Nucléosidiques Triphosphates - de la synthèse à caractérisation biochimique

L’objectif général de cette vidéo est de démontrer le processus allant de la synthèse des phosphates nucléosidiques modifiés à leur caractérisation biochimique complète. Ceci est accompli en convertissant d’abord le précurseur nucléosidique convenablement protégé en triphosphate correspondant par l’application d’une procédure en quatre étapes. La deuxième étape consiste à purifier le triphosphate résultant, d’abord par précipitation, puis par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse.

Ensuite, l’analogue triphosphate est caractérisé par une résonance magnétique nucléaire et une DESORPTION laser assistée par une matrice, un temps de vol ou RMN et un maloff pour assurer une grande pureté. La dernière étape est constituée des réactions d’extension d’amorce et des réactions terminales de polymérisation de la désoxynucléotide transférase ou TDT. En fin de compte, les produits de réaction, et donc l’acceptation du triphosphate par substrat sont analysés par électrophorèse sur gel.

L’avantage de cette méthode par rapport à d’autres stratégies synthétiques comme l’approche de Borge, est qu’il y a moins de produits secondaires formés, ce qui facilite la purification. En général, les personnes qui découvrent cette technique auront du mal car il s’agit d’une procédure assez longue et complexe qui nécessite des connaissances dans plusieurs domaines. Nous avons d’abord eu l’idée de filmer cette méthode lorsque nous avons synthétisé des phosphates modifiés et nous avons trouvé assez difficile de trouver une procédure détaillée.

Un autre avantage de cette méthode est qu’elle peut être utilisée pour aborder d’autres questions dans le domaine des acides nucléiques modifiés. En effet, il peut être utilisé pour sélectionner des enzymes d’ADN qui catalysent un large éventail de réactions. De plus, cette méthode peut être utilisée pour le marquage fonctionnel des acides nucléiques.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de synthèse et de purification sont difficiles à apprendre car les triphosphates sont des dérivés polaires et activés qui doivent être manipulés avec précaution. Pour commencer, évaporez deux fois le nucléoside protégé contre l’hydroxyle à trois apprêts avec deux millilitres de purine anhydre avant de le sécher sous vide pendant la nuit. Dans le même temps, le pyrophosphate d’ammonium sec sous vide pendant la nuit suivante a dissous le nucléoside dans un minimum de 200 microlitres de pyridine sèche.

Ajoutez ensuite 400 microlitres de dioxane sec comme solvant COS. Enfin, ajoutez le dérivé cyclique du phosphore trois et laissez-le réagir à température ambiante pendant 45 minutes. Ensuite, préparez une solution de pyrophosphate d’ammonium butyle sec dans 170 microlitres de diméthylformamide sec et 58 microlitres de tri butylamine fraîchement distillée.

Ajoutez la solution obtenue au mélange réactionnel et laissez-la réagir à température ambiante pendant 45 minutes. Préparez ensuite une solution de 160 micromolaires d’iode dans 980 microlitres de purine et 20 microlitres d’eau. Ajouter la solution au mélange réactionnel.

Afin d’oxyder le centre du phosphore alpha. Laisser la solution sombre obtenue remuer à température ambiante pendant 30 minutes. Utilisez une solution aqueuse à 10 % de thio sulfate de sodium pour éteindre l’excès d’iode.

Retirez le solvant sous vide. Ajoutez ensuite cinq millilitres d’eau et laissez le mélange reposer à température ambiante pendant 30 minutes pour hydrolyser le triphosphate cyclique. À ce stade, les groupes protecteurs sont généralement éliminés.

Par conséquent, ajoutez 30 % d’hydroxyde d’imodium à l’échantillon brut. Remuez pendant 1,5 heure à température ambiante avant de retirer le solvant sous vide. Ensuite, ajoutez deux millilitres d’eau et divisez le mélange en tubes tubulaires.

Ajouter 12 millilitres d’une solution à 2 % de sodium par chlorate dans de l’acétone et centrifuger pendant 30 minutes avant de répéter la procédure. Encore une fois. Les réactifs utilisés dans la synthèse du triphosphate vont précipiter en formant un résidu huileux et en permettant la séparation des solvants, simplifiant ainsi considérablement la purification HPLC en phase inverse qui s’ensuit après séchage à l’air du résidu huileux.

Enregistrer un spectre RMN P 31 de l’échantillon brut selon les procédures standard. Après RMN, le résidu huileux a été dissous dans quatre millilitres d’eau distillée. Commencer la purification HPLC avec la préparation de 50 millimolaires de bicarbonate de triéthylammonium dans de l’eau ultrapure sous forme d’EENT A et dans 50 % d’acétylnitrile comme eent B, comme détaillé dans le protocole de texte, dégazer à la fois l’EENT sous vide et en agitant pendant 20 minutes.

Préparez un échantillon analytique en dissolvant 10 microlitres de triphosphate brut dans 300 microlitres d’eau distillée. Puis en utilisant un dégradé allant de 0 %B à 100 %B en 40 minutes. Injectez l’échantillon dans un système HPLC équipé d’une colonne semi-préparative inverse de phase C 18.

Ajustez le programme HPLC en fonction du temps de rétention du triphosphate et du diphosphate. Purifiez le mélange brut dans ces conditions et, en éliminant les fractions précoces qui pourraient contenir du diphosphate, combinez toutes les fractions qui contiennent le produit et lyophilisez. Ensuite, le co s’évapore plusieurs fois avec de l’eau ultra-pure.

Évaluer la pureté du triphosphate par RMN et maloff par application de protocoles standard. Les rendements typiques obtenus par l’application de ce protocole sont de l’ordre de 30 à 70 % selon le substrat pour cinq primaires et le marquage de l’amorce. Mélangez l’amorce et les réactifs comme indiqué dans le protocole textuel et incubez la réaction d’étiquetage à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Pendant la réaction d’étiquetage, préparez une colonne de cidex G 10 en bouchant une pointe de pipette d’un millilitre avec de la laine de verre siloisée et en remplissant l’embout avec une solution G 10. Essorez et lavez trois fois avec 500 microlitres d’eau double distillée et un dernier lavage avec 50 microlitres d’eau double distillée. Après l’incubation de la réaction de marquage, la chaleur désactive la kinase pendant 10 minutes à 70 degrés Celsius.

Ensuite, faites passer le mélange réactionnel dans le G 10. Pour éliminer le gel radioactif libre, purifier l’amorce radiomarquée et récupérer par application de la méthode d’écrasement et de trempage, le précipité d’éthanol et le dessalage G 10 de l’oligonucléotide éludé. Pour la réaction d’extension de l’amorce, combinez une mole PICA d’amorce radiomarquée, P une mole de 10 moles PICA d’amorce, P une et 10 moles PICA de matrice, T une mole de réaction x 10 x et agenouillez-vous dans de l’eau chaude.

Puis refroidir progressivement à température ambiante pendant 45 minutes. Mettez le tube sur de la glace et ajoutez le cocktail de phosphate nucléosidique ou DNTP et une unité de glace d’ADN polymérase. Complétez la réaction avec de l’eau pour un volume total de 20 microlitres incubez à la température de travail optimale de l’enzyme.

Ajoutez ensuite 20 microlitres de solution d’arrêt et chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Cool, les échantillons descendent à zéro degré Celsius. Avant de résoudre par électrophorèse sur gel de poly acrylamide dénaturant.

Visualisez les bandes par imageur phospho pour la polymérisation TDT, l’amorce non marquée simple brin diluée P deux et l’amorce radiomarquée dans un microlitre de tampon TDT. Mettez le tube sur de la glace et ajoutez le cocktail DNTP et la polymérase TDT, puis incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l’incubation, ajoutez 10 microlitres de la solution d’arrêt avant de chauffer les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis de refroidir à zéro degré Celsius.

Après avoir résolu l’échantillon par électrophorèse sur gel de poly acrylamide dénaturé, visualisez les bandes à l’aide d’un imageur phospho. On voit ici un spectre RMN P 31 brut typique d’un DNTP modifié où les signaux caractéristiques des centres de phosphore peuvent être observés. De plus, des signaux provenant du côté du diphosphate et du monophosphate

Des produits contenant des concentrations plus élevées de phosphates sont toujours observés à ce stade. L’analyse HPLC en phase inverse du mélange brut est illustrée ici. Le pic principal correspond aux cinq premiers phosphates, tandis que le sous-produit principal, les cinq premiers diphosphates, présente un temps de rétention légèrement plus faible.

Enfin, après une phase inverse approfondie, la purification HPLC, le DNTP modifié est caractérisé par RMN et maldi pour montrer ici est le spectre maloff du sulfamidide, analogue DUTP modifié. L’adduit au sodium peut être vu à une surcharge de masse de 712,54, et aucune trace de diphosphate n’est présente. Les spectres RMN P 31 et RMN des protons sont cruciaux pour évaluer la pureté du dps modifié.

Étant donné que la présence de colorants indésirables et de monophosphates donne des signaux distinctifs illustrés, voici le résultat des réactions d’extension primaires avec le DUTP modifié par la transproline, le DATP modifié par l’histamine et le DCTP modifié par l’acide valérique utilisés soit comme modifications isolées en tant que combinaisons de deux DN dps modifiés, soit ensemble, avec un DGTP naturel unique. Enfin, des réactions de polymérisation représentatives médiées par le TDT avec différents analogues modifiés de DUTP ont été analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant. Dans ce contexte, le DUTP modifié à la proline cis et le DUTP modifié aux peptides sont les meilleurs substrats pour le TDT.

Étant donné que l’efficacité des résidus est comparable ou supérieure à celle du DTTP naturel, le DUTP modifié à l’urée est un substrat plutôt médiocre dans ce contexte. Comme des oligonucléotides de plus grande taille peuvent être observés une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une semaine si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de garder à l’esprit que les phosphates cytriques nucléaires sont des éléments constitutifs activés par la nature et qu’il faut donc faire attention lors de leur manipulation après leur création.

Les chercheurs dans le domaine des acides nucléiques utilisent cette méthode pour explorer des sélections combinatoires afin de générer des acides nucléiques modifiés et des acides nucléiques catalytiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de synthétiser et de caractériser les phosphates modifiés à l’aide de la procédure en quatre étapes, suivie d’une purification HPLC en phase inverse et de réactions d’extension primaires. Certains détails expérimentaux que l’on ne trouve normalement pas dans les coupes expérimentales deviendront apparents.

Cette méthode peut être utilisée en combinaison avec d’autres techniques telles que la PCR pour répondre à des questions supplémentaires. En effet, il peut être utilisé pour évaluer la compatibilité des triphosphates modifiés avec les méthodes de sélection in VIO.