Name: Un In vivo Approche de réticulation pour isoler les complexes protéiques De Drosophila Embryons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-23T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Découvrez une méthode de réticulation in vivo pour isoler les complexes protéiques natifs d'embryons de Drosophila. Cette technique stabilise les interactions protéiques transitoires cruciales pour les fonctions cellulaires.

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Nous remercions Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler et Jimiao Zheng pour leur aide technique à cette étude. Ce travail a été soutenu par la NSF Career Grant MCB-1054962 ALA

1. Préparation grandes jus de pomme-agar plaques <ol><li> Pour faire 4 assiettes, ajouter 375 ml H 2 O, 11,25 g d&#39;agar mouche et une barre d&#39;agitation dans un ballon de 1000 ml. C&#39;est Mix A. autoclave Mix A avec le couvercle du ballon sans serrer plafonné sur un cycle de 30 min-stérilisation pour les produits liquides. </li><li> Ajouter 125 ml de jus de pomme, 12,5 g de sucre de table et d&#39;un barreau à un bécher de 500 ml. Ce mélange est B. chaleur Mix B sur une plate-forme chauffée sous agitation et maintenir la température à environ 70 ° C jusqu&#39;à ce que le passage à l&#39;autoclave de mélange A est terminée. </li><li> À la fin de Mix Un autoclave, transférer Mix B à A. Mélanger Gardez en remuant doucement le mélange combiné et le laisser refroidir pendant 15 minutes. Évitez de trop le refroidissement et la solidification de la gélose entraîné avant l&#39;ajout d&#39;agents de conservation. </li><li> Faire 10% (poids / volume) méthyle solution 4-hydroxybenzoate dans l&#39;éthanol. Ceci agira comme un agent de conservation. Ajouter 3,75 ml de la solution dans le mélange jus-agar de pomme ci-dessus. Gardez en remuant pour another 5 min. </li><li> Verser 125 mélange de jus de pomme-agar ml avec conservateur dans chaque 300 cm 2 en plastique ou une plaque de polystyrène. Laisser refroidir à température ambiante et se solidifier. Éviter la formation de bulles d&#39;air tout en versant. Remarque: Les plaques jus-agar pomme sont prêts à utiliser immédiatement. Couvrir les plaques inutilisées avec enveloppements claires et stocker à 4 ° C pendant jusqu&#39;à une semaine. </li></ol> 2. Drosophila collecte d&#39;embryons et le traitement pré-réticulation <ol><li> Chargez une cage de population à environ 40.000 à 50.000 mouches partir desquels les embryons seront collectées. </li><li> Faire deux plaques contenant chacune 125 ml de farine de maïs mélasse standard intermédiaire 12 et saupoudrer environ 4 g de levure de boulanger séchée sur chaque plaque. Placez ces plaques dans la cage de la population dans un incubateur à 25 ° pendant 48 heures pour engraisser les mouches. </li><li> Chauffez 2 jus de pomme des plaques de gélose à 25 ° C. Saupoudrer environ 1 g de levure de boulanger séchée sur chaqueplaque. Placez les deux plaques dans la cage de la population de commencer à recueillir des embryons de 0-1 h âgé. </li><li> Retirer les plaques à la fin de la collection de 1 hr. Remplacer avec 2 nouvelles plaques si un autre cycle de collecte est nécessaire. </li><li> Ajouter suffisamment d&#39;eau pour couvrir les plaques et remettre en suspension les embryons doucement avec un pinceau fin. Verser les embryons remises en suspension à travers un tamis à deux couches faites de treillis métallique inoxydable en acier. Remarque: La couche supérieure est faite de la taille des pores moyens (850 pm) maillage qui recueille une grande partie de mouches tout en laissant passer les embryons. La couche inférieure est faite de mailles fines (75 um) qui collecte des embryons tout en laissant passer la levure et de l&#39;eau. </li><li> Utilisez le pinceau fin pour transférer les embryons collectés dans un panier de collecte faite avec un tube de 50 ml et fine maille de nylon. Rincer les embryons brièvement à l&#39;eau puis épongez la maille sur des serviettes en papier pour sécher. </li><li> Plonger les embryons dans 50% de javel remuer doucement pendant 3 min. Rincer approfondiement avec de l&#39;eau pour éliminer tout agent de blanchiment. Tamponnez la maille sur des serviettes en papier pour sécher. </li><li> Plonger les embryons dechorionated dans de l&#39;isopropanol sous agitation douce pendant 15 sec ou jusqu&#39;à ce que la répartition des bouquets multi-embryon (cela ne devrait pas prendre plus de 30 secondes). Tamponnez la maille sur des serviettes en papier pour sécher. </li><li> Plonger les embryons dans l&#39;heptane pendant 5 minutes tout en utilisant une pipette pour écouter heptane sur les embryons pour les garder remis en suspension. Tamponnez la maille sur des serviettes en papier pour sécher. </li><li> Rincer les embryons avec des flux de saline tamponnée au phosphate, pH 7,4 (PBS) contenant 0,1% de Triton X-100 (PBST) pendant 3 min. </li><li> Démonter le panier de collecte et de transfert des embryons avec le maillage à un tube de 15 ml contenant 10 ml de PBST. Retourner doucement le tube pour laver les embryons de la maille. </li><li> Retirez le filet du tube. Mettre le tube dans une position verticale et laisser les embryons se déposent au fond du tube par gravité. Remarque: Environ 100-300ul d&#39;embryons est prévu pour une collection de 1 heure d&#39;une cage. </li><li> Retirez le PBST et continuer à effectuer la réticulation immédiatement. </li></ol> 3. In vivo réticulation des embryons collectés <ol><li> Préparer 0,2% de formaldehyde dans du PBST, immédiatement avant utilisation. Ajouter 10 ml de fixateur de formaldéhyde pour les embryons et incuber à 25 ° C avec agitation douce sur un agitateur rotatif pendant 10 min. Jeter fixateur utilisé à la fin de la journée. </li><li> Stopper la réaction de réticulation <ol><li> A la fin de la réticulation, que les embryons se déposent au fond du tube. </li><li> Retirer la solution de formaldéhyde. Ajouter immédiatement 10 ml de 0,25 M de glycine dans du PBST pour arrêter la réaction de réticulation. Incuber à 25 ° C avec agitation douce sur un agitateur rotatif pendant 5 min. </li><li> Laissez les embryons se déposent au fond du tube. Retirer la solution de refroidissement. Laver les embryons avec 10 ml de PBST trois fois. </li><li> Supprimer complètement le Psolution de lavage de BST à l&#39;aide d&#39;une pipette. embryons de conserver à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li></ol> 4. Protéine préparation de l&#39;échantillon et immunoprécipitation <ol><li> Homogénéiser 500 pi embryons réticulés en utilisant un homogénéisateur Dounce dans 2 ml de tampon de lyse (0,5 M d&#39;urée, 0,01% de SDS, 2% de Triton-X 100, phénylméthanesulfonyle fluorure 2 mM [PMSF] et inhibiteur de la protéase cocktail dans PBS). Remarque: Effectuez cette et les étapes suivantes à la température ambiante, sauf indication contraire. </li><li> Transférer le lysat tubes de 1,5 ml à centrifuger et secouez-la délicatement sur une plate-forme tournante pendant 15 min à assurer une lyse approfondie. Centrifuger le lysat à 16 000 x g pendant 5 minutes pour sédimenter les débris cellulaires. Enregistrez le surnageant dans un tube de 15 ml propre. </li><li> Ajouter 40 ul de billes d&#39;agarose anti-HA suspension pour le surnageant et laisser incuber sur une plateforme rotative pendant 2,5 heures. </li><li> Sédimenter les billes par centrifugation à 2500 xg pendant 5 min. Retirer le surnageant mais laisser approximately 250 pi dans le tube. Remettre en suspension les perles dans le surnageant restant et le transférer à une colonne de centrifugation de 1,5 ml avec un filtre à pores de 10 um. </li><li> Centrifuger la colonne de centrifugation à 12 000 g pendant 10 sec et jetez l&#39;écoulement à travers. </li><li> Laver les billes en ajoutant 200 ul de tampon de lavage (0,1 M de glycine, NaCl 1 M, 1% d&#39;IGEPAL CA-630, 0,1% de Tween-20 dans du PBS). Centrifuger la colonne à 12 000 g pendant 10 sec et jeter le lavage. Répétez le lavage deux fois de plus. </li><li> Ajouter 40 ul de tampon d&#39;élution (2 mg / ml HA-peptide dans du PBS) pour les billes et incuber à 37 ° C pendant 15 minutes avec agitation douce toutes les 5 min. Centrifuger la colonne à 12 000 g pendant 10 sec et recueillir l&#39;éluat. </li><li> Confirmer l&#39;élution du complexe par analyse Western-blot en utilisant l&#39;anticorps anti-HA 13. </li></ol>

<ol><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome research. 22, 1813-1831 (2012).</li>
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<li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694(2006).</li>
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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Le formaldehyde a été couramment utilisé comme réactif de réticulation pour identifier la protéine-protéine et des interactions protéine-acide nucléique. Sa bonne solubilité et la perméabilité membranaire de la cellule, ainsi que la compatibilité avec les procédés de spectrométrie de masse en aval, de faire un formaldéhyde agent candidat idéal pour les applications de reticulation intracellulaires 3,15-17. En particulier, il a été utilisé avec succès pour identifier les ARNm associés à Vasa, un ARN hélicase d...

Isolement des assemblages de protéines unités multiples et complexes d&#39;ADN-ou d&#39;ARN-protéine est effectuée pour identifier des complexes de protéines, des loci génomiques reconnu par des protéines de régulation se liant à l&#39;ADN ou des cibles d&#39;ARN des protéines de liaison d&#39;ARN. Différents procédés permettent l&#39;identification de l&#39;ensemble du génome d&#39;ADN des sites reconnus par des facteurs de transcription ou des protéines de la chromatine (ChIP-seq) 1 et les cibles d&#39;ARN associés à une protéine de liaison à l&#39;ARN donné (CLIP-seq) 2. Les bibliothèques d&#39;ADNc de l&#39;ARN dérivé ou de cibles d&#39;ADN sont ensuite profondément séquences. Ces procédés utilisent des produits chimiques ou de réticulation pour stabiliser les complexes suivie par une immunoprécipitation (IP) avec un anticorps dirigé contre un composant protéique du complexe étudié induite par les UV. Au cours du développement d&#39;un organisme, de nombreux complexes protéiques forment de manière transitoire. Par conséquent, il est essentiel d&#39;analyser la composition et le fonctionnement de ces complexes in vivo pour comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent developpement. Une telle analyse in vivo serait supérieure à l&#39;approche in vitro car il est pratiquement impossible de reproduire les concentrations indigènes des éléments en interaction et de l&#39;environnement biochimique cellulaire in vitro. Ici, nous démontrons une approche in vivo que nous utilisons avec succès pour isoler grands complexes de protéines à partir d&#39;embryons de drosophile. Dans ce procédé, les complexes de protéines dans les embryons vivants sont réticulés avec une faible concentration en formaldéhyde et ensuite complexes de protéines d&#39;intérêt sont isolés par IP avec un anticorps dirigé contre un composant connu des complexes, suivie d&#39;une purification sur gel des complexes et de l&#39;analyse par spectrométrie de masse à identifier les composants complexes inconnus. Etant donné que le formaldéhyde est capable de traverser la membrane cellulaire et a une gamme de réticulation de 02.03 à 02.07 Å 3, des complexes de protéines peuvent être réticulés in vivo et les composants complexes sont susceptibles d&#39;être proches les unes des autres. Dans cet article, nousdécrire ce procédé en utilisant l&#39;isolement de Tudor (TUD) complexe de protéines, par exemple. Tud est une protéine de la lignée germinale qui est essentiel pour le développement de la lignée germinale 4-7. Cette protéine contient 11 domaines TUD connus pour interagir avec les arginines ou lysines méthylées d&#39;autres polypeptides 8-10. Auparavant, nous avons généré une ligne drosophile transgénique qui exprime HA-étiqueté Tud fonctionnelle 5 et donc, un anticorps spécifique anti-HA est utilisé pour tirer vers le bas complexe Tud après réticulation. En plus des réticulations protéine-protéine, le formaldéhyde peut générer des réticulations d&#39;acide nucléique-protéine et est utilisé dans des expériences de ChIP-seq. En outre, chez la drosophile, in vivo de réticulation avec le formaldéhyde a permis l&#39;identification d&#39;une cible d&#39;ARN de l&#39;ARN Vasa protéine hélicase 11. Bien que dans cet article, nous décrivons un procédé pour la reticulation in vivo et purification des complexes de protéines à partir d&#39;embryons de Drosophila, ce procédé peut être adapté à d&#39;autres organismes et les tissus.

<table><tbody><tr><td>Drosophila agar</td><td>Lab Scientific (http://www.labscientific.com/)</td><td>FLY-8020-1</td><td>Ne pas autoclaver le mélange d’eau et de gélose pendant une période prolongée car cela rendrait les plaques de jus de pomme fragiles</td></tr><tr><td>Methyl 4-hydroxybenzoate</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>H5501</td><td>Autre nom : TEGOSEPT</td></tr><tr><td>Cage de population</td><td>Flystuff ( http://www.flystuff.com/)</td><td>59-104</td><td></td></tr><tr><td>Maille fine en nylon</td><td>Flystuff (http://www.flystuff.com/)</td><td>57-102</td><td>Lors de la fabrication du panier de collecte, coupez la maille légèrement plus grande que l’ouverture du capuchon du tube de faucon pour assurer une étanchéité</td></tr><tr><td>Homogénéisateur de dénonçage</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>D8938-1SET</td><td>Réfrigérez l’homogénéisateur sur de la glace et prérincez-le avec un tampon de lyse à froid avant utilisation pour éviter la dégradation des protéines</td></tr><tr><td>.</td><td>Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)</td><td>4693132001</td><td>PBS pourrait être utilisé pour préparer une solution mère concentrée d’inhibiteur de protéase</td></tr><tr><td>Billes d’agarose anti-HA</td><td>MBL international (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>Le kit comprend également des colonnes de peptide HA et</td></tr><tr><td>de spin Peptide</td><td>HA MBL international (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>Préparer à 2 mg/ml avec PBS&nbsp ;</td></tr><tr><td>Colonne de centrifugation</td><td>MBL international (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td> Les <td>colonnes de centrifugation sont incluses dans le kit</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm ;)</td><td></td><td></td>BP26324</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm ;)</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm ;)</td><td>H350-4</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)</td><td>AM9625</td><td>Diluer de 10X à 1X avec de l’eau nanopure avant</td></tr><tr><td>utilisation Formaldéhyde</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm ;)</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>BioRad (www.bio-rad.com/&lrm ;)</td><td>161-0724</td><td></td></tr><tr><td>FDS</td><td>BioRad (www.bio-rad.com/&lrm ;)</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Urée</td><td>BioRad (www.bio-rad.com/&lrm ;)</td><td>161-0730</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de phénylméthanesulfonyle</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>P7626-1G</td><td>Préparer une solution mère de 200 mM dans de l’isopropanol puis diluer à une concentration de travail de 2 mM dans un tampon de lyse</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>I8896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm ;)</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 15 ml</td><td>USA Scientific (http://www.usascientific.com/)</td><td>1475-0511</td><td></td></tr><tr><td>Eau de Javel</td><td>de marque</td><td></td> Clorox <td>Diluer avec un volume égal d’eau nanopure pour obtenir 50 % d’eau de Javel</td></tr><tr><td>Tubes de 50 ml</td><td>BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Tamis de couche supérieure</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm ;)</td><td>04-884-1AK</td><td></td></tr><tr><td>Tamis de couche inférieure</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm ;)</td><td>Référence 04-884-1BA</td><td></td></tr></tbody></table>

un in vivo approche de réticulation pour isoler les complexes protéiques de drosophila embryons

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

De nombreux processus cellulaires sont contrôlées par des complexes protéiques unités multiples. Souvent, ces complexes forment transitoire et nécessitent environnement natif à assembler. Par conséquent, afin d&#39;identifier ces complexes de protéines fonctionnelles, il est important de les stabiliser in vivo avant la lyse des cellules et la purification ultérieure. Ici, nous décrivons une méthode utilisée pour isoler de grands complexes de protéines de bonne foi à partir d&#39;embryons de Drosophila. Cette méthode est basée sur l&#39;embryon perméabilisation et la stabilisation des complexes à l&#39;intérieur des embryons par reticulation in vivo en utilisant une faible concentration en formaldéhyde, qui peut facilement traverser la membrane cellulaire. Par la suite, le complexe de protéine d&#39;intérêt est immunopurifié suivie d&#39;une purification sur gel et analysés par spectrométrie de masse. Nous illustrons cette méthode en utilisant la purification d&#39;un complexe protéique Tudor, qui est essentielle pour le développement de la lignée germinale. Tudor est une grosse protéine, qui contient plusieurs domaines Tudor - petitmodules qui interagissent avec arginines méthylées ou des lysines des protéines cibles. Cette méthode peut être adaptée pour l&#39;isolement des complexes de protéines natives provenant d&#39;organismes différents et des tissus.

L&#39;efficacité de la réticulation et la purification réussie du complexe protéique réticulé TUD ont été analysés par SDS-PAGE sur un 3% - 7% de gel de l&#39;étape (illustré sur la figure 1), suivie par transfert de Western (Figure 2). Le but de l&#39;utilisation de 3% - gel de l&#39;étape 7% est basé sur la séparation effective du complexe protéique réticulé Tud de la protéine restante Tud non réticulé et la concentration du complexe. Sous nos vivo dan...

Complexes de protéines multi-composants jouent un rôle crucial lors de la fonction cellulaire et le développement. Ici, nous décrivons une méthode utilisée pour isoler des complexes de protéines natives à partir d&#39;embryons de Drosophila après réticulation in vivo suivie d&#39;une purification des complexes réticulés pour analyse subséquente structure-fonction.

Un In vivo Approche de réticulation pour isoler les complexes protéiques De Drosophila Embryons

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'obtenir des complexes protéiques à partir d'embryons vivants de drosophile en utilisant une approche de réticulation in vivo. Cela est réalisé en chargeant d'abord des milliers de mouches dans une cage de population et en collectant des embryons précoces. Ensuite, les protéines sont réticulées in vivo avec du formaldéhyde, ce qui stabilise leurs complexes protéiques internes.Ensuite, des extraits protéiques sont préparés à partir des embryons réticulés afin que les complexes protéiques puissent être immunoprécipités. Les résultats permettent d'identifier les complexes protéiques isolés par analyse de transfert Western. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'isolement traditionnel de complexes protéiques par des approches in vitro, est que cette approche in vivo nous permet de capturer des interactions protéine-protéine transitoires mais fonctionnellement significatives, qui pourraient ne pas être détectées par des méthodes traditionnelles in vitro.La démonstration de la technique sera assurée par le Dr Min Gao, postdoctorant de mon laboratoire. Mélangez d'abord de l'eau et de l'aga

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Nous décrivons un protocole simplifié pour générer des «filets» des préparations d'embryons de drosophile de génotypes spécifiques. Ce protocole permet l'exécution efficace d'une variété d'écrans génétique. Il permet également une excellente visualisation des structures dans l'embryon en retard.

Dissection en direct de Drosophile Embryons: méthodes simplifiées pour le dépistage de collections de mutants par immunofluorescence

La cellule perméables réticulant DSP [dithiobis (succinimidyl propionate)] stabilise les interactions transitoires et...

Isolement du labiles complexes multi-protéiques par des In vivo Contrôlée Cellulaire réticulation et chromatographie d&#39;affinité immuno-magnétiques

Nous décrivons une méthode d'organites séparés par la densité dans la...

In vivo d&#39;embryons de drosophile Centrifugation

Le kinétochore est où le SAC lance son signal de contrôle de la ségrégation mitotique des chromatides sœurs. Une méthode est décrite pour visualiser le recrutement et le roulement de l'une des protéines du kinétochore et sa coordination avec le mouvement des chromosomes dans...

Etudier Checkpoint mitotique en illustrant le comportement dynamique des protéines Kinetochore et Motion chromosomique chez Vivre<em&gt; Drosophila</em&gt; Les embryons syncytial

Ce protocole montre comment Proximité Ligation Assay peut être utilisé pour détecter des interactions protéine-protéine in situ à la jonction des larves de Drosophila neuromusculaire. Avec cette technique, disques grande et Hu-li shao de tai sont présentés pour former un complexe dans la région post-synaptique, une association préalablement identifiés par co-immunoprécipitation.

Détection de In Situ complexes protéine-protéine à la Drosophila Larvaire jonction neuromusculaire Utilisation Proximité ligature Assay

Le but de ce protocole est de fournir une approche simple et peu coûteuse pour collecter des embryons de Drosophila à l'échelle moyenne (0,5-1 g) et préparer des extraits de protéines qui peuvent être utilisés dans des applications protéomiques en aval, telles que la purification par affinité, la spectrométrie de masse (AP-MS ).

Préparation à moyen terme de<em&gt; Drosophila</em&gt; Extraits d&#39;embryons pour les expériences protéomiques

Ici, nous illustrons comment microscopie photoactivation localisation seule molécule peut être effectuée sur le terminal de nerf moteur d’un live de Drosophila melanogaster troisième stade larve.

In Vivo Simple-molécule suivi du terminal de nerf moteur présynaptique Drosophila

Ce protocole démontre l’utilisation de l’essai de ligation de proximité pour sonder pour des interactions protéine-protéine in situ dans la lignée germinale de C. elegans.

In Situ Détection de l’assemblage du complexe Ribonucleoprotéine dans le C. elegans Germline à l’aide de Proximity Ligation Assay

Présenté ici est un protocole de microinject et simultanément l’image de plusieurs embryons de Drosophila au cours du développement embryonnaire à l’aide d’une plaque à base, imageur à haute teneur.

Préparation et microinjection d’embryons de drosophile pour la microscopie cellulaire vivante effectuée à l’aide d’un analyseur automatisé à contenu élevé

Au début de l’embryon de drosophile , de nombreux organites sont mobiles. En principe, ils peuvent être photographiés en direct via des sondes fluorescentes spécifiques, mais la coquille d’œuf empêche l’application directe sur l’embryon. Ce protocole décrit comment introduire de telles sondes par microinjection, puis analyser le mouvement des organites en vrac via la vélocimétrie d’image de particules.

Visualisation du trafic dépendant du cytosquelette d’organites contenant des lipides dans des embryons de drosophiles

Découvrez une méthode de réticulation in vivo pour isoler les complexes protéiques natifs d'embryons de Drosophila. Cette technique stabilise les interactions protéiques transitoires cruciales pour les fonctions cellulaires.

Un In vivo Approche de réticulation pour isoler les complexes protéiques De Drosophila Embryons

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