Imagerie Effacé systèmes biologiques intacts au niveau cellulaire par 3DISCO

L’objectif global de l’expérience suivante est d’imager des échantillons biologiques intacts marqués par fluorescence sans coupe histologique. Ceci est réalisé par incubation séquentielle de tissus fixés dans des solvants organiques jusqu’à ce qu’une transparence complète soit obtenue. Dans un deuxième temps.

Les tissus transparents sont imagés en 3D à l’aide d’un microscope à balayage laser. Ensuite, les résultats de l’imagerie sont analysés et les structures neuronales de la moelle épinière et du cerveau non sectionnés peuvent être reconstruites en 3D à partir des trois images disco collectées. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences concernant la façon de cartographier les connexions neuronales et GAL dans l’ensemble du cerveau et de la moelle épinière.

Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie de la neurodégénérescence, car nous pouvons maintenant visualiser l’intégrité neuronale dans l’ensemble du système nerveux. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’organisation du système nerveux, elle peut également être appliquée à d’autres organes tels que le poumon ou le tissu tumoral. Une fois maîtrisée, cette technique ne prend que quelques heures pour les petits organes tels que la moelle épinière ou le poumon, et environ un ou deux jours pour le cerveau. Commencez la procédure en ajoutant deux à trois millilitres de 50 % de THF fraîchement préparés dans un flacon en verre par tissu prélevé.

Transférez ensuite les organes fixes dans la solution éclaircissante et fermez bien les flacons. Placez les flacons sur un rotateur et couvrez-les de papier d’aluminium, en remuant les échantillons pendant le temps approprié à une vitesse constante de 30 tr/min. Retirez ensuite la solution éclaircissante et utilisez un nouveau PE ou une pipette pour suspendre le tissu dans la solution suivante.

Comme indiqué dans le tableau lors de l’étape finale de nettoyage, conservez les échantillons en solution jusqu’à ce qu’ils deviennent complètement transparents pour la microscopie multiphotonique ou confocale. Dès qu’une élimination complète est obtenue, montez l’échantillon sur une lame d’imagerie à cette fin. Utilisez du ciment dentaire pour faire une bordure autour du tissu.

Remplissez la piscine avec la solution de clarification finale juste avant que le ciment dentaire ne devienne complètement rigide, puis placez immédiatement l’échantillon clarifié au milieu de la piscine et couvrez-le d’un verre de couverture. Appuyez sur le verre de protection jusqu’à ce qu’il soit complètement scellé par le ciment dentaire et touche la surface de l’organe dégagé pour la microscopie à feuille de lumière dès qu’un nettoyage complet est obtenu, montez, puis tournez manuellement la vis du porte-échantillon pour fixer l’échantillon. Ensuite, trempez l’échantillon dans la chambre d’imagerie du microscope à feuillet de lumière rempli de la solution de clarification finale appropriée pour le tissu imagé.

Ensuite, collectez des balayages Z couvrant l’ensemble des tissus éliminés à la meilleure résolution que le microscope peut fournir, en zoomant sur les régions d’intérêt pour collecter des images à plus haute résolution. Après avoir collecté les images, chargez la série d’images dans le logiciel Amira avec le module resolve RT. Une fois la série chargée, entrez les tailles de voxel correctes dans la fenêtre des paramètres de lecture d’image et cliquez sur OK.

Ensuite, sélectionnez la sous-application de vue multiplanaire. Utilisez ensuite les curseurs primaire et d’épaisseur pour choisir l’épaisseur et le seuil de projection optimaux pour les valeurs de gris. Enfin, utilisez le module de coin de recadrage pour parcourir les tranches dans différentes orientations 3D.

Pour visualiser les échantillons, la cartographie de l’organisation structurelle des neurones est extrêmement importante pour comprendre comment ils fonctionnent dans la santé et la maladie. Bien que trois disco puissent être utilisés sur divers organes, il est alors particulièrement utile pour tracer de longues connexions neuronales dans la moelle épinière et le cerveau. Par exemple, à l’aide d’écho-microscopes de grands segments de moelle épinière dégagés, les connexions axonales peuvent être suivies sur plus de centimètres dans la moelle épinière des rongeurs, comme illustré dans ces images.

De la même manière, l’ensemble du cerveau et de l’hippocampe de la souris nettoyés peut être imagé pour suivre les connexions neuronales dans le cerveau. Lorsque la microscopie confocale ou multiphotonique est utilisée, la résolution de l’image peut être considérablement améliorée, en particulier dans la dimension Z. Par exemple, l’imagerie multiphotonique de la moelle épinière dégagée de souris de la lignée GFPM permet d’obtenir une image homogène sur toute la profondeur de 1,5 à deux millimètres de la moelle épinière.

La microscopie confocale sur la moelle épinière dégagée offre une résolution améliorée de la même manière. L’imagerie par microscopie multiphotonique des cerveaux dégagés fournit des images à très haute résolution pour visualiser les détails fins des structures neuronales, y compris les épines dendritiques. Les échantillons de trois discothèques peuvent être étiquetés de différentes manières.

Par exemple, il est possible de marquer l’ensemble du système vasculaire du cerveau et de la moelle épinière à l’aide de traceurs fluorescents conjugués à la lectine, qui peuvent être utilisés pour étudier la barrière hémato-encéphalique dans la santé et la maladie. À l’aide de trois discothèques, des cellules plus petites dans de grands tissus peuvent également être imagées. Par exemple, la microglie et les astrocytes sont tous deux fortement impliqués dans la pathologie de la neurodégénérescence, y compris la maladie d’Alzheimer et les blessures traumatiques.

À l’aide de trois discothèques, leur densité et leur distribution dans la moelle épinière peuvent être étudiées. Les tissus non neuronaux peuvent également être imagés. Par exemple, les cellules Clara de l’ensemble des poumons des rongeurs peuvent être immunomarquées avec des anticorps et imagées sans sectionnement au niveau de la cellule unique.

De même, il est possible d’éliminer et d’imager des cellules dans le tissu pancréatique non sanctionné. Par exemple, les cellules alpha marquées par fluorescence sont imagées après élimination dans ces images du pancréas. La démonstration visuelle de cette méthode est importante, car si les étapes de nettoyage et d’imagerie sont simples, l’analyse des données peut être compliquée.

Lors de l’application de cette procédure, il est important d’imager les tissus transparents dès que la transparence complète est atteinte, car le signal fluorescent se dégradera avec le temps dans la solution de clarification. Le développement de cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer des détails et des organes intacts, tels que la cartographie des réseaux neuronaux dans le cerveau. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’éclaircir et d’imager les structures cellulaires et subcellulaires de l’ensemble des organes, puis de les visualiser et de les analyser.