Name: La coloration histochimique de l Arabidopsis thaliana Cellule secondaire Elements mur (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Apprenez la coloration histochimique des parois cellulaires secondaires d'Arabidopsis thaliana. Cette méthode permet de visualiser la composition des tissus ligneux et d'étudier la structure des cellules végétales.

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Nous sommes reconnaissants à Sabin Russell pour aide à l&#39;édition. Ce travail faisait partie de l&#39;Institut mixte bioénergie DOE (http://www.jbei.org) soutenue par le Département américain de l&#39;énergie, Bureau de la science, Bureau de la recherche biologique et l&#39;environnement, par le biais du contrat DE-AC02-05CH11231 entre Lawrence Berkeley National Laboratory et l&#39;US Department of Energy.

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Les auteurs n’ont aucun conflit financier à divulguer.

Sections de la tige A. thaliana sont largement utilisés pour étudier l&#39;organisation des cellules dans la paroi de la cellule secondaire et pour examiner les différences entre qualitativement type sauvage et des plantes transgéniques. Les techniques couramment utilisées pour sectionner les spécimens sont coupe de main directe; ou lorsque les spécimens sont intégrés dans agarose ou fixateur, la coupe peut être fait avec un vibratome ou microtome. A la différence de la découpe de la main, les deux derniers per...

La paroi de cellule végétale est titulaire d&#39;une pléthore d&#39;informations à l&#39;intérieur de ses divers composants: la lignine, la cellulose, les hémicelluloses (xylane, glucuronoxylane, xyloglucane, arabinoxylane, glucane de liaison mixte, ou glucomannane), et de la pectine. Techniques histologiques fournissent des repères visuels importants dans l&#39;étude des différences dans les parois secondaires au niveau organisationnel et cellulaires. Diverses techniques histologiques ont été développés et peuvent être trouvés dans la littérature, mais ces techniques peuvent être difficiles et fastidieux pour les débutants car protocoles très détaillés avec des instructions visuelles simples sont rarement, voire jamais disponible. Le but de cette étude est de fournir des lignes directrices simples pour les techniques de coloration histologique pour obtenir des images de haute qualité. Sectionner le tissu de la tige est la première étape dans la visualisation des parois cellulaires et des formes cellulaires. Bien que les sections coupées à la main sont peu coûteux et prennent moins de temps pour se préparer, l&#39;utilisation d&#39;un vibratome offre cohérence etdonne des images de haute qualité. L&#39;utilisation d&#39;un vibratome permet de produire des données de meilleure qualité en générant même des sections avec la même épaisseur, ce qui permet de produire des images nettes et réduit de manière significative le risque de produire des différences entre les échantillons inexactes qui serait tout simplement causés par une mauvaise préparation de l&#39;échantillon. Utilisation de résines pour fixer les échantillons frais peut être un défi pour les débutants et peut-être encore temps, même pour des experts quand une analyse qui doit être fait rapidement. En outre, il devient impossible de mesurer une quelconque activité biologique de l&#39;échantillon lorsqu&#39;il a été noyé dans une résine. Une technique simple qui utilise un moule d&#39;agarose et fait maison est utile pour l&#39;enrobage tissus de la tige, et elle peut également être utilisée dans d&#39;autres applications nécessitant une dissection des tissus mous. Par rapport aux échantillons enrobage dans de la résine, ce procédé présente l&#39;avantage de conserver les tissus vivants et de réduire la manipulation de l&#39;échantillon. Sectionnement des tissus par un vibratome est très précis et génère homogenUO sections, qui, en fonction de l&#39;objectif de l&#39;étude, peuvent ensuite être utilisés avec plusieurs techniques de coloration différents. Les méthodes les plus simples pour visualiser la lignine et d&#39;autres composés aromatiques emploient les rayons ultraviolets (UV). Excitation des molécules aromatiques à base de lumière UV est une technique ancienne, mais il est encore l&#39;un des plus rapides des approches pour la visualisation de la lignine. Cependant, la visualisation UV n&#39;est effectivement pas idéal pour la détection de la lignine parce que la lumière UV va exciter d&#39;autres composés aromatiques. La lignine est composé principalement de trois blocs de construction, les monolignols (alcools hydroxycinnamyl: alcool coniférylique, alcool sinapylique, et de l&#39;alcool p-coumaryl) 1-3. Phloroglucinol tache peut fournir des indices à la mesure de cinnamaldéhydes présents dans le xylème, de fibres et de tissus de la trachée 4. Phloroglucinol est un bon indicateur de cinnamaldéhydes générales et peut différencier entre cinnamaldéhydes et d&#39;autres composés aromatiques. Les monomères d&#39;alcool sinapylique peuvent être détectéset différenciées par l&#39;utilisation de Mäule taches. le bleu de toluidine O est un colorant polychromatique et a la capacité de colorer les différents éléments de la paroi cellulaire dans des couleurs différentes donc 5,6. La principale utilisation de bleu de toluidine O est de détecter la pectine et de la lignine 5,6. L&#39;avantage d&#39;utiliser le bleu de toluidine O, c&#39;est que de nombreux éléments de la paroi cellulaire peuvent être visualisés en une seule étape. Les deux calcofluor blanc et rouge Congo sont faciles à travailler et peuvent être utilisés pour visualiser la cellulose. Calcofluor taches blanches cellulose, callose, et d&#39;autres β-glucanes non-substitués ou substitués faiblement 6-9, tandis que le congo taches rouges directement à β-(1 → 4)-glucanes et notamment de cellulose 10,11. Le but de cette étude est de fournir des lignes directrices simples pour l&#39;utilisation des techniques de coloration ci-dessus pour obtenir des images de haute qualité à partir de A. thaliana tiges.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>EMD</td><td>MERC2125</td><td>Numéro CAS : 9012-36-6</td></tr><tr><td>Phloroglucinol</td><td>Sigma</td><td>P 3502</td><td>1,3,5-trihydroxybenzène [Numéro CAS : 108-73-6]</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>EMD</td><td>HX0603-75</td><td>Numéro CAS : 7647-01-0</td></tr><tr><td>Hydroxyde d’ammonium</td><td>EMD</td><td>AX1303-6</td><td>Numéro CAS : 1336-21-6</td></tr><tr><td>Toulidine Blue O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td>Chlorure de blétène, chlorure de tolonium [numéro CAS 92-31-9]&nbsp ;</td></tr><tr><td>Permanganate de potassium</td><td>Sigma</td><td>223468</td><td>numéro CAS 7722-64-7&nbsp ;</td></tr><tr><td>Éthanol 190 proof</td><td>KOPTEC</td><td>V1401</td><td>Numéro CAS : 64-17-5</td></tr><tr><td>Congo Red</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>C6277</td><td>Disodium 3,3'-[[1,1'-biphényl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphtalène 1-sulfonate) [Numéro CAS 573-58-0]</td></tr><tr><td>Azurant 28/ Calcofluor Teinture Blanche</td><td>Sigma</td><td>F3543&nbsp ;</td><td>Acide 4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyéthyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbène-2,2'-disulfonique [numéro CAS 4404-43-7]&nbsp ;</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>Leica Microtome à lame vibrante</td><td>VT1000S http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/</td></tr> <tr><td>Razor</td><td>American Safety razor company</td><td>Article # 60-0139-0000&nbsp ;</td><td>Lame à double tranchant en acier inoxydable (Personna Super)</td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation à bouchon à vis (2 ml)</td><td>VWR</td><td>16466-044</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation (0,6 ml)</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-060-C</td><td></td></tr><tr><td>Mitaine</td><td>Bel-Art</td><td>380000000</td><td>SCIENCEWARE&nbsp ; Hot Hand Protector Mitt</td></tr><tr><td>Adhésif en tissu</td><td>Ted Pella Inc</td><td>10033</td><td>Magasinez à 4 &deg ; C ou 20 &deg ; C pour une conservation de 3 mois ou plus</td></tr><tr><td>Micro-ondes</td><td>Panasonic</td><td>NN-SD762S</td><td>PELCO Pro CA 44 Adhésif tissulaire instantané&nbsp ;</td></tr><tr><td>Caméra avec puce CCD sans obturateur mécanique</td><td>Hamamatsu</td><td>C4742-95</td><td></td></tr><tr><td>Caméra couleur haute vitesse&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>QImaging</td><td>MicroPublisher 5.0 RTV</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de caméra&nbsp ;</td><td>&nbsp ; Molecular Devices</td><td>MetaMorph version 7.7.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Imaginer l’anaylsis&nbsp ;</td><td>Adobe&nbsp ;</td><td>Lunettes Photoshop CS4</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover, carrées, n° 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>22 x 22 mm (7/8 x 7/8") - Les lunettes sont résistantes à la corrosion et uniformément épaisses et plates. L’épaisseur n° 1 est de 0,13 à 0,17 mm.</td></tr><tr><td>Micro lames givrées, 1 mm</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75 x 25 mm - 1 mm Emballage</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Alcan</td><td>BRNDPM998</td><td></td></tr><tr><td>TX2 Filtre cube</td><td>Leica</td><td>11513851/11513885</td><td>Filtre utilisé pour l’analyse du rouge Congo avec une bande passante de 560/40.</td></tr></tbody></table>

la coloration histochimique de l&#39;<em&gt; arabidopsis thaliana</em&gt; cellule secondaire elements mur

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana est un organisme modèle couramment utilisé pour comprendre et manipuler divers processus cellulaires chez les plantes, et il a été largement utilisé dans l’étude de la formation de la paroi cellulaire secondaire. Le dépôt de la paroi cellulaire secondaire se produit après la formation de la paroi cellulaire primaire, un processus effectué exclusivement par des cellules spécialisées telles que celles formant des tissus de vaisseaux et de fibres. La plupart des parois cellulaires secondaires sont composées de cellulose (40 à 50 %), d’hémicellulose (25 à 30 %) et de lignine (20 à 30 %). Plusieurs mutations affectant la biosynthèse de la paroi cellulaire secondaire ont été isolées, et les mutants correspondants peuvent ou non présenter des changements évidents de composition biochimique ou des phénotypes visuels, car ces mutations pourraient être masquées par des réponses compensatoires. Historiquement, les procédures de coloration ont été utilisées pour montrer les différences sur une base cellulaire. Ces méthodes sont exclusivement des moyens d’analyse visuels ; Néanmoins, leur rôle dans l’analyse rapide et critique est d’une grande importance. Le rouge Congo et le blanc calcofluor sont des colorants utilisés pour détecter les polysaccharides, tandis que le Mäule et le phloroglucinol sont couramment utilisés pour déterminer les différences de lignine, et le bleu de toluidine O est utilisé pour colorer différemment les polysaccharides et la lignine. Les techniques apparemment simples de sectionnement, de coloration et d’imagerie peuvent être un défi pour les débutants. En commençant par la préparation d’échantillons à l’aide du modèle A. thaliana, cette étude détaille les protocoles d’une variété de méthodologies de coloration qui peuvent être facilement mises en œuvre pour l’observation de l’organisation cellulaire et tissulaire dans les parois cellulaires secondaires des plantes.

Tige inclusion et la coupe: L&#39;utilisation du moule en matière plastique à incorporer le fait maison tiges dans 7% d&#39;agarose révélée être rapide et facile (figure 1). Les deux parties (A et B; figure 1) du système de flacon intégré le rendent simple pour libérer facilement la tige intégré dans agarose comme l&#39;agarose ne colle pas aux parties des flacons qui sont inertes, maintenir le système propre. Les flacons peuvent être réutilisés plusieurs fois pendant des années....

La composition de la paroi cellulaire végétale varie selon les types de tissus et peut inclure la lignine, la cellulose, les hémicelluloses et la pectine. Diverses techniques de coloration ont été développées pour visualiser les différences au niveau du type de cellule. Cet article est une compilation des techniques de coloration de la paroi cellulaire couramment utilisées.

La coloration histochimique de l&#39;<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Cellule secondaire Elements mur

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

L'objectif général de cette procédure est de montrer la coloration histochimique des éléments de paroi cellulaire secondaire ANA d'Arabidopsis. Cela est réalisé en premier lieu en incluant la tige de la plante dans de l'aros. Ensuite, la tige incluse dans l'aros est désenrobée et transférée vers des disques d'échantillons, qui sont ensuite coupés en sections transversales STEM à l'aide d'un vibratome.Ensuite, les sections sont soumises à diverses procédures de coloration histochimique. Finalement, la microscopie est utilisée pour révéler les modifications différentielles des éléments de la paroi cellulaire secondaire obtenues par la coloration histochimique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en lien avec la paroi cellulaire, telles que les modifications des tissus maculés dans les tiges des plantes.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car des étapes simples mais cruciales mentionnées dans les protocoles présentés ici n'ont pas été documentées de façon approfondie ni exposées de manière simplifiée auparavant. Pour commencer, préparez un moule maison pour l'inclusion des tiges en utilisant des flacons en plastique. Tout d'abord, utilisez une lame de rasoir pour couper la partie conique inférieure d'un tube microcentrifuge de deux millilitres à bouchon vissable.Ce composant est appelé partie A, comportant une perforation par aiguille de seringue et un trou dans le bouchon du tube légèrement plus grand que le diamètre de la tige à insérer. Ensuite, couper un demi-centimètre au fond d'un tube micro-centrifuge de 0,6 millilitre. Ce composant sera appelé partie B. Insérer la portion coupée de demi-centimètre du tube micro-centrifuge de 0,6 millilitre dans le tube micro-centrifuge de 2 millilitres préalablement découpé.Sceller les deux parties à l'aide de paraffine. À l'aide d'une lame de rasoir, couper une section de tige provenant de la zone d'intérêt, puis faire fondre une solution d'agaros à 7 % au micro-ondes à faible intensité. Une fois que l'agaros fondu s'est refroidi à environ 50 degrés Celsius, pipeter lentement cinq millilitres de l'agaros dans le moule en plastique préfabriqué afin de remplir le flacon.Une fois que l'aéros est refroidi pendant 30 à 60 secondes et qu'il est devenu semi-solide, insérez la tige dans le flacon rempli d'aéros. Placez ensuite le bouchon perforé de manière à ce que l'extrémité de la tige soit maintenue par le bouchon. Laissez le flacon à température ambiante ou à quatre degrés Celsius pendant 10 à 30 minutes, jusqu'à ce qu'il durcisse complètement.Retirez le moule en le faisant doucement glisser hors du tube. Ouvrez le film parafilm et poussez délicatement avec le pouce le fond de la partie B du moule afin de libérer les aros solidifiés de la partie A sur une lame de microscope en coupe oblique.Insérez la tige d'aros dans trois morceaux d'environ 1,2 centimètre de longueur égale. Retirez la partie de la tige qui n'était pas dans l'aros et jetez-la. Assurez-vous que le disque d'échantillon est propre et parfaitement sec.Utilisez des lingettes en papier douces pour éliminer toute humidité du bloc aros contenant les échantillons. Déposez une petite goutte d'adhésif tissulaire sur le disque d'échantillon. Placez rapidement le bloc aros de manière à ce que les échantillons soient soit perpendiculaires à la plaque pour des coupes transversales, soit parallèles à la plaque.Pour les sections transversales longitudinales, laisser l'adhésif fixer l'échantillon sur le disque-échantillon à température ambiante ou à quatre degrés Celsius pendant 10 à 30 minutes. Fixer le disque-échantillon en place sur le plateau tampon ou la rigole de bloc d'aros de sorte que les sections soient parallèles à la lame de rasoir. Remplir le plateau tampon avec de l'eau distillée à température ambiante jusqu'à ce que les échantillons soient complètement immergés.Coupez une lame de rasoir en deux, puis taillez les extrémités avec des ciseaux solides afin que la lame reste parfaitement plate. Fixez une moitié de la lame de rasoir préalablement coupée sur le porte-lame. Réglez l'angle du porte-lame à 84 degrés, la vitesse à 0,90 millimètre par seconde et la fréquence à 50 hertz.Couper les sections à une épaisseur de 100 micromètres en utilisant le mode continu. Ramasser les sections à l’aide d’une pipette plastique jetable pendant la coupe dans le bac tampon. Transférer quelques sections dans des tubes microcentrifugeurs de deux millilitres pour la coloration au fluorol.Transférez les sections de tige dans un tube de microcentrifugeuse. Ajoutez un millilitre de solution fluorol dans le tube et refermez-le immédiatement. Étant donné que l'acide chlorhydrique contenu dans la coloration fluoro gluc anol est hautement corrosif, agitez doucement le tube afin de vous assurer que toutes les sections soient colorées.Transférez délicatement les sections à l’aide d’une pipette dont l’embout a été coupé et déposez-les sur une lame de microscope. Recouvrez les sections d’un couvre-objet. Observez les sections en lumière blanche.La solution sèche en cinq à dix minutes, ce qui provoque une détérioration des échantillons. Par conséquent, l'acquisition d'images doit être terminée dans ce laps de temps. Pour la coloration au mal, transférez les sections de tige dans un tube microcentrifuge.Ajoutez un millilitre de la solution de permanganate de potassium à 0,5 % dans le tube contenant les sections. Pipetez doucement la solution de permanganate de potassium à 0,5 % vers le haut et vers le bas, de préférence sans déranger les sections. Après une incubation de deux minutes et une pipettage répétée, laissez le tube de microcentrifugeuse en place jusqu'à ce que toutes les sections se soient déposées.À l’aide d’une pipette d’un millilitre, prélevez 700 microlitres de solution de permanganate de potassium à 0,5 %, puis ajoutez 700 microlitres d’eau distillée pour rincer le permanganate de potassium. Répétez l’opération trois à quatre fois ou jusqu’à ce que la solution aqueuse reste claire. Après avoir rapidement éliminé l’eau, ajoutez un millilitre d’acide chlorhydrique à 3 % jusqu’à ce que la couleur brun foncé disparaisse des sections.Cela peut se produire en trois à cinq minutes ou peut nécessiter deux lavages de cinq minutes. Aspirez complètement toute la solution d'acide chlorhydrique à 3 % avec une pipette et ajoutez immédiatement un millilitre de solution concentrée d'hydroxyde d'ammonium. Avant l'observation en lumière blanche pour la coloration au rouge Congo, transférez les sections de tige dans un tube microcentrifuge et ajoutez un millilitre de la solution de rouge Congo à 0,5 %.Pipetez doucement la solution de rouge Congo à 0,5 % de haut en bas sans perturber les sections. Avant d'incuber et de laver les sections comme décrit dans le protocole écrit, pipetez délicatement les prélèvements dans une pointe de pipette coupée et déposez-les sur une lame de microscope. Ensuite, recouvrez-les d'une lamelle. Observer les échantillons au microscope. Observer en utilisant une excitation en lumière bleue avec un filtre d'émission de 560 nanomètres pour la coloration au calcior blanc. Transférer les sections de tige dans un tube de microcentrifugeuse et ajouter un millilitre de la solution de calcior blanc à 0,02 %.Effectuez un pipetage doux de la solution vers le haut et vers le bas. Incubez puis lavez les sections comme décrit dans le protocole écrit avant d’observer les sections en lumière UV. Pour la coloration au bleu de toluidine O, transférez les sections de tige dans un tube micro-centrifuge.Ensuite, ajoutez un millilitre de la solution de bleu de toluidine O à 0,02 % dans le tube et prélassez doucement la solution par aspiration et expulsion. Incubez puis lavez les sections comme décrit dans le protocole écrit avant de les observer en lumière transmise. Consultez le protocole écrit pour plus de détails sur les réglages du microscope et de la caméra pour l'acquisition d'images, ainsi que pour la procédure d'imagerie en ultraviolet et en champ clair.Les composés aromatiques, notamment la lignine présente dans les cellules, peuvent être visualisés grâce à leur autofluorescence sous lumière UV. Le xylème et les fibres interfasciculaires présentent une autofluorescence sous éclairage UV, contrairement à la moelle, au cortex ou à l'épiderme, car la lignine et les polymères aromatiques sont déposés durant la formation des parois cellulaires secondaires. En revanche, la coloration fluorol réagit avec les groupes aldéhydes terminaux de la lignine, produisant une couleur rose ou fuchsia observable sous éclairage UV. Une coloration fuchsia est observée dans le xylème et les fibres interfasciculaires, mais elle est absente dans la moelle, le cortex et l'épiderme.En général, l'intensité de la couleur est corrélée de manière qualitative au niveau de lignification. La coloration MALS est spécifique à la détection des unités de lignine ingal dans le xylème et les fibres interfasciculaires. Une coloration rouge indique la présence d'unités de lignine ingal dans les éléments de lignine.Cependant, une coloration rouge plus intense est observée dans les fibres par rapport aux tissus du xylème, ce qui suggère que les fibres contiennent un niveau plus élevé de lignine ingal, tandis que le xylème est davantage enrichi en unités de lignine gua. Des sections de tige colorées au blanc de chaux ont été observées sous lumière UV et ont révélé que l'épiderme, le cortex et la moelle étaient colorés, car tous ces tissus contiennent de la cellulose comme polymère majeur de polysaccharide dans leurs parois cellulaires. Les sections colorées au rouge de Congo ont été observées sous excitation par lumière bleue et ont également coloré l'épiderme, le cortex et la moelle.Contrairement au calcior, le rouge Congo colore mieux les polysaccharides dans le xylème et les fibres interfasciculaires et semble moins affecté par la présence de lignine odine. Le bleu O est classé comme colorant polychromatique car il donne un spécimen multicolore. L'odine bleu O est un colorant ionique qui se lie aux groupes chargés négativement et produit différentes couleurs.Lorsque le colorant se lie à différents groupes ioniques dans la cellule, la coloration bleue de toluidine sur des sections transversales de tige a révélé que le xylème et les fibres inter-fasciculaires sont lignifiées, car elles présentent une coloration bleu-vert ou bleue, ce qui est en accord avec les observations en UV et en fluoro-glucan. En revanche, les tissus de la moelle, du cortex et de l'épiderme montrent une coloration bleu-vert ou bleue, car bien qu'ils ne soient pas lignifiés, ils contiennent certains polymères de pectine dans leurs parois cellulaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de réaliser des sections de tiges végétales et de colorer de manière différentielle les différents tissus présents dans la paroi cellulaire végétale à l'aide de divers colorants histochimiques.

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