Un In vivo Approche de réticulation pour isoler les complexes protéiques De Drosophila Embryons
23 avril 2014
Complexes de protéines multi-composants jouent un rôle crucial lors de la fonction cellulaire et le développement. Ici, nous décrivons une méthode utilisée pour isoler des complexes de protéines natives à partir d'embryons de Drosophila après réticulation in vivo suivie d'une purification des complexes réticulés pour analyse subséquente structure-fonction.
L'objectif général de l'expérience suivante est d'obtenir des complexes protéiques à partir d'embryons vivants de drosophile en utilisant une approche de réticulation in vivo. Cela est réalisé en chargeant d'abord des milliers de mouches dans une cage de population et en collectant des embryons précoces. Ensuite, les protéines sont réticulées in vivo avec du formaldéhyde, ce qui stabilise leurs complexes protéiques internes.
Ensuite, des extraits protéiques sont préparés à partir des embryons réticulés afin que les complexes protéiques puissent être immunoprécipités. Les résultats permettent d'identifier les complexes protéiques isolés par analyse de transfert Western. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'isolement traditionnel de complexes protéiques par des approches in vitro, est que cette approche in vivo nous permet de capturer des interactions protéine-protéine transitoires mais fonctionnellement significatives, qui pourraient ne pas être détectées par des méthodes traditionnelles in vitro.
La démonstration de la technique sera assurée par le Dr Min Gao, postdoctorant de mon laboratoire. Mélangez d'abord de l'eau et de l'agar pour mouches à l'aide d'un barreau aimanté. Stérilisez ce mélange pendant le cycle d'autoclavage.
Mélanger le saccharose dans le jus de pomme et chauffer à 70 degrés Celsius sur une plaque. Ensuite, combiner les mélanges et les laisser refroidir pendant 15 minutes avant que l'agar ne durcisse. Préparer du méthyl-4-hydroxybenzoate frais dans l'éthanol.
Il s'agit du conservateur. Ajoutez-le au mélange en cours de solidification et mélangez pendant cinq minutes. Versez ensuite le mélange dans des plaques en plastique ou en polystyrène de 300 centimètres carrés sans former de bulles.
Conservez les boîtes à quatre degrés Celsius et utilisez-les dans la semaine. Préparez une cage de population contenant entre 40 000 et 50 000 mouches afin de collecter les embryons. Fixez deux boîtes fraîches remplies de milieu au mélasse et farine de maïs, avec environ quatre grammes de levure de boulanger répartis à la surface, sur la cage de population.
Laisser les mouches vivre sur ces boîtes pendant 48 heures à 25 degrés Celsius. Après deux jours, saupoudrer environ un gramme de levure sur deux boîtes de gélose au jus de pomme, puis remplacer les boîtes dans la cage de population par celles-ci. Après une heure, remplacer à nouveau les boîtes dans la cage par deux autres du même type.
Les deux plaques de collecte utilisées par les mouches pendant une heure seront chargées d'embryons. Suspendre les embryons dans l'eau sur la plaque et utiliser un pinceau pour les détacher. Ensuite, les verser à travers un tamis à deux couches.
La couche supérieure est un treillis métallique en acier de 850 microns, et la couche inférieure est un treillis métallique en acier de 75 microns. Les embryons s'accumuleront sur le treillis plus fin, séparés des débris grossiers à l'aide d'un pinceau. Transférez les embryons vers un panier en nylon fin fabriqué à partir du bouchon d'un tube conique de 50 millilitres.
Rincez les embryons à l'eau et séchez-les dans la passoire contre une serviette en papier. Ensuite, immergez les embryons dans une solution d'eau de Javel à 50 % pendant trois minutes. Agitez-les dans l'eau de Javel, puis rincez-les soigneusement à l'eau et tamponnez-les pour les sécher.
Les embryons sont ensuite immergés dans de l'isopropanol pendant environ 15 secondes. En agitant doucement, cela disperse les agrégats d'embryons, et cela ne devrait pas prendre plus de 30 secondes. Séchez délicatement les embryons en les tamponnant, puis transférez-les dans une solution d'heptane pendant cinq minutes.
Pipeter fréquemment l'heptane au-dessus des embryons pour éviter qu'ils n'agglomèrent, éponger les embryons pour les sécher puis les rincer dans du PBST. Après avoir rincé les embryons pendant trois minutes, les transférer sur la membrane vers un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de PBST. Retirer la membrane en laissant les embryons en solution et prélever entre 100 et 300 microlitres d'embryons.
Déposer au fond, aspirer le PBST et procéder immédiatement à la réticulation des embryons. Ajouter d'abord 10 millilitres de formaldéhyde 0,2 % fraîchement préparé dans du PBST aux embryons. Incuber avec agitation douce à 25 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Après 10 minutes de réaction, laisser les embryons décanter et retirer la solution. Remplacer ensuite rapidement la solution par 10 millilitres de glycine à 0,25 molaire dans du PBST pour arrêter la réaction. Placer le tube en agitation pendant cinq minutes supplémentaires. Après l'arrêt de la réaction, retirer la solution et rincer les embryons trois fois avec 10 millilitres de PBST pour chaque rinçage.
Éliminer le reste de PBST par aspiration à la pipette et conserver les embryons à moins 80 degrés Celsius jusqu'à leur utilisation. À l'aide d'un homogénéisateur à piston et de deux millilitres de tampon de lyse, homogénéiser 500 microlitres d'embryons réticulés. Cette étape nécessite environ 15 mouvements avec un piston ajusté.
Transférez le lysat dans un tube de microcentrifugeuse et placez-le sur un agitateur doux pendant 15 minutes. Ensuite, centrifugez le lysat à 16 000 ×g pendant cinq minutes. Transférez le surnageant dans un tube de 15 millilitres.
Le culot peut être éliminé. Ajoutez maintenant au surnageant 40 microlitres de la suspension d'anti ha agros beet. Agitez doucement pendant environ 2,5 heures après la fin de la conjugaison des billes.
Centrifuger les billes à 2 500 G pendant cinq minutes. Laisser environ 250 microlitres de surnageant dans le tube et resuspendre les billes dedans. Transférer les billes en suspension sur un filtre de 10 microns dans une colonne de centrifugation.
Éliminer la solution par une courte centrifugation de dix secondes à 12 000 G. Laver les billes dans la colonne avec 200 microlitres de tampon de lavage et effectuer une nouvelle centrifugation. Répéter cette opération un total de trois fois. Ensuite, ajouter 40 microlitres de tampon d'élution aux billes et les incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.
Agitez doucement le tube toutes les cinq minutes pendant cette période afin de recueillir l'ouit. Faites une nouvelle centrifugation de la colonne à 12 000 ×g pendant 10 secondes. L'efficacité du réticulation et de la purification des complexes protéiques réticulés a été analysée par électrophorèse SDS-PAGE sur un gel en gradient de 3 à 7 %, suivie d'un immunotransfert. Des embryons exprimant une étiquette HA et la protéine GFP ont été utilisés pour surveiller l'ampleur de la réticulation et tester différentes concentrations de formaldéhyde dans le protocole.
La majeure partie de la GFP dans les embryons traités n'a pas subi de réticulation, donc ceci ne se produit pas. Un complexe réticulé aléatoirement a été comparé au témoin non réticulé. Deux protéines qui n'ont pas réticulé apparaissent sous forme d'une bande de 285 kilodaltons qui migre librement.
Le deux réticulé est plus lourd et migre moins dans le lysat protéique brut. Environ la moitié de la protéine deux était réticulée avec son interlocuteur in vivo. Les partenaires en interaction élucidés avec le peptide HA par comparaison présentaient à la fois le complexe et la protéine tube libre dans la fraction d'élution, après lavage des billes.
Une fois le SDS éliminé, on obtient principalement des tubes libres avec un complexe tubulaire minimal. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme la spectrométrie de masse, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant des méthodes telles que l'identification des composants protéiques présents dans les complexes isolés.
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Aperçu
Cette étude présente une méthode d'isolement de complexes protéiques natifs à partir d'embryons de Drosophila en utilisant une approche de réticulation in vivo. La technique permet de capturer des interactions protéiques transitoires essentielles aux fonctions cellulaires.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Biochimie des protéines
- Biologie du développement
Contexte
- Les complexes protéiques multicomposants sont essentiels à diverses fonctions cellulaires.
- Les méthodes traditionnelles peuvent manquer les interactions protéiques transitoires.
- La réticulation in vivo offre un moyen de stabiliser ces interactions.
- Les embryons de Drosophila servent de modèle pour l'étude des complexes protéiques.
Objectif de l'étude
- Isoler des complexes protéiques à partir d'embryons vivants de Drosophila.
- Utiliser une réticulation in vivo pour capturer les interactions transitoires.
- Analyser la structure et la fonction de ces complexes protéiques.
Méthodes utilisées
- Charger des mouches dans une cage de population pour collecter des embryons précoces.
- Réticuler les protéines in vivo avec du formaldéhyde.
- Préparer des extraits protéiques à partir d'embryons réticulés.
- Immunoprécipiter les complexes protéiques pour analyse.
Résultats principaux
- Identification de complexes protéiques isolés par analyse par immunotransfert.
- Démonstration de l'efficacité du réticulation in vivo.
- Capture d'interactions protéine-protéine transitoires.
- La comparaison avec les méthodes traditionnelles in vitro met en évidence des avantages.
Conclusions
- L'approche in vivo est supérieure pour l'étude des interactions dynamiques entre protéines.
- Cette méthode peut améliorer la compréhension des fonctions des complexes protéiques.
- Des études futures pourraient s'appuyer sur cette technique pour d'autres organismes.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La capture des interactions transitoires entre protéines dans des environnements cellulaires natifs demeure un défi majeur dans la validation des cibles et l'atténuation des risques mécanistiques. Cette approche de réticulation in vivo permet la stabilisation de complexes labiles directement au sein d'embryons de Drosophila, préservant ainsi des interactions physiologiquement pertinentes qui pourraient être perdues lors d'une lyse conventionnelle. La méthode soutient les efforts de découverte précoce en fournissant une représentation plus précise de la composition des complexes endogènes, améliorant par là-même la fiabilité prédictive de l'évaluation des cibles en aval.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en stabilisant des complexes protéiques transitoires pour une analyse fonctionnelle.
- Valeur opérationnelle : Réduit les faux négatifs dans la validation des cibles en capturant des interactions manquées in vitro.
- Valeur scientifique : Soutient la détection biologique des risques grâce à la préservation de l'architecture native des complexes dans un système modèle pertinent pour la maladie.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés, adaptés à la standardisation des tests et aux essais de reproductibilité.
- Valeur opérationnelle : Génère des résultats quantitatifs par immunoprécipitation et spectrométrie de masse pour une évaluation fiable des composés.
- Valeur scientifique : Améliore la préparation au criblage en fournissant des lectures d'interaction avec la cible proches de l'état natif.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Offre des informations pertinentes sur les systèmes liés aux maladies en isolant des complexes à partir d'embryons en développement, un modèle pour des processus cellulaires conservés.
- Valeur opérationnelle : Assure la continuité du stade de découverte à la validation préclinique en maintenant l'intégrité des complexes.
- Valeur scientifique : Facilite la réduction mécanistique des risques en reliant l'engagement de la cible à des résultats fonctionnels dans le développement de la lignée germinale.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du test d'hypothèses sur une cible à l'identification d'un composé précurseur, en particulier lorsque des interactions transitoires influencent l'adéquation de la cible. Elle complète le criblage phénotypique en fournissant un contexte mécanistique aux phénotypes observés.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies en isolant des complexes natifs dans des conditions proches des conditions physiologiques.
- Écrans : Permet la préparation d'essais grâce à l'isolement reproductible de complexes stabilisés par réticulation.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives par immunotransfert (Western blot) et spectrométrie de masse afin de comparer la composition des complexes selon différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en révélant des réseaux d'interactions conservés dans un modèle génétiquement manipulable.
- Réutilisation en milieu professionnel : Fonctionne comme une plateforme réutilisable pour l'isolement de complexes dans divers tissus et organismes, après adaptation.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en réduisant l'ambiguïté mécanistique dans les études d'engagement des cibles.
- Valeur opérationnelle : Favorise la standardisation et la reproductibilité grâce à des étapes définies de réticulation et d'arrêt de réaction.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions de poursuite ou d'abandon en révélant des interactions transitoires pouvant indiquer une pertinence fonctionnelle.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque en se basant sur la stabilité des complexes natifs et la force des interactions.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des embryons, la chimie de réticulation et les techniques d'immunoprécipitation.
- Dépend de l'accès à du matériel de homogénéisation, de centrifugation et de filtration pour la préparation des lysats.
- Exige une standardisation entre équipes concernant la concentration de formaldéhyde, le moment de l'arrêt de la réaction et la sévérité des lavages.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l'application de la méthode à des tissus non embryonnaires ou à d'autres systèmes modèles.
- Comprend des limitations pratiques telles qu'une réticulation excessive pouvant survenir à des concentrations élevées de formaldéhyde, ce qui peut masquer les épitopes ou entraver l'élution.
