismes à se développer sur la liqueur noire et ses composants. Les résultats montrent l’utilisation de la liqueur noire comme seule source de carbone pour la croissance et la synthèse des produits métaboliques par l’isolat environnemental microbien sur la base de sa croissance visualisée sur des plaques de gélose en milieu minimal et par le GCMS. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous discutions de la possibilité que les microbes puissent se développer sur les déchets de pâte à papier et que nous pourrions être en mesure d’isoler ces microbes directement d’une usine de pâte à papier.

Le principal avantage de la technique d’extraction au chlorure de sodium par rapport aux méthodes existantes aujourd’hui, comme le blanchiment à l’hydroxyde de sodium, est que le blanchiment au chlorure de sodium offre une pureté élevée et accrue. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. En tant que Theo cellulose et GCMS, les étapes de préparation des échantillons sont difficiles à apprendre, et cela est dû au nombre d’étapes requises et à la détermination visuelle nécessaire pour vérifier l’achèvement du processus.

Cette méthode peut non seulement fournir des informations sur la dégradation microbienne de la liqueur noire, mais elle peut également être appliquée aux flux de déchets industriels contenant des matériaux cellulosiques Magno tels que les résidus de culture, les résidus forestiers et les déchets solides municipaux. Pour commencer cette procédure, prélevez l’échantillon de liqueur noire à partir de la vanne de sortie fixée au digesteur artisanal et d’une bouteille en verre stérile, et laissez-le refroidir à température ambiante avant de passer à l’étape suivante. Ajoutez ensuite 100 millilitres de l’échantillon de liqueur noire dans un bécher de 500 millilitres équipé d’une barre d’agitation et remuez l’échantillon à vitesse moyenne.

Neutralisez la liqueur noire en ajoutant de l’acide phosphorique goutte à goutte jusqu’à ce qu’elle devienne visqueuse. Ensuite, aliquote de toute la solution de liqueur noire dans des tubes coniques de 50 millilitres et centrifuger les échantillons à 9 300 G pendant 30 minutes. Pour séparer les glucides, placez cinq grammes de panic raide moulu d’un millimètre ou moins et une barre d’agitation dans une fiole de 500 millilitres.

Ajoutez ensuite 200 millilitres d’eau distillée, 7,5 grammes de chlorite de sodium et 2,5 millilitres d’acide acétique glacial. Placez le ballon dans un bain d’huile posé sur une plaque d’agitation à 80 degrés Celsius pendant une heure. Ajoutez ensuite 7,5 grammes supplémentaires de chlorure de sodium et 2,5 millilitres d’acide acétique glacial dans le flacon.

Continuez à remuer à 80 degrés Celsius pendant 30 minutes après avoir répété l’étape précédente deux fois. Laissez la solution refroidir à température ambiante. Ensuite, filtrez-le à travers un entonnoir de buchner sous vide pour isoler le matériau solide.

Lavez la matière solide trois fois avec 100 millilitres d’eau distillée. Ensuite, récupérez un gramme de matériau solide et placez-le sur une feuille propre de papier filtre. Placez le solide à 50 degrés Celsius pour qu’il sèche pendant la nuit.

Après avoir sorti l’échantillon du four le lendemain, transférez-le dans un flacon de stockage étiqueté à cellules creuses. Ajouter le reste de la matière solide dans une fiole de 500 millilitres contenant 250 millilitres d’hydroxyde de sodium à 10 % et boucher la fiole avec le bouchon. Placez la solution dans un incubateur à 70 degrés Celsius pendant une heure en agitant à 250 tr/min.

Ensuite, laissez la solution refroidir à température ambiante Après 30 minutes, isolez le matériau solide par filtration sous vide à l’aide d’un entonnoir Buchner. Une fois que le résidu solide a été séché pendant la nuit dans un four à 50 degrés Celsius, placez-le dans un flacon de stockage étiqueté cellulose. Transférez le filtrat dans une fiole de 500 millilitres et ajoutez 30 millilitres d’acide acétique et 250 millilitres de bouchon d’alcool isopropylique et placez la solution obtenue sur la paillasse pendant au moins huit heures à température ambiante.

Une fois terminé, transférez toute la solution dans des tubes coniques de 50 millilitres et centrifugez l’échantillon à 9 300 G pendant 30 minutes. Après la centrifugation, pipeter soigneusement la solution hors des tubes coniques et la jeter. Ensuite, lavez les granulés avec 30 millilitres d’eau distillée par vortex et centrifugez-les à 9 300 G pendant 30 minutes.

Répétez cette étape 15 fois pour bien laver la pastille. Après la centrifugation, retirez le surnageant pour isoler la pastille pour la lyophilisation. Une fois l’échantillon lyophilisé, placez-le dans un flacon étiqueté hemi cellulose.

Pour la séparation de la lignine, ajoutez cinq grammes de panic raide moulu d’un millimètre ou moins à une solution de 500 millilitres d’hydroxyde de sodium point 25 molaire et d’éthanol à 30 %. Placez la boue dans un incubateur à 75 degrés Celsius en secouant à 250 tr/min pendant deux heures. Après avoir filtré la solution froide, ajoutez une barre d’agitation dans la fiole et placez-la sur une plaque d’agitation réglée à vitesse moyenne.

Ajouter goutte à goutte de l’acide chlorhydrique concentré au filtrat jusqu’à l’obtention d’un pH de deux. Laissez la solution reposer toute la nuit à température ambiante. Une fois que la solution a été transférée dans des tubes coniques de 50 millilitres, centrifuger les échantillons à 9 300 GS pendant 30 minutes.

Une fois terminé, pipetez soigneusement la solution hors du tube conique et jetez-la. Lavez le granulé avec 30 millilitres d’eau distillée par vortex et centrifugez-le à 9 300 G pendant 30 minutes. Répétez cette étape 15 fois pour bien laver la pastille.

Après centrifugation, retirez le natant en décubitus dorsal pour isoler la pastille pour la lyophilisation. Une fois lyophilisé, placez l’échantillon dans un flacon étiqueté lignine. Ajoutez 50 millilitres de milieu stérile M nine minimal dans une fiole stérile de 125 millilitres.

Ajoutez ensuite 10 % en volume de liqueur noire dans le média. Pour l’inoculation, ajoutez 0,1 % en volume d’une culture bactérienne de nuit au mélange, incubez les cultures à 37 degrés Celsius dans un incubateur avec agitation à 200 tr/min. À mi-log, transférer les bactéries dans un flacon de sérum anaérobie stérile scellé à l’aide d’une seringue après centrifugation des cultures bactériennes inoculées et inoculées par l’ONU.

Après 450 heures de croissance, ajoutez 10 millilitres de chaque surnageant dans des tubes à essai en verre séparés. Acidifiez chaque surnageant avec de l’acide chlorhydrique concentré ajouté goutte à goutte au pH un à deux. Pour chaque échantillon, ajoutez 30 millilitres d’acétate d’éthyle au supra naturel.

Après avoir bouché le tube à essai, mélangez la solution en retournant le tube quatre à six fois. Placez ensuite un à deux grammes de sulfate de sodium anhydre dans un tube à essai en verre propre. Prélevez soigneusement la couche organique supérieure en pipetant avec la pipette de pâturage en verre jetable.

Placez la couche organique dans le tube à essai contenant le sulfate de sodium anhydre. Déshydratez la couche organique sur le sulfate de sodium anhydre en tapotant doucement le tube à essai pour mélanger progressivement. Ajoutez de petites quantités de sulfate de sodium anhydre et mélangez jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de gros grumeaux.

Ensuite, filtrez la solution à travers un entonnoir de Buchner sous vide, puis transférez la solution dans un ballon d’évaporation et évaporez le filtrat à l’aide d’un évaporateur rotatif. Lorsque vous avez terminé, placez trois milligrammes de résidus d’extraction d’acétate d’éthyle dans un flacon de chromatographie ambrée de deux millilitres. Dissoudre le résidu avec 100 microlitres d’un quatre dioxane et 10 microlitres de pyridine.

Ajoutez ensuite 50 microlitres d’une solution de B-S-T-F-A avec 1 % de chlore triméthylique dans le flacon. Placez la solution dans un incubateur à 60 degrés Celsius en secouant pendant 15 minutes. Analyser l’échantillon à l’aide du SMGC.

La collecte et la modification de la liqueur noire générée dans le processus de mise en pâte artisanale permettront d’utiliser ces déchets de mise en pâte pour déterminer la capacité de biodégradation d’un seul isolat bactérien ou d’une culture mixte. La croissance aérobie mesurée par la densité optique d’une souche environnementale cultivée dans des milieux LB et des milieux LB complétés par de la liqueur noire neutralisée à 10 %. Ces résultats indiquent que cette bactérie se développe en présence de liqueur noire.

La croissance de l’isolat environnemental dans les milieux LB est plus rapide que lorsqu’il est cultivé en présence de liqueur noire, mais la densité optique commence à diminuer après 62 heures. Alors que la croissance de l’isolat environnemental microbien en présence de liqueur noire continue d’augmenter en densité optique jusqu’après 230 heures de croissance. La courbe de croissance de l’isolat environnemental microbien en présence de liqueur noire représente également une croissance biphasique, ce qui suggère que la liqueur noire contient plus d’une source de carbone qui peut être utilisée par l’isolat environnemental microbien, et qu’il existe une préférence d’utilisation des nutriments manifestée par la bactérie.

D’autres expériences sont nécessaires pour déterminer sa capacité à utiliser la liqueur noire pour ses besoins de croissance. On peut également déterminer la croissance d’une bactérie sur de la liqueur noire non neutralisée ou déterminer l’effet de concentrations accrues de liqueur noire sur la croissance. Après avoir démontré la croissance sur la liqueur noire, on peut déterminer l’utilisation de la source de carbone à l’aide d’expériences de croissance minimale.

Les substrats commerciaux qui constituent les composants de la lignocellulose peuvent être utilisés comme sources de carbone dans les milieux minimaux. Le protocole d’extraction de LIGNOCELLULOSE présenté ici fournit un modèle pour déterminer les besoins de croissance de la bactérie représentée : Voici la croissance de l’isolat microbien environnemental sur M neuf. Gélose minimale complétée par chaque composant de l’extraction de la lignocellulose.

La présence de colonies sur les plaques de gélose à milieu minimal indique la capacité de l’isolat environnemental à dégrader les colonies d’holocellulose, de cellulose, d’hémicellulose et de lignine présentes sur M nine. Un minimum de milieux peut suggérer la capacité de l’isolat environnemental à dégrader la gélose au lieu des plaques. Des courbes de croissance minimales dans les milieux pour les cultures liquides pourraient également être utilisées pour déterminer le taux de croissance spécifique de chaque fraction de lignocellulose, de sorte qu’il n’aurait pas à être ajouté de gélose, qui pourrait être une source potentielle de carbone.

L’analyse des yeux extraits et dérivés, des cultures bactériennes par GCMS révèle les produits métaboliques produits. On voit ici le spectre GCMS des dérivés de TMS présents dans l’échantillon non inoculé, le spectre des dérivés de TMS produits par l’isolat microbien environnemental lorsqu’il est cultivé en anaérobie et M neuf, milieu minimal avec 10 % de liqueur noire non neutralisée. La comparaison des deux spectres révèle des différences dans les composants présents dans les milieux, suggérant la présence de produits de fermentation et la dégradation des composants de la liqueur noire.

Un pic avec un temps de rétention de 39,34 minutes est apparu dans l’échantillon inoculé. Un pic avec un temps de rétention de 21 virgule 84 minutes a augmenté dans l’échantillon inoculé. Un pic avec un temps de rétention de 25,79 a diminué dans l’échantillon inoculé.

Le spectre représenté ici est celui de l’étalon guac, qui a été utilisé pour identifier le pic avec un temps de rétention de 25,79 minutes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer si un micro-organisme ou un consortium de micro-organismes peut dégrader la liqueur noire. De plus, en suivant ce protocole, vous pouvez utiliser d’autres méthodes telles que les courbes de croissance pour répondre à des questions supplémentaires sur le taux de croissance d’un micro-organisme ou de micro-organismes sur diverses concentrations de composants de la liqueur noire ou de l’extrait de cellulose de ligon.